范文一:生化设计性实验
编号 :
安徽中医学院自然科学研究项目
申 请 书
项目名称:胆红素的测定及其变化与某些疾病
的关系
申 请 者:李丽勤
所在部门: 10级中医(4)班
电 话: 18256939160 申请日期: 10月 8日
安徽中医学院
二〇一一年制
填 报 说 明
一、申请书各项内容要实事求是,逐条认真填写。表达要明确、严谨,字 迹要清晰易辨。外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现的缩写词, 须注出 全称。
二、申请书用 A4纸打印或复印,于左侧装订成册。
三、报送申请书的同时,需附录入内容与申请书一致的计算机软盘。
一、 简表
二、申请者承诺 :
我保证上述填报内容的真实性。在本次项目设计中,我与本项目组成员将 严格遵守真实、公正的原则, 切实保证研究工作时间, 按计划认真完成设计研究 报告工作 , 按时报送有关材料。
申请者(签章)
2011年 11月 12日 三、 立论依据
四、研究方案
五、研究基础
六、本次研究进度和工作安排
3. 仪器设备费;
4. 实验室改装费; 5. 协作费; 6. 项目实施费。
八、科研主管意见 [1] 欧阳春晖 , 卢放根 , 吴小平 , 李俊霞 , 刘小伟 , 羊东晔 . 探究原发性旁路性高胆 红素血症 [J].中南
大学杂志 ,2008.34(12):225-227.
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范文二:生化设计性实验
实验二十九 柱层析技术分离纯化菠萝蛋白酶粗提液
一 目的 .
1 学习和理解蛋白质进一步纯化的各种柱层析技术的原理和实验技能。
2 理解和掌握葡聚糖( SephadexG- 75 )柱层析技术原理和实验操作步骤。
二 原理
凝胶层析( Gel chromatography )是利用具有一定孔径的多孔凝胶作为固定相,把分子大小不同的物质分离开来的一种层析技术,又叫凝胶过滤( Gel filtration )、分子筛层( Molecular sieve chromatography )和凝胶渗透层析( Gel permeation chromatography ) .
目前经常使用的凝胶有葡聚糖凝胶(商品名为 Sephadex )聚丙烯酰胺凝胶(生物胶、 Bio Gel P )琼脂糖凝胶( Sepharose gel )及由烷基葡聚糖与甲叉丙烯酰胺共价交联制成的 Sephacryl 等。以葡聚糖凝胶用得最多,它是α -1 , 6 葡聚糖与 1- 氯 -2 , 3- 环氧丙烷反应交联而成的 ,有不同型号的凝胶。 凝胶的吸水能力与凝胶的交联度关系密切。 G 表示交联度, 交联度大的,凝胶孔径小,吸水量少,膨胀程度小。因此,凝胶孔径的大小可以用其吸水量的大小来表示,常以 G-10 至 G-200 号码标记。 G 后面的数字是凝胶吸水量( ml/g 干胶)乘以 10 所得的值。如 G-25 即表示吸水量为 2.5ml/g 干胶。 G100 表示该颗粒 gel 实际吸水值的 10 倍。 G 值愈小,交联度愈大,因此吸水量也愈小。 Sephadex G100 吸水值大,但机械恨不能不好,较软
Sephadex G50 吸水值小,但机械性能好,能承受较大静水压。快流速。
交联度越大, G 值小,网状结构致密,颗粒内孔径越小,吸水值小,分辨率高,分级范围窄,机械性能好。 交联度越小, G 值大,网状结构疏松,颗粒内孔径越大,吸水值大,分辨率低,分级范围宽,机械性能不好。
Sephadex G10 至 Sephadex G50 通常用于分离 1.5KD-30KD 的肽或小分子蛋白质或脱盐等。 Sephadex G75 至 Sephadex G200 ,可用于分离分子量大于 5KD-800KD 的蛋白质,其吸水量大,预处理膨胀所需时间较长,膨胀度较大,因此称为软胶使它们进行柱层析冼脱时,柱床上端洗脱液的压力保持恒定。
凝胶层析原理如图 1 所示。当分子大小不同的蛋白质混合物流经以凝胶为固定相的层析柱时,比凝胶网孔大的分子不能进入网状结构,只能排阻在凝胶之外,随流动相在凝胶颗粒之间移动并最先流出柱外;比网孔小的分子能完全渗入孔内最后流出柱外;若分子量完全介于上述二者之间,则居中流出。从流出次序的不同即可达到分离纯化蛋白质的目的。
注:小颗粒(小分子量)进入 gel 的孔内扩散,流动速度慢,后冼脱;大颗粒(大分子量)不进入 gel 的孔内,滑动速度快,先洗脱。
图 1 凝胶层析原理图
三.实验材料
实验一所提的菠萝蛋白酶粗提样品
四.实验 设备 :
层析柱 (2 x 20cm) 、恒流泵、自动部分收集器、水浴箱、 751- 紫外分光光度计 五.玻璃器皿
烧杯、胶管、吸管、夹子、铁架台、收集器的指管、滴管,移液器等
六.实验试剂
1 柱层析试剂: PBS 0.1moL/L 2000mL -1000 mL pH7.8 2 测酶活试剂 :
( 1 )酪蛋白 1% ( pI5.0,pI6.0 ) 100mL 用 0.1 mol/L PBS pH7.8 配 ,40 ?水浴溶解 ; ( 2 )激活剂 100mL 半胱氨酸 - 盐酸盐 20 mmol/L ,0.35gEDTA-Na 1mmol/L 加 0.1 mol/L PBS pH7.8 至 100mL;
( 3 ) TCA (三氯乙酸) 5% 200mL
七.实验步骤
(一)凝胶的预处理
1 、凝胶(干粉)必须使用前在过量的溶剂中充分吸胀,一般多为 dH 2 O 、盐溶液或 buffer ,放置室温较长时间,使之充分吸胀。浸泡时间:根据交联度不同而异, G50 需 6 小时,注意:不要过分搅拌,以防止颗粒破碎,防止破坏胶链结构
2 、用倾泻法出去混杂的小颗粒,重复 3 到 4 次,以防止粉末等物质塞住胶孔。 3 、加热 100 ?溶胀,不同交联度,时间不同, G50 需 2 小时,可杀死细菌和霉菌,且可排除 gel 内包藏的气泡。
(二)柱的选择
1 、为了防止分离受管壁效应的影响,一般应选用内径大于 2.5cm 的柱(本实验为 2cm )或最好用直径为 23cm 的柱。
管壁效应即:在柱管中心部位组分移动较慢,而在管壁周围移动较快,因而影响分离效果。 2 、柱的长度 50 — 100cm 柱高 50cm 适用于脱盐,柱高 100cm ,蛋白质分级分离较好。一般说,柱越长,分离效果越好,但柱过长,实验时间长,且样品稀释度大,易扩散。反而效果不好。
(三)安装设备
柱子、恒流泵、自动部分收集器,并调好流速 .
(四)装柱(最重要的操作步骤)
1 、首先垂直的安装好,不能留有气泡
2 、将已溶胀的 gel 沿着玻璃棒小心的徐徐的灌入柱中,尽量一次装完,让其自然下降以免出现不均匀的凝胶带。
3 、装柱时需打开下口,并调节适当流速。
4 、注意事项
( 1 ) gel 不能太稀或太粘稠,若太稀分几次装上的凝胶床往往不均匀,过于粘稠,会吸留气泡 ( 2 ) gel 柱床必须装的十分均匀
( 3 )在任何时候不要使液面低于 gel 表面,否则水分挥发, gel 变干分离不好,且有可能混入气泡,影响液体在柱内流动。
(五)加样
1 、凝胶沉集后,调整流速,加一滤纸或尼龙滤布于 gel 面上,以防止加样是时, gel 被冲起或不平。 2 、加样量为体积的 12% ,如 100ml 3 体积,加样 12ml , 2 × 20cm 的柱体积为 62.8 ml 3 ,装柱体积 50 ml 3 ,加样 0.5-1ml 。为获得较好的分离效果,分离样品浓度较大,但也不能太浓(浓度大时,蛋白质大分子、溶液粘度也随之变大,而粘度不过大就会影响分离效果)加样量不够多,是起始区带尽量窄。
3 、用吸管取 1-1.5ml 粗蛋白溶液,小心的将样品加到凝胶床的表面滤纸上。
注意:
( 1 )加样时勿将床面 gel 冲起
( 2 )不要沿壁管加样(因为样品易从柱壁与凝胶床之间漏下)
( 3 )打开出口管,待样品恰好进入柱后,用少量 buffer 洗一下 gel 表面和接触过样品的柱壁,待完全流入床后,再加水( buffer )进行洗脱。
(六)洗脱
洗脱用的液体应与浸泡膨胀 gel 所用的液体相同,否则,由于更换溶剂, gel 体积会发生变化而影响分离效果。
洗脱用的液体有水(用于分离不带电荷的中性物质),电解质(用于分离带电基团的样品,如酸、碱、盐的溶液及 buffer ,吸附较强组分也使用水与有机溶剂的混合物,如:水 - 甲醇、水 - 乙醇、水 - 丙酮等为洗脱剂,可减低吸附,将组分洗下。
调节流速,一般为 4-5ml 每管每 6 分钟,收集 15 管
注意:
( 1 )交联度大的 gel ( G10-G50 )流速与柱压力差(操作压)成正比,与柱长成反比,与柱直径无关。 ( 2 )交联度小的 gel ( G75-G200 ),流速与直径有关。
( 3 ) G75 以上的 gel ,因吸水量较大使 gel 膨胀的时间较长,另外, G75 以上的软胶的层析床受操作压影响很大,适当操作压可增加流速,但过高会使软胶层析床压紧堵塞,从而降低流速 ( 4 )流速亦受颗粒影响
颗粒大、 v 大、洗脱峰较宽
颗粒小、 v 小、洗脱峰较窄、分离效果较好。 根据需要在不影响分离效果下,尽可能使流速不太慢。 (七) 实验检测和酶活测定
( 1 )用紫外分光光度计测各管的 OD 280 ( 2 ) OD 280 数值高的管进行酶活测定 ---- 按下表进行
试剂 对照 试管 1 TCA 3 —— 酪蛋白 1% 1 1 酶液 0 . 1 0 . 1 激活剂 0 . 9 0 . 9
37 ? 水浴 10min
TCA —— 3
静置 10~15min ,滤纸过滤 OD 275nm 酶活单位:在上述条件下 (37 ? , 酶促反应 10min) ,每 10min 增加 0.01 个光吸收值的酶量为一个酶
活力单位( U )。
总的实验流程
装柱(装柱时 , 柱内留 1-2 mL 的 水 , 倒入 Sephadex G75 ,要求 Sephadex G75 均匀,大约 30~50 分)
?
调节流速 4ml/ 管 /6 分(注意:恒流泵的转速不能太高) ?
加样 : 约 1-1.5ml
?
收集管(收集 20-25 管)
( 3 )用紫外分光光度计测各管的 OD 280
( 4 ) OD 280 数值高的管进行酶活测定 ---- 按下表进行
试剂 对照 试管 1
TCA 3 ——
酪蛋白 1% 1 1
酶液 0 . 1 0 . 1
激活剂 0 . 9 0 . 9
37 ? 水浴 10min
TCA —— 3
静置 10~15min ,滤纸过滤
OD 275nm
酶活单位:在上述条件下 (37 ? , 酶促反应 10min) ,每 10min 增加 0.01 个光吸收值的酶量为一个酶活力单位( U )。
八 实验结果
试 管 数 实验
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 结果
OD 280nm 酶活 (U) ( 5 )实验注意事项:
1 ) SephadexG- 75 装柱要均匀, 柱面 不能干水,只 需 提前一天装柱,如果装柱时间太久会使凝胶沉淀太紧,影响流速及纯化。
2 )按分离蛋白质分子量大小不同适当调整流速。
3 )柱层析实验结束后,注意清洗胶管、器皿及进行凝胶再生
八 . 实验结果分析
1 各实验组进行分析讨论,分析实验数据的可行性,再由老师进行归纳总结。 2 做好实验数据原始记录。
3 学生对该实验提出些可行性的意见。
4 思考题;
SephadexG- 70 柱层析技术的原理是什么,其操作详细过程是怎样的,应注意 哪 些事项。
5 递交实验报告。
范文三:《生化实验技术》综合设计性实验论文
《生化实验技术》综合设计性实验论文
班级组别:
学 号:
姓 名:
指 导教 师 :汪财生 谭志文 斯越秀
完 成日 期 :2014-6-26
海藻活性多糖的分离纯化
摘要:海 藻 多 糖 属 一 类 海 藻 提 取 物 , 应 用 价 值 很 高 , 如 :琼 脂 、 卡 拉 胶 、 褐 藻 酸 盐 在 工 业 上 已 长 期 使 用 。 海 藻 多 糖 作 为 药 物 和 药 物 中 间 体 有 具 有 潜 在 的 功 能 。 利用酶法去除多糖中的蛋白质并且运用酶法辅助提取多糖; 采用苯酚—硫酸法, 借助紫外分 光光度计进行对多糖含量的测定。
关键词:海藻多糖,层析,透析, Sevag 法, DEAE
1前言
多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在 60年代,人 们就发现多糖复杂的生物活性和功能。 多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同 的单糖以 α-或 β-糖苷键所组成的化合物,其分子量一般为数万甚至数百万,是构成生命活 动四大基本物质之一, 与维持生命功能密切相关。 大部分植物多糖不溶于冷水, 在热水中呈 粘液状,遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性,大量药理及临床研究 表明, 多糖类化合物是一种免疫调节剂, 它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用, 能激活免疫受体,提高机体的免疫功能, 在用于癌症的辅助治疗中,具有毒副作用小、 安全 性高、抑瘤效果好的优点。
多糖的纯化, 就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。 一般是先脱除 非多糖组分,再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有:Sevag 法、三氟 三氯乙烷法、三氯醋酸法,这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀,其中 Sevag 方法脱蛋白效果较好,它是用氯仿:戊醇或丁醇,以 4:1比例混合,加到样品中振摇,使 样品中的蛋白质变性成不溶状态,用离心法除去。
本实验采用 Sevag 法 (氯仿:正丁醇=4:1混合摇匀 ) 进行脱蛋白,用 DEAE-纤维素层 析柱进行纯化,然后合并多糖高峰部分,浓缩后透析,冻干,得多糖组分。
DEAE 纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质,比如蛋白质、 酸性多糖等,而作为大多数的中性多糖则可顺利流出,从而去粗取精、 达到分离的目的。当 然, DEAE 的细度很细,也可起到分子筛的作用,但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径 的关系很大,效果并不很好,且在大量水冲的情况下,中性多糖基本均可洗脱下来。
多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解, 产生单糖, 并迅速脱水生成醛糖衍生物, 在这 种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物,该衍生物在波长 490nm 处和一定浓度范围内, 吸光度与糖浓度呈线性关系,采用比色法对多糖含量进行测定。
DEAE 纤维素阴离子柱层板分离多糖的原理主要是其可吸附离子型物质,比如蛋白质、
酸性多糖等,而作为大多数的中性多糖则可顺利流出,从而去粗取精、 达到分离的目的。当 然, DEAE 的细度很细,也可起到分子筛的作用,但其分离效果会和柱高、洗脱溶剂、粒径 的关系很大,效果并不很好,且在大量水冲的情况下,中性多糖基本均可洗脱下来。
2材料与方法
2.1材料与设备
2.1.1实验材料
干燥的海藻粉末
2.1.2试剂及配制方法
平衡缓冲液:0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2:用小烧杯称取 1.211g Tris,用 50ml 蒸馏水溶解,用 50%盐酸调节 pH7.2,移至 1000ml 容量瓶,并定容。
洗 脱 液 :A :0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2:用 小 烧 杯 称 取 5.85g NaCl, 用 0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2溶 解 , 并 定 容 至 1000ml 。 B: 0.5mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2: 用小烧杯称取 29.25g NaCl, 用 0.01mol/L Tris-HCl,pH7.2溶解,并定容至 1000ml 。
标准葡萄糖溶液(40ug/ml):称取 0.4g 葡萄糖,用蒸馏水定容至 100ml, 准确 移取 1ml 定容后溶液于 100ml 容量瓶中,并定容,此时的溶液浓度为 40ug/ml。 6%苯酚溶液:取苯酚 100 g, 加铝片 0. 1 g和碳酸钠 0. 05 g, 常压蒸馏 , 收集 182℃馏分。 称取该馏分 (100%苯酚 )6 g, 置 100 ml容量瓶中, 加蒸馏水至刻度, 摇匀后,置棕色试剂瓶中,冰箱中冷藏储存备用。
单糖标准品,浓硫酸,氯仿,正丁醇,乙醇(95%),磷酸二氢钠等,均为分析 纯。
2.1.3实验器材
DEAE52, 旋转真空蒸发仪,摇床,离心机,层析柱 2.6cm*40cm,自动液相分 析仪,玻璃板,分析天平,恒温水浴锅,紫外分光光度计,精密 pH 计等
2.2实验方法
2.2.1粗多糖的提取
热水浸提法(水提):称取海藻粉末 10g ,采用热水浸提法(原料:水 =1:5), 在 70~80摄氏度下,浸提 1小时,重复提取四次,合并浸提液。真空旋转蒸发浓
缩一倍体积。
2.2.2脱色处理
以 1%的比例加入活性炭,搅拌均匀 15min 后过滤 。 滤液中加入 3倍体积的乙醇搅 拌,沉淀为多糖和蛋白质的混合物,即粗多糖。
2.2.3除蛋白
粗多糖溶液中加入 Sevag 法试剂(氯仿:正丁醇 =4:1),置恒温振荡器中振 荡过夜,使蛋白质充分沉淀,离心(3500r/min, 15min ),收集水层,除去蛋白 层和有机溶剂层, 水层继续重复该步骤到无游离蛋白为止, 最终得到脱蛋白的羊 栖菜多糖样品水相,真空旋转蒸发浓缩,加入 4倍体积的 95%乙醇沉淀多糖。丙 酮沉淀,冷冻干燥。
2.2.4浓缩透析
取样品 0.2g 溶于 10ml 0.01mol/L Tris-HClpH7.2中 (上样的时候用 2ml ) , 上 样 用 A :0.1mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HClpH7.2; B: 0.5mol/L NaCl,0.01mol/L Tris-HClpH7.2, C : 1.0mol/L NaCl0.01mol/L Tris-HClpH7.2,进行线性洗脱,分部收集 (4ml/管 ) , 合并多糖高峰部分,浓缩后透析,冻干。
2.2.5多糖纯度的测定
分别吸取 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4ml 的标准葡萄糖液,各以蒸馏水 补至 2.0ml ,然后加入 6%苯酚 1.0ml 及浓硫酸 5.0ml ,静置 10min ,摇匀,室温 放置 20 min后于 490nm 波长下测光密度, 以 2.0ml 水按同样显色操作作为空白。 以横坐标为糖微克数,纵坐标为光密度值,作标准曲线。
精确称取 0.1g 样品,配置成 40ug/ml的糖溶液。吸取 1ml 上述糖溶液,蒸 馏水 1ml ,然后加入 6%苯酚 1.0ml 及浓硫酸 5.0ml 。重复上述步骤 50次。静置 10min , 摇匀, 室温放置 20 min后于 490nm 波长下测光密度, 作出样品吸光值图。 再把其值代入葡萄糖标准方程中,算出含糖量。
作出葡萄糖标准曲线图, 作出样品吸光值图后, 测其吸光值。 再把其值代入 葡萄糖标准方程中,算出含糖量。
3结果与分析
(1)多糖含量测定
(2)多糖活性测定
根据标准曲线的到峰 1多糖浓度为:8.7×10-3mg/ml, 峰 2为:1.7×10-4mg/ml, 峰 3为:5.2×10-3mg/ml,峰 4为:3.2×10-2mg/ml 对第 4个峰进行海藻多糖的活性测定 S A( % ) = 1- ( A i - Aj ) / A0 ×100%=92.88% 4. 结论
对分离等到的 4种多糖进行含量的分析其中第 4个峰的多糖含量最高, DPPH 的 分析结果为 4种糖都有清除自由基的能力其中第 4个峰清除自由基的能力最强。
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定性 PCR 检测转基因大豆
摘要:“转基因食品” (GM FOOD)如今已经在世界上多个国家成了环境和健康的 中心议题。 并且, 它还在迅速分裂着大众的思想阵营:赞同它的人认为科技的进 步能大大提高我们的生活水平, 而畏惧它的人则认为科学的实践已经走得 “太快” 了。
转基因食品, 就是指科学家在实验室中, 把动植物的基因加以改变, 再制造 出具备新特征的食品种类。 许多人已经知道, 所有生物的 DNA上都写有遗传基因, 它们是建构和维持生命的化学信息。 通过修改基因, 科学家们就能够改变一个有 机体的部分或全部特征。
关键词:PCR 、转基因大豆 ,核酸
1前言
PCR 基本原理是以单链 DNA 为模板, 4种 dNTP 为底物,在模板 3’末端有引物存在 的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能使微量的模板 DNA 得到极大程度的 扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的
DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的 DNA 膜板、四 种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、 Mg2+等。反应时先将上述溶液加热,使模板 DNA 在高温下变性, 双链解开为单链状态; 然后降低溶液温度, 使合成引物在低温下与其靶序列 配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在 Taq DNA 聚合酶的催化下以 dNTP 为原料,引物沿 5’→ 3’方向延伸,形成新的 DNA 片段,该片段又可作为下一轮反 应的模板, 如此重复改变温度, 由高温变性、 低温复性和适温延伸组成一个周期, 反复循环, 使目的基因得以迅速扩增。
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide, 十六烷基三甲基溴化铵 ) ,是一种阳离子去 污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。
在高离子强度的溶液中 (>0.7mol/L NaCl) , CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是 不能沉淀核酸。
通过有机溶剂抽提, 去除蛋白, 多糖, 酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起, 以核蛋白的形式存在; 在制备核酸时, 通过研 磨破坏细胞壁和细胞膜,使核蛋白被释放出来。
2材料与方法
2.1材料与设备
2.1.1实验材料
转基因大豆,非转基因大豆标样
2.1.2试剂及配制方法
1.0.1mol/lTris-硼酸 -EDTA 缓冲液(TBE 缓冲液) , pH8.3
2.0.02mol/lEDTA,PH.8.0
3. 异戊醇(24:1, V/V)
4. 氯仿(24:1, V/V)
5.70%乙醇
6.0.6ml-20℃的异丙醇
7.TE 溶液(10mmol/L Tris,1mmol/L EDTA , pH8.0)
8.Tris-硼酸 -EDTA 缓冲液 (TBE 缓冲液) , pH8.3:称取 10.78gTris , 5.50g 硼酸,
9.0.93g EDTA-Na2溶于去离子水,定容至 1000mL 。
10. 琼脂糖: 1g 溶于 TBE 缓冲液中加热配成 100mL 。
11.0.05%溴酚蓝 -50%甘油溶液(5×Loading Buffer ) :取一定量的 0.1%溴酚 蓝水溶液,与等体积甘油混合而成。
12.0.5μg/mL溴化乙啶染色液:称取 5mg 溴化乙啶,用去离子水溶解,定容至 100mL 。 从中取 1mL , 用无离子水稀释至 100mL 。 (有毒, 戴手套, 通风柜内进行。 ) RNA 酶溶液:5ug/uL
2.1.3实验器材
紫外分光光度计、高速离心机, PCR 扩增仪,微量移液枪,水平电泳仪 材料和试剂
2.2实验方法
1. (1)大豆基因组 DNA 的提取
DNA 的提取和纯化
洗干净大豆叶片,用 75%的酒精表面消毒 3min, 用去离子水冲洗 3~4次
(2) 称取 1g 叶片放入灭过菌的研体中, 加入液氮捣碎, 迅速转入 2ml 离心管中。
(3)加入 600μl CTAB缓冲液,震荡均匀,65℃温育 30min.
加入 500ul 酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24:1),振荡均匀, 12000r/min, 离 心 15min 。
(4)吸取上清液,放入另一新管中,加入等体积的异丙醇, 12000r/min,离心 10min 。
(5)弃去上清液,加入 70%乙醇溶液洗涤, 12000r/min,离心 1min 。
(6)弃去上清液,干燥,用 50μl TE溶液溶解沉淀。
(7)加入 5μl RNA酶溶液,37℃温育 30min 。
(8)加入 400μl的 CTAB 溶液,振荡均匀。
(9)加入 250μl的三氯甲烷:异戊醇,振荡均匀, 12000r/min,离心 15min 。 (10) 吸取上清液, 放入另一个新管中, 加入 200μl的异丙醇, 12000r/min, 离 心 10min 。
(11)弃去上清液,干燥,用 50μl TE缓冲液溶解沉淀。
2. 紫外分光光度法
取 5ulDNA 样品或 4ulRNA 样品加水到 lml 。
(2)用 lml 水做空白。
(3)把样品杯放在分光光度计比色槽上。
(4)每 ul 中 DNA 或 RNA 浓度 (ug)将是 OD 值的 10倍,例如稀释后样品在 260nm 处 OD 值为 0.2,则原 DNA 或 RNA 样品浓度为 2ug /ul 。
(5)测 280nm 处 OD 值,计算二者的比率,若比率接近 2,则说明样品中核酸比较 纯。若比率小于 1.6,则说明蛋白或其它吸收此波长的杂质在其中,建议再用酚 /氯仿抽提继以乙醇沉淀以除去杂质。
DNA 分子大小测定(琼脂糖凝胶电泳)
(1)用 1×TBE电泳缓冲液 0.8%琼脂糖凝胶, 加溴化乙锭其终浓度为 0.5ug /m1。
(2)加热使琼脂糖熔化均匀,取出室温冷却至 50-60℃。
(3)取一块 5×7cm玻璃板, 置水平台上, 放一微型点样梳, 点样梳底部离玻璃平 板的距离为 0.5-1. 0mm。
(4)将凝胶小心倒在玻璃板上,待冷却后取出点样梳,保持点样孔的完好。
(5)取 DNA 样品及 DNA 标准浓度各 lul 加入 1×TBE4ul, 加入 6×上样缓冲液 lul , 混
匀。
在 0.8%琼脂糖凝胶点样孔小心点样,记录样品点样次数与点样量。
打开电源开关,电压不超过 5V /cm ,一般 40V , 30-40分钟。
(8)取出泳动后的凝胶板,翻转玻璃盖在紫外分析仪观察 DNA 区带。
(9)DNA含量的估计:比较待测 DNA 的条带与已知 DNA 的各条带的荧光密度,估 计待测 DNA 在凝胶中的含量,再估计出其浓度。
4.PCR 扩增
PCR 的扩增与分子量的测定
(1)无菌 ddH2O21.5ul
Taq 酶等 25ul
引物 1(68) 0.6ul 引物 2(69) 0.9ul
模板 DNA2ul
混匀后,离心 5000r/min×1min ,置 PCR 仪
(2) PCR 扩增的设定:
设置 PCR 扩增仪的热盖温度为 100℃预变性:94℃5min 循环:94℃变性 30s 56℃退火 30s30个循环 72℃延伸 30s
末次延伸:72℃5min4℃保存
(3)用琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物
操作要点:
PCR 过程中,应预防 DNA 污染;
用无菌水配制所有溶液;
塑料用品用 0.5MNaOH 浸泡 10分钟;。
PCR 反应条件
扩增目的基因 预变性 循环 (30个循环 ) 末次延伸
Lectin 94℃ ,1min 94℃ ,30s 72℃ ,5min
54℃ ,40s
72℃ ,1min
CaMV 35S 94℃ ,3min 94℃ ,30s 72℃ ,7min
54℃ ,1min
72℃ ,30s
3结果与分析
测定 DNA 含量及纯度
为防止实验偶然性造成实验误差,我们小组做了 3组实验,其中一组的样品在 各波长下的吸光度如下:
基因组 DNA 的提取和纯化电泳图分析:
通过测量各个吸光度下样品的波长, A260/A280=1.945第二份和第三份样品各为 1.927和 1.993,比值大于 1.8(DNA )
A230是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度,较纯净的核酸 A260/A230的比值大于 2.0 ,但实验样品一测得 A260/A230=0.775,样品中可能 存在一些污染物,如碳水化合物、多肽、苯酚等,样品二较为理想
A260/A230=1.829,样品三是 1.893。
在核酸提取出来跑电泳时, 如上图所示, 只出现了三个样品的条带, 每个样品各 跑了两条, 其中第三份样品的第一个条带途中有明显的拖带现象说明有一部分是 RNA 。有杂蛋白残留,且 DNA 也发生了降解。可能是由于加入三氯甲烷 -Tris 饱 和酚后, 混匀不够充分肌源离心因而蛋白质没有完全溶于酚中, 造成蛋白质残留。 提取过程中 DNA 降解了, 因为不可能将 RNA 完全去除, 和在提取时不可避免的将
DNA 打断为更小,所以肯定存在一条较长的拖尾,有些 RNA 去除不好的还会在比 较小的位置存在一条带,那是没有除尽的 RNA 。拖尾的存在和你的基因组 DNA 提 取的好坏有直接的关系,和跑胶的浓度, EB 的染色时间强度也有很大的关系。
其中 marker 没跑出来可能是因为 marker 所在胶带的问题,也可能是在滴加 marker 的时候加的 marker 量太少导致跑胶不明显;也有可能是加 marker 时加 在了胶的底部,没跑出来。
在上图的胶中可以很明显的看出胶带距离其实位置较近, 我们小组参考了其他组 的实验结果, 有一个小组的实验测得的 DNA 分子量高达 241kd , 在不考虑 marker 跑胶情况下, 我们小组 DNA 样品可能没有跑开, 这是由于跑胶的时间过短或者交 的浓度过高造成的。
我们小组在第一部 DNA 提取时失败了 3次,由于时间关系, PCR 扩增和之后 的电泳都没来得及做完, 因此没有最后的实验数据, 实在是有点小遗憾, 不过对 于最后的两部分实验具体操作我们都有了解并请教过老师和同学。通过此次实 验,我们发现在做实验的时候我们小组还不够细心,在实验安排上也有待改进。 如果有足够时间,相信我们一定能够测得准确的实验数据。
参考文献:
[1]James W S ,Detection of new or modified proteins in novel foods derived from GMO-future nevelopment and app lication of DNA analytical methods for the detection of GMOs in Food Food Control,1999,10:391-399.
[2]Meyer G .Development and app lication of DNA analytical methods for the detection of GMOs in Food Food Control,1999,10:391-399
范文四:设计性实验方案
整流滤波稳压电路的实验方案
一、实验电路图
二、基本估算
限流电阻的选择:
电容的选择:稳压系数: Sr =
?U O /U O
?U I /U I
流过负载的平均电流
为
流过二极管的平均电流为二极
管所承受的最大反向电压流过负载的脉动电压中包含有直流分量和交
流分量,可将脉动 电压做傅里叶分析,此时谐波分量中的二次谐波幅度最大。脉动系数S
定义为二次谐波的幅值与平均值的比值。
3. 单相桥式整流电路的负载特性曲线单相桥式整流
电路的负载特性曲线是指输出电压与负载电流之间的关系
三、可行性分析
1 桥式整流电路工作原理
电路中采用四个二极管,互相接成桥式结构。利用二极管的电流导向作用,在交流输入电压U2的正半周内,二极管D1、D3导通,D2、D4截止,在负载RL 上得到上正下负的输出电压;在负半周内,正好相反,D1、D3截止,D2、D4导通,流过负载RL 的电流方向与正半周一致。因此,利用变压器的一个副边绕组和四个二极管,使得在交流电源的正、负半周内,整流电路的负载上都有方向不变的脉动直流电压和电流。
2电容滤波电路
整流电路输出的直流电压脉动较大,一般不能满足实际需要,必须用滤波电路滤除交流分量,得到平滑的直流电压。在小功率直流电源中,常用的滤波电路有电容滤波、Г型滤波和п滤波。在整流电路输出端与负载之间并联一只大容量的电容.
3 稳压电路
整流电路把交流电变换为单方向的脉动电压,而滤波电路降低了输出电压中的脉动成分。但是,整流滤波电路的输出电压与理想的直流电源还有相当的距离,主要存在两方面的问题:一是当负载电流变化时,由于整流滤波电路存在内阻,因此输出直流电压将随之发生变化;二是当电网电压波动时,因整流电路的输出电压直接与变压器二次电压U2有关,故也相应的变化。为了得到更加稳定的直流电源,需要在整流滤波电路的后面加上稳压电路。稳压电路的指标有内阻、稳压系数、电压调整率、电流调整率、最大纹波电压温度系数以及
噪声电压等。本实验采用的是硅稳压管电路。 四、实验内容及步骤
1. 用万用表测量二极管,用万用表检查二极管极性和性能的好坏。
2. 连接单相桥式整流滤波稳压电路,调节负载电阻,使负载电流分别为8mA ,测量并记录输入交流电压、整流电路的输出直流电压和负载两端的电压的大小。
2010405289
学
物理设计性实验
题目:整流滤波稳压电路的实验方案
学 院: 物理与电子工程学院 专 业: 物理学 班 级: 10物本(1) 学生姓名: 朱型泳 指导教师: 潘金福
号
:
2012年11月19日
范文五:设计性实验方案
《遗传学-细胞生物学综合设计性实验》第二部分:
《设计性实验方案》
一、教学目的
训练学生查阅文献,灵活运用所学知识和技能设计实验,完成实验,以培养学生发现问题、分析问题和解决某一问题的能力,培养学生的创新意识和创新能力。
二、实施步骤
(一)选题
实验以4人一组,教师介绍实验室所具备的实验条件,明确选题的范围并指导学生查阅文献,学生灵活运用所学知识和技能自行选题并设计实验。
选题范围:取材——生物材料;目的——遗传改造;方法——不限。
(二)设计及撰写实验方案
查阅文献后,以4人小组为单位讨论并制定出完整的实验方案,除实验题目外,还包括以下内容:
1 实验目的
2 基本原理
3 仪器和材料
3.1仪器设备(名称与数量)
3.2材料(名称与数量)
3.3试剂(名称与数量)
4 实验方法
4.1 操作步骤(实验测试手段要建立在自身的认知水平及实验室现有条件基础上)
4.2 流程图(或技术路线,关键步骤标注主要实验方法名称)
5 预期结果和创新点
6 主要参考文献
完整的实验方案交由教师评阅后,根据评阅意见再修改、完善。
(三)实施实验
1.择优实施,以第二课堂学生科技创新实验形式进行,时间另定。
2. 入选实验方案的小组根据实验设计,进行实验准备工作,包括试剂的配制、实验器具和实验材料的准备。
3.按实验设计方案的方法步骤,完成实验的全过程,并做详细的实验记录。
附录:
实验设计的意义、三要素和六原则
(一)实验设计的意义
实验设计是科学研究计划内关于研究方法与步骤的一项内容。在科研工作中,在制订研究计划时,都应根据实验的目的和条件,结合统计学的要求,针对实验的全过程,认真考虑实验设计问题。一个周密而完善的实验设计,能合理地安排各种实验因素,严格地控制实验误差,从而用较少的人力、物力和时间,最大限度地获得丰富而可靠的资料。反之,如果实验设计存在着缺点,就可能造成不应有的浪费,且足以减损研究结果的价值。总之,实验设计是实验过程的依据,是实验数据处理的前提,也是提高科研成果质量的一个重要保证。
一般来说,完善的设计方案需具备以下几个条件:实验所需的人力、物力和时间资源;实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求,对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”,是科学实验设计的核心。
(二)实验设计的“三要素”
1. 实验对象:实验所用的材料即为实验对象。如用小鼠做实验,小鼠就是本次实验的实验对象,或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度,以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。样本过大或过小都有弊端。
2. 实验因素,又称为被试因素:所有影响实验结果的条件都称为影响因素,实验研究的目的不同,对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观,主要与次要因素之分。研究者希望通过研究设计进行有计划的安排,从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素(如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等);对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或称重要的非实验因素(如动物的窝别、体重等);其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。最好通过一些预实验,初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合适,以免实验设计过于复杂,实验难以完成。
3. 实验效应:实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志,它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识,尽可能多地选用客观性强的指标,在仪器和试剂允许的条件下,应尽可能多选用特异性强、灵
敏度高、准确可靠的客观指标。对一些半客观(比如读pH试纸上的数值)或主观指标(对一些定性指标的判断上),一定要事先规定读取数值的严格标准,只有这样才能准确地分析自己的实验结果,从而也大大提高了自己实验结果的可信度。
(三)实验设计的“六原则”
1. 随机原则:即运用“随机数字表”实现随机化;运用“随机排列表”实现随机化;运用计算机产生“伪随机数”实现随机化。尽量运用统计学知识来设计自己的实验,减少外在因素和人为因素的干扰。
2. 对照原则,包括空白对照和阳性对照:空白对照组的设立——只有通过对照的设立我们才能清楚地看出实验因素在当中所起的作用。当某些处理本身夹杂着重要的非处理因素时,还需设立仅含该非处理因素的实验组为实验对照组;历史或中外对照组的设立一一这种对照形式应慎用,其对比的结果仅供参考,不能作为推理的依据;多种对照形式同时并存。
3. 重复原则,包括两层含义,即重现性和重复数:所谓重复原则,就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。一般认为重复一定次数以上的实验才具有较高的可信度。
4. 均衡原则:一个实验设计方案的均衡性好坏,关系到实验研究的成败。应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用,群策群力,方可有效地提高实验设计方案的均衡性。在实验设计的过程中要注意时间上的分配,只有在时间上分配好了,才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。
5. 弹性原则:所谓空格,指的是在时间分配图上留有空缺。适当的空缺是非常必要的,只有这样才能富有弹性的实施实验计划,并不断地调整好自己的实验进度。
6. 经济原则:不论什么实验,都有它的最优选择方案,这包括在资金的使用上,也包括人力时间的损耗上,必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值,这个比值越大越好,当然是以你所拥有的实验条件作基础的