范文一:青霉素的种子培养基(文档3篇)
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粉拟青霉的一种选择培养基第一篇
福建林学院学报 1999, 19(3) :270,272Journ al of Fujian
College of Forestry
粉拟青霉的一种选择培养基
张文勤
(福建省尤溪县森防检疫站 365100)
摘要 300mg /L 硫酸铬铵铜、4mg /L 代森锌、1800mg /L 硫酸铜、1000mg /LKMnO 4、100mg /5000mg /L 氯霉素、L 结晶紫、pH 自然组成的化学抑制剂配方能够有效地抑制土
1
壤杂菌的生长而高频地获得粉拟青霉, 获得率可达40%左右. Y =2. 17X +2的线性表明平皿的粉拟青霉孢子回收数(X ) 可较为客观地反映林地土壤该菌的种群数量(Y ) . 关键词 粉拟青霉; 选择培养基中图分类号 S154. 3
虫生真菌在土壤及其栖息生境中种群动态的了解, 是流行病监测, 预测预报以及有效地组织生物防治的重要前提. 近年, 昆虫种群动态的研究日益受到重视. Ig noffo 关于菜氏野村菌种群动态的研究成功地用于粉纹夜蛾的防治, 绿僵菌在土壤中数量的变化直接影响了地下害虫的控制效果方, 达到抑制土壤细菌及快速生长的腐生真菌, 如白僵菌, 绿僵菌的选择培养基
〔4. 5〕
〔1〕
〔2. 3〕
. 而这种种群
动态卓有成效的方法是化学选择培养基的应用. 欧美的研究工作通常是由复杂多样的杀菌物质组成配
.
粉拟青霉经初步实验测定:该菌生长的pH 2. 5, 低温生长的下限为5?左右, 这些生态条件和土壤腐生真菌(如毛霉、曲霉、青霉、木霉等) 均较为一致, 选择效果不佳. 从营养组份考虑, 粉拟青霉具较强的腐生性, 营养要求不高且基本趋
2
回于土壤腐生真菌.
1 材料与方法
1. 1 不同杀虫剂对粉拟青霉生长抑制的浓度下限
在PDA 培养基中, 分别加入2. 0%、4. 0%、6. 0%、8. 0%的硫酸铜; 0. 1%、0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%的硫酸铬铵铜; 0. 5%、1. 0%、1. 5%、2. 0%KM nO 4; 100mg /L 、150mg /L 、200mg /L 、250m g /L 、
300mg /L 的代森锌; 1. 0%、1. 5%、2. 0%、2. 5%的敌克松, pH 2. 0、pH 2. 5、pH 3. 0、pH 3. 5. 20?恒温培养观察, 确定抑制生长的最低浓度. 1. 2 杀菌剂配比
选择培养基的组合及筛选, 依据各杀菌剂抑制粉拟青霉的最低浓度, 加入林地土壤菌悬液, 摇匀凝固, 于20?恒温培养, 检查杂菌生长类群, 同时另设对照组. 根据杂菌生长状况, 对各杀菌剂在抑制粉拟青霉最低浓度下限范围进行不同杀菌的不同浓度配比组合, 同时加入100mg /L 结晶紫、5000m g/L 氯霉素以抑制细菌生长.
1. 3 配制方法
在121?, 15m in 灭菌的PDA 培养基中, 加入不同配比的杀菌剂(分消8磅15min ) , 加入结晶紫和氯霉素. 在预加入1ml 混有不同浓度的粉拟青霉孢子和1g 土壤悬液的平皿中倒入待凝的选择培养基9ml , 凝固后20?恒温培养, 10d 后检查分离结果. 同时另设一组PPA 基+土壤菌悬液(CK 混) ;
3
PDA +粉拟青霉孢子液(CK 纯) 为对照.
2 结果和分析
2. 1 化学杀菌剂的初筛
初筛应该达到2个目的:即在一定浓度下(粉拟青霉生长抑制浓度下限) , 不抑制病原真菌的生长,
第3期 张文勤:粉拟青霉的一种选择培养基
271
同时对土壤腐生真菌的一种或多种有明显的抑制效果. 初筛的结果于表1.
土壤中马尾松林地快速生长的腐生真菌主要集中于曲霉、青霉、木霉、毛霉等属. 表1表明:所用的不同杀菌剂的不同浓度均可一定程度地抑制土壤真菌生长. 如硫酸铜类, 可抑制木霉、毛霉生长, 敌克松则可抑制青霉和曲霉生长. 考虑到各杀菌剂的交互作用及pH 调控, 我们匹配了如下4种组合(表2) , 用于粉拟青霉的筛选试验.
表1 杀菌剂对土壤真菌的选择作用
TABLE 1 T he effect s elected of ster ilization on soil
fungu s
表2 各杀菌剂组合表 /mg ?L -1
TABLE 2 Th e compos ition of d ifferent ster ilization
4
粉拟青霉生长
土壤真菌生长类型的最低浓度
CuSO 4. 5H 2O 6%曲霉、青霉(少量) 硫酸铬铵铜1. 0%青霉、曲霉(少量) KM nO 42. 0%无孢菌群、木霉、青霉、根霉
-1
代森锌200mg ?L 曲霉、青霉敌克松2%毛霉、木霉CK 曲霉、青霉、毛霉、木霉无孢菌群杀菌剂
配合硫酸铬
序号铵铜代森锌硫酸铜KM NO 4敌克松pH A B C D
[1**********]0
8480
[1**********]0
10001000
0600
0自然0自然0自然500
2. 5
2. 2 选择培养结果
在以PDA 为基本培养常规121?灭菌后, 分别加入分消的杀真剂和杀细菌剂(无菌水配制后直接加入) . 采集不同立地条件的马尾松林土壤, 混入纯培养的不同浓度孢子悬浮液
5
1m l , 经平皿倾注分离, 结果于表3
实验证明:不同组合的选择培养基抑制杂菌效果相差很大. A 组配方浓度过高, 粉拟青霉和杂菌均不生长; C 、D 两组配方难以抑制多数土壤杂菌生长, 培养3d 后杂菌就大量生长, 从而抑制了粉
序 号A B C D CK 纯CK 混
0100*0*201*
出现菌落数50个/ml 091*2*
090*0*140*
0205*0*532*
表3 不同组合的选择培养基选择结果
T ABLE 3 T he effect selected of different com
bination of s elective culture m edium T ab le
出现菌落数100个/ml 0181*3*
0230*0*290*
0260*10*721*
出现菌落数150个/ml 0306*0*
0331*4*682*
05216*2*1400*
出现菌落数200个/ml 0602*18*
0736*5*1305*
(a ) 血球计数板测得结果 (b ) *表
6
示杂菌很多
(c ) C K 纯:添加粉拟青霉纯培养液(d ) Ck 混:添加土壤菌悬液和粉拟青霉孢子液
拟青霉的生长, 故选择效果不理想, B 组合是较为理想的选择培养基, 能够有效地抑制杂菌生长且拟青霉
有较高的分离频率. 该组合平皿通常5d 后才明显地长出菌落, 虽也有少量青霉和曲霉长出, 但菌落较小, 而粉拟青霉的菌落整齐, 明显可见. Dobeyski 曾在设计白僵菌的选择培养基中加入结晶紫, 除了抑制细菌外, 还赋于白僵菌菌落背面暗紫颜色从而达到快速鉴别作用, 在我们的粉拟青霉选择培养基中, 这种特点并不十分明显. 但利用菌落特征结合镜检, 仍可快速地检查出. 2. 3 选择培养基分离效果的稳定性 为检验B 组选择培养基的稳定性, 在3种不同立地的马尾松再次采样实验, 结果显示该选择培养基分离效果具有一定的稳定性见表4.
2. 4 林地孢子数量预测的数学模型
B B 选择基 8CK
17
平皿菌落数50个/ml 918
621
2041
表4 B 选择培养基选择分离效果检验
7
T ABLE 4 Th e test of separating effect for
selective cultur e medium (B ) 序 号
平皿菌落数100个/ml 2035
平皿菌落数150个/ml
平皿菌落数200个/ml
17 35 24 28 71 70 5738
70
65
74
150
122
166
*:表中数字为3次重复平均值
272
福 建 林 学 院 学 报
第19卷
霉数量. 由表4可见, 随着CK 组分离的实际孢子数量增加, 在林地20,200个/m l 孢子的范围内, 可以通过简单的线性方程回归, 从而依据选择培养分离到的频率推测林间土壤的实际孢子数. 用表3,4的数据进行回归, 得Y =2. 17X +2(Y:林地孢子数; X:平皿所测孢子数) , 经方差分析〔Fa1(1, 6) =3. 78, F=4. 1〕, 表明该方程在实际应用中基本可靠.
8
3 小结
研究所获得B 组选择培养基有较高的选择性和粉拟青霉的分离频率. 在林地土壤中, 每毫升土壤菌悬液粉拟青霉数0,200个范围内, 获得率可达40%, 效果较为理想. 美国爱荷达大学Heck 设计的分离
6〕
白僵菌选择培养基, 据报道获得白僵菌可达50%〔以上. 由于粉拟青霉种群庞大(Sam son 系统(1974年) 中记载31种) , 同时有相当部分腐生于土壤中, 评价粉拟青霉在实际土壤原种群的监测价值, 还得进一步验证.
白僵菌、绿僵菌的选择培养基筛选国内外已有较为成功的报道, 实践表明, 从化学杀菌剂的配组进行的选择培养基的筛选, 对于粉拟青霉的分离是较为可行的有效方法, 将有助于林间流行病研究的深入.
本研究得到厦门大学黄耀坚副教授指导及审阅文稿, 特此致谢.
参 考 文 献
1 I gnoffo , CM. J. I nv ert. P athol. 1977, 29:147,1522 R ath , A C . J . Inv er t , Patho l , 1985, 45:81,93
3 St or ey CK , v fh , Iccp , Adelaride Collog uium 1990.
326,3304 V een, K H. j. Inv ert. Pat ho l, 1966, 8:268,269
9
5 D oberski, JM , T rans. Br. M y co l, So c, 1980, 74:95,
1006 L ing g , A L , J , Inver t , P athol , 1988, 38:191,200
A Selective Culture Medium of Paecilom yles Farinosus
Zhang Wenqin
(The Forest Dis ease &Ins ect Pes t Control and Quar antine S tation of Youxi County, Fujian 365100)
ABSTRCT A select ive cultur e medium could hig h-fr equently ret rieve P . Far inosus , and effectiv ely contr ol the gr ow th of soil fung us . T he o btaining r ate o f P . Farinosus had amo unt ed t o 40%.T he linear equatio n (y =2. 17x +2) also indicated that t he amo unt of spo r es r et rieved o f P . Far inosus in cult ur e dish (x ) could objectively r epr esent the po pulatio n density of the fung us in the for est soil (y ) .
KEY WORDS P . Far inosus , selectiv e culture medium
PDA培养基中加入青霉素、链霉素的抗菌作用试验简报第
二篇
中国食用菌,,,,,,,(,):,,—,,,,,,
,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,一,,
,,,,,,,,—,,,,
10
,,,培养基中加入青霉素、链霉素的抗菌作用试验简报
戴水莲,林警,高丽
(湖南省怀化职业技术学院,怀化,,,,,,)
摘要:通过在,,,培养基中加入青霉素、链霉素的抗茵试验表明,肋,培养基中添加浓度为,,峭?,,’,或,,,肛,?
,,一的青霉素钠或硫酸链霉素或青霉素钠,硫酸链霉素后,培养基的抗杂茵能力增强,特别是抗细茵能力增强,并对茵丝的生长无明显抑制作用。
关键词:,,,培养基;青霉素;链霉素;抗茵作用
中图分类号:,,,,(,文献标识码:,文章编号:,,,,—,,,,(,,,,),,一?,,—,,
,,,培养基是食用菌母种培养基的主要类型之一,通常和紫外线杀菌过的接种箱内。
抗生素与空白,,,培养基的混合并分装:在杀好菌的
容易感染杂茵。本试验的目的在于通过把抗生素加入到,,,接种箱内将过滤除菌的抗生素溶液按,组、;组、,组、,培养基中,分组试验比较,取得增强,,,培养基的抗杂菌组、,组、,组的设计,快速倒入各空白,,,培养基中,充能力的实验资料,用于指导实践。分摇动,使抗生素混合均匀,,组不如抗生素。然后依次将,材料与方法:各组培养基趁热分装到试管中,塞上棉塞。每组,,支,,支
11
成,扎,用牛皮纸包好。贴上组次标签,做好斜面,注意斜
,(,材料
面长度要一致。
,(,(,常规配制的,,,培养基。
,组:空白,,,培养基;,组:空白,,,培养基,青
,(,(,平菇菌种:,,,,,第,代母种,支,由四川绵阳食用霉素(浓度:,,斗,?,,。,);;组:空白,,,培养基,青霉菌研究所提供。素(浓度:,,,斗,?,,。,);,组:空白,,,培养基,链霉,(,(,注射用青霉素钠,,万单位,支,国药准字号素(浓度:,,斗,?,,‘,);,组:空白,,,培养基,链霉素,,,,,,,,,,哈药集团制药总厂,产品批号:,,,,,,,,;,,;(浓度:,,,斗,?,,“);,组:空白,,,培养基,青霉素注射用硫酸链霉素,,,万单位,支,国药准字号,,,,,,,,,,(浓度:,,睇?,,,,),链霉素(浓度:,,斗,?,,,,);,华北制药股份有限公司,产品批号:,,,,,,。组:空白,,,培养基,青霉素(浓度:,,,,,?,,,,“),链,(,方法霉素(浓度:,,,帖?,,‘,)。
,(,(,配制,,,培养基,准备好分组材料。,(,(,稍微烘干培养基表面
12
时间:,,,,年,,月,,日上午。时间:,,,,年,,月,,日。
抗生素的处理:在分析天平上依次称取青霉素,,,,峙为了避免培养基表面过湿而容易感染杂菌,将以上装有
,,,雌,份;链霉素,,,,峙,份、,,,,,懈,份。培养基的试管平放于干燥箱中,,,?下烘,,,。
每份分别溶于,,,,水中,然后在杀过菌的接种箱内用,(,(,接种、培养
时间:,,,,年,,月,,日接种。
,,,培养基的配方:马铃薯,,,,、蔗糖,,,、琼脂,,,,将,组一,组中每组的,,支依照母种的转管扩大培养,,,,,,,,,,值自然。方式接种上平菇,,,,母种(用作观察菌丝的生长情况),用,,,培养基的配制:常规配制,,,培养基,,,,,,配去,支。接种时在接种箱内严格按无菌操作方式完成,接种
的母种块大小一致。每组的另,,支未接菌种(用作观察培
养基的杂菌感染情况)。然后将接好菌种和未接菌种的培养
,,,,,,自然降压到,(,,,,放气,迅速取出,放入事先熏蒸基试管一并置于恒温箱中培养,接好菌种的培养,,,,未接
万 方数据用于菌种分离和母种的转管繁殖及扩大培养。
13
菌种分离时常,份、,,,(,,“,的滤膜过滤除菌。水,好后分装到,个锥形瓶中,每瓶装,,,,,塞上棉塞,用报纸包好瓶口,放人手提式高压灭菌锅中灭菌,,,,?保持作者简介:戴水莲(,,,,一),女,湖南辰溪人,,,,,年毕业于湖南师范大学生物系,现为湖南省怀化职业技术学院讲师。收稿日期:,,,,—,,—,,
中国食用菌,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,(,
菌种的培养,,,,温度均为,,?。天,,组的,支被杂菌感染;第,,天,,组共有,支被感,现象观察染;第,,天,,组共有,支被感染;,,,内,,支全部感染,
接种后每天观察培养基上有无杂菌感染及菌丝生长其中,支被细菌感染,,支被真菌感染。,组、,组、,组、情况。,组、,组在,,,内均有,支被真菌感染,,组有,支被真,(,未接菌种组菌感染。
接种后,,,内所有试管的培养基表面均清洁无污。第,,
表,未接菌种的培养基的污染情况
,(,接菌种组接种后的第,天,,组、,组、;组、,组、,组、,,(,(,杂菌感染情况组、,组的每支试管都有毛绒绒的很短的新菌丝冒出。以后
接种后,天内各组均不见感染现象。第,天,组有,支,
14
,一,,内,,组、,组、,组、,组、,组、,组的菌丝呈被感染,第,,天,组共有,支被感染,第,,天共有,支被蓑衣状向四周扩散,菌丝纯白、浓密;,,,,,,,长满培养基感染,第,,天余下的,支也被感染。而,组、;组、,组、斜面,,组问无明显差异。,组的菌丝生长稍慢,菌丝较稀,组、,组、,组在培养的,,,内均不见杂菌感染现象。疏;,,,,,,,长满培养基斜面(表,)。,(,(,菌丝生长情况
表,接菌种的培养基的污染及菌丝生长情况
,结果及讨论于其他,组,而其他,组间无明显区别,说明浓度为,,懈?,(,青霉素钠或硫酸链霉素加入刭,,焱培养基中,对培养,,一或,,,烬?,,。的青霉素钠或硫酸链霉素或者两者的混基抗杂菌能力的影晌合物对菌丝的生长无明显抑制作用,并且所采用的,种浓度
从未接菌种的情况可以看出,,组被杂菌感染的现象远对菌丝生长也无明显差异。
比其他,组严重。而其他,组问无明显区别。,组是不加青,(,讨论与小结
霉素钠或硫酸链霉素的,其他,组是添加青霉素钠或硫酸链青霉素钠和硫酸链霉素是广泛使用的,种抗生素,当把霉素或者青霉素钠,硫酸链霉素的,说明,,,培养基中添浓度为,,雌?,,‘,或,,,帖?,,。的青霉素钠或硫
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酸链霉加了浓度为,,斗,?,,。,或,,,斗,?,,。,的青霉素钠或硫酸素或者两者的混合物添加到,,,培养基中,增强了培养基链霉素或者两者的混合物,增强了培养基抗杂菌的能力。抗杂菌的能力,特别是抗细菌的能力增强,并对菌丝的生长,(,青霉素钠或硫酸链霉素加入到,,,培养基中。对菌丝无明显抑制作用。在这,种浓度下,抗杂菌的效果和对菌丝生长能力的影响生长的影响无明显差别。
从接菌种的情况可以看出,,组菌丝的生长能力稍微差
万 方数据
PDA培养基中加入青霉素、链霉素的抗菌作用试验简报
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年,卷(期):
被引用次数:戴水莲, 林警, 高丽, DAI Shui-lian, LIN Jing, GAO Li湖南省怀化职业技术学院,怀化,418000中国食用菌EDIBLE FUNGI OF CHINA2007,26(4)7次
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本文链接:.cn/Periodical_zgsyj200704017.aspx
PDA培养基中加入青霉素_链霉素的抗菌作用试验简报第三篇
中国食用菌 2007,26(4):53~54
EDIBLEFUNGIOFCHINA
CN53-1054/Q ISSN1003-8310
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PDA培养基中加入青霉素、链霉素的抗菌作用试验简报
戴水莲,林 警,高 丽
(湖南省怀化职业技术学院,怀化 418000)
摘要:通过在PDA培养基中加入青霉素、链霉素的抗菌试验表明,PDA培养基中添加浓度为50Lg#mL-1或100Lg#mL-1的青霉素钠或硫酸链霉素或青霉素钠+硫酸链霉素后,培养基的抗杂菌能力增强,特别是抗细菌能力增强,并对菌丝的生长无明显抑制作用。
关键词:PDA培养基;青霉素;链霉素;抗菌作用
中图分类号:S64619 文献标识码:A 文章编号:1003-8310(2007)04-0053-02
PDA培养基是食用菌母种培养基的主要类型之一,通常用于菌种分离和母种的转管繁殖及扩大培养。菌种分离时常容易感染杂菌。本试验的目的在于通过把抗生素加入到PDA培养基中,分组试验比较,取得增强PDA培养基的抗杂菌能力的实验资料,用于指导实践。
和紫外线杀菌过的接种箱内。
抗生素与空白PDA培养基的混合并分装:在杀好菌的接种箱内将过滤除菌的抗生素溶液按B组、C组、D组、E组、F组、G组的设计,快速倒入各空白PDA培养基中,充分摇动,使抗生素混合均匀,A组不加抗生素。然后依次将各组培养基趁热分装到试管中,塞上棉塞。每组20支,
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5支
1 材料与方法:
111 材料
11111 常规配制的PDA培养基。11112 平菇菌种:菌研究所提供。
11113 注射用青霉素钠80万单位1支,国药准字号H23021439,哈药集团制药总厂,产品批号:A051134107;注射用硫酸链霉素100万单位1支,国药准字号H13020650,华北制药股份有限公司,产品批号:041109。112 方法
11211 配制PDA培养基,准备好分组材料。
时间:
2006年10月19日上午。
2106,第2代母种4支,由四川绵阳食用
成1扎,用牛皮纸包好。贴上组次标签,做好斜面,注意斜面长度要一致。
A组:空白PDA培养基;B组:空白PDA培养基+青霉素(浓度:素(浓度:素(浓度:(浓度:(浓度:
50Lg#mL-1);C组:空白PDA培养基+青霉100Lg#mL-1);D
组:空白PDA培养基+链霉50Lg#mL-1);E组:空白PDA培养基+链霉素
50Lg#mL-1);G
100Lg#mL-1);F组:空白PDA培养基+青霉素50Lg#mL-1)+
20
链霉素(浓度:
100Lg#mL-1)。
100Lg#mL-1)+链
组:空白PDA培养基+青霉素(浓度:霉素(浓度:
11212 稍微烘干培养基表面
时间:2006年10月20日。
为了避免培养基表面过湿而容易感染杂菌,将以上装有培养基的试管平放于干燥箱中,60e下烘10h。11213 接种、培养
时间:2006年10月21日接种。
将A组~G组中每组的10支依照母种的转管扩大培养方式接种上平菇2106母种(用作观察菌丝的生长情况),用去4支。接种时在接种箱内严格按无菌操作方式完成,接种的母种块大小一致。每组的另10支未接菌种(用作观察培养基的杂菌感染情况)。然后将接好菌种和未接菌种的培养基试管一并置于恒温箱中培养,接好菌种的培养15d,未接
抗生素的处理:在分析天平上依次称取青霉素5000Lg2份、10000Lg2份;链霉素5000Lg2份、10000Lg2份。每份分别溶于10mL水中,然后在杀过菌的接种箱内用0145Lm的滤膜过滤除菌。
PDA培养基的配方:马铃薯200g、蔗糖20g、琼脂20g,水1000mL,
21
pH值自然。
PDA培养基的配制:常规配制PDA培养基700mL,配好后分装到7个锥形瓶中,每瓶装90mL,塞上棉塞,用报纸包好瓶口,放入手提式高压灭菌锅中灭菌,
121e保持
15min,自然降压到015MPa放气,迅速取出,放入事先熏蒸
作者简介:戴水莲(1971-),女,湖南辰溪人,1995年毕业于湖南师范大学生物系,现为湖南省怀化职业技术学院讲师。
:
54
菌种的培养60d,温度均为25e。
中国食用菌 EDIBLEFUNGIOFCHINA
天,A组的3支被杂菌感染;第14天,染;第19天,A组共有8支被感染;其中8支被细菌感染,
Vol126 No14 A组共有5支被感
2 现象观察
接种后每天观察培养基上有无杂菌感染及菌丝生长情况。
211 未接菌种组
接种后10d内所有试管的培养基表面均清洁无污。第12
60d内10支全部感染,
2支被真菌感染。B组、C组、E组、
D组有2支被真
22
F组、G组在60d内均有1支被真菌感染,菌感染。
表1 未接菌种的培养基的污染情况
培养时间/d
1012141960
培养基
A035
8(细菌6、真菌2)10(细菌8、真菌2)
B0001(真菌)1(真菌)
C0001(真菌)1(真菌)
D0001(真菌)2(真菌)
E0001(真菌)1(真菌)
F0001(真菌)1(真菌)
G00001(真菌)
212 接菌种组21211 杂菌感染情况
接种后6天内各组均不见感染现象。第7天A组有1支被感染,第10天A组共有3支被感染,第13天共有6支被感染,第15天余下的4支也被感染。而B组、C组、D组、E组、F组、G组在培养的15d内均不见杂菌感染现象。21212 菌丝生长情况
接种后的第3天,A组、B组、C组、D组、E组、F
组、G组的每支试管都有毛绒绒的很短的新菌丝冒出。以后4d~9d内,
23
B组、C组、D组、E组、F组、G组的菌丝呈
蓑衣状向四周扩散,菌丝纯白、浓密;11d~12d长满培养基斜
面,6组间无明显差异。A组的菌丝生长稍慢,菌丝较稀
疏;14d~15d长满培养基斜面(表2)。
表2 接菌种的培养基的污染及菌丝生长情况
培养基
生长情况
A
培养基被污染数量/支
10(9支细菌、1支真菌)
菌丝生长稍慢,稍
菌丝生长情况
稀疏,满斜面
14d~15d长
B 0菌丝纯白、浓密,
11d~
同B组
同B组
同B组
同B组
同B组
C0
24
D0
E0
F0
G0
12d长满斜面
3 结果及讨论
311 青霉素钠或硫酸链霉素加入到PDA培养基中,对培养基抗杂菌能力的影响
从未接菌种的情况可以看出,A组被杂菌感染的现象远比其他6组严重,而其他6组间无明显区别。A组是不加青霉素钠或硫酸链霉素的,其他6组是添加青霉素钠或硫酸链霉素或者青霉素钠+硫酸链霉素的,说明PDA培养基中添加了浓度为50Lg#mL-1或100Lg#mL-1的青霉素钠或硫酸链霉素或者两者的混合物,增强了培养基抗杂菌的能力。312 青霉素钠或硫酸链霉素加入到PDA培养基中,对菌丝生长能力的影响
从接菌种的情况可以看出,A组菌丝的生长能力稍微差
于其他6组,而其他6组间无明显区别,说明浓度为50Lg#mL-1或100Lg#mL-1的青霉素钠或硫酸链霉素或者两者的混合物对菌丝的生长无明显抑制作用,并且所采用的2种浓度对菌丝生长也无明显差异。313 讨论与小结
青霉素钠和硫酸链霉素是广泛使用的2种抗生素,当把浓度
25
为50Lg#mL-1或100Lg#mL-1的青霉素钠或硫酸链霉素或者两者的混合物添加到PDA培养基中,增强了培养基抗杂菌的能力,特别是抗细菌的能力增强,并对菌丝的生长无明显抑制作用。在这2种浓度下,抗杂菌的效果和对菌丝生长的影响无明显差别。
26
范文二:(五)青霉素发酵培养基正交优化试验
(五)青霉素发酵培养基正交优化试验 一、实验目的
1、掌握培养基的原理
2、了解培养基优化的原理和试验设计方法
3、通过实验确定青霉素发酵的较适培养基
二、实验原理
一)、掌握培养基的原理
1. 碳源、氮源
许多碳源和氮源都是复杂的有机物大分子,如淀粉、黄豆饼粉等,用这类原料作为培养基时,微生物必须要具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力,但不是所有的微生物都具备这种能力的.
相应的酶水解/葡萄糖:成本高
2. 代谢的阻遏和诱导
碳源、氮源:根据微生物的特性和培养的目的,注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合
葡萄糖:具体利用葡萄糖产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性.
氮源的诱导或阻遏:蛋白酶类,受培养基中蛋白质或多肽的诱导,而受铵盐、硝酸盐的阻遏;应以有机氮源为主
3. 合适的C 、N比
碳氮:显著影响微生物生长繁殖和产物合成.
氮源:过多,菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累;不足则菌体繁殖量少,从而影响产量
碳源:过多则容易形成较低的pH;不足则容易引起菌体的衰老和自溶. 碳氮比:菌丝体生长阶段氮源需求高;孢子生长阶段氮源需求低. 100:(0.2~2.0)
4. pH的要求
微生物在利用营养物质后,由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系的pH的波动.因而在配制培养基选取营养成分时,除了要考虑营养的需求外,还要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲体系的影响
二)培养基优化的原理和试验设计方法
1.培养基优化的基本原理
一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段. 第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成.
第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济
2. 实验设计方法
单因子实验确定培养基的成分 多因子实验确定各成分对培养基的影响大小及适宜浓度
多因子:通过较少的实验次数获得所需的结果,正交实验设计、相应面分析等
, 为了追求可比性,正交表中的每个水平都要有适当的重复。正交实验所需
的实验次数(NL)是有实验需要的水平数(q)决定的:NL,nq2。n为
自然数。
, 正交表具有3个主要特点:(1)任何两因素之间的都是全面实验,从而保持了可比
性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了,并且出现了相同的
次数。(2)任一因素个水平的重复次数相等。(3)绝大多数正交表中各列是等价的,
可以任意取用。因此,正交表的实验结果非常易于分析,以至于不需要进行复杂的
统计计算,就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。 实验数据
实验数 T(反应温度) t(反应时间) c(浓度) Y(得率)/%
1 80 90 5 31
2 80 120 6 54
3 80 150 7 38
4 85 90 6 53
5 85 120 7 49
6 85 150 5 42
7 90 90 7 57
8 90 120 5 62
9 90 150 6 64 K(和) I 123 141 135
II 144 165 171
III 183 144 144
k(均值) I 41 47 45
II 48 55 57
III 61 48 48
R(极值) 20 8 12
正交实验:
1.根据问题的要求确定因子和水平,列出因子水平表
2.根据因子和水平数选用合适的正交表,设计表头,安排实验
3.根据正交表给出的实验方案,进行实验
4.对实验结果进行分析,选出较优的“实验条件” 以及对结果有显著影响的因子 分3组进行: 3因子3水平
周二:碳源的影响 乳糖,葡萄糖
周三:氮源的影响 醋酸铵
周五:前体的影响 苯乙酸
因子水平表
水平/因子 乳糖/葡萄糖 醋酸铵 苯乙酸
1 20/10 7.0 0.7
2 22.5/7.5 8.0 1.0
3 25/5 9.0 1.3
L9(34)正交实验结果
试验号 抑菌圈 1 2 3 4
乳糖/葡萄糖 醋酸铵 苯乙酸 (mm)
1 1 1 1 1 a
2 2 1 2 3 b
3 3 1 3 2 c
4 1 2 2 2 d
5 2 2 3 1 e
6 3 2 1 3 f
7 1 3 3 3 g
8 2 3 1 2 h
9 3 3 2 1 i
k1 (a+b+c)/3 (a+f+h)/3 (a+e+i)/3
k2 (d+e+f)/3 (b+d+i)/3 (c+d+h)/3
k3 (g+h+i)/3 (c+e+g)/3 (b+f+g)/3 极差 A B C
因素水平效应图:
横坐标分为三部分:乳糖/葡萄糖;醋酸铵;苯乙酸
纵坐标:抑菌圈的直径
在横坐标和纵坐标上找出相应的点,连接成线,从而得出因素水平的效应图
三. 实验材料
1.菌种:产黄青霉菌(Pencillium chrysogenum); 金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus) 2.培养基
发酵培养基:乳糖22.5g,葡萄糖7.5g,醋酸铵8.0g, Na2SO40.5g,MgSO4?7H2O 0.25g,
FeSO4?7H2O 0.1g,CuSO4?5H2O 0.005g,MnSO4?7H2O 0.02g,CaCl2?2H2O
0.05g,ZnSO4?7H2O 0.02g,苯乙酸1.0g,蒸馏水1000ml,pH 6.5,121?灭菌20min.
注意:微量元素配成母液,按需要加入,苯乙酸用乙醇溶解后再加入
生物测定培养基:牛肉膏0.5% 蛋白胨1% 酵母膏0.3% NaCl0.3% 琼脂1.5% 葡
萄糖5% pH 6.0 121?灭菌20min 需要250ml
3. 设备和器皿:摇床,三角瓶,牛津小杯,平皿,离心机,分光光度计,容量瓶等
4. 试剂:1% pH6.0磷酸缓冲溶(K2HPO4 2g, KH2PO4 8g,蒸馏水1000ml);0.85%生理盐水 四. 操作步骤
1. 发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml.
(三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml三角瓶装液量为50ml) 2. 摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25?、200rpm培养6-7天,可进行青霉素的效价测定
3.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37?培养16-18h的斜面菌种,用0.9%的生理盐水洗下离心洗涤3000rpm 5min,将菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液,需要6ml 4.生测平板的制备:生测培养基200ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*3+2个平板 5.青霉素发酵液效价的测定: 发酵结束后用1% pH 6.0的磷酸缓冲液将上清发酵液适当稀释.每个被测样品用3套平皿进行测定;37?培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小 6.填写正交实验表格,确定最适培养基配方
五. 实验内容
1.不同因子及水平的培养基配制
2.产黄青霉菌的液体发酵
3.发酵液的效价测定
4.最适培养基配方的确定
六. 实验结果
L9(34)正交实验结果
抑菌圈 1 2 3 4
乳糖/葡萄糖 醋酸铵 苯乙酸 (mm)
1 1 1 1 1 2.15a
2 2 1 2 3 1.94b
3 3 1 3 2 1.70c
4 1 2 2 2 1.75d
5 2 2 3 1 1.89e
6 3 2 1 3 1.93f
7 1 3 3 3 1.85g
8 2 3 1 2 1.65h
9 3 3 2 1 1.53i
k1 2.26 1.19 1.86
k2 1.86 1.74 1.70
k3 1.68 1.81 1.91
极差 0.58 0.62 0.12
范文三:青霉素发酵培养基正交优化试验
青霉素发酵培养基正交优化试验
一、实验目的
1、掌握培养基的原理
2、了解培养基优化的原理和试验设计方法
3、通过实验确定青霉素发酵的较适培养基
二、实验原理
(一)、掌握培养基的原理
1. 碳源、氮源
许多碳源和氮源都是复杂的有机物大分子,如淀粉、黄豆饼粉等,用这类原料作为培养基时,微生物必须要具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力,但不是所有的微生物都具备这种能力的.
相应的酶水解/葡萄糖:成本高
2. 代谢的阻遏和诱导
碳源、氮源:根据微生物的特性和培养的目的,注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合
葡萄糖:具体利用葡萄糖产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性.
氮源的诱导或阻遏:蛋白酶类,受培养基中蛋白质或多肽的诱导,而受铵盐、硝酸盐的阻遏;应以有机氮源为主
3. 合适的C 、N比
碳氮:显著影响微生物生长繁殖和产物合成.
氮源:过多,菌体生长过于旺盛,pH偏高,不利于代谢产物的积累;不足则 菌体繁殖量少,从而影响产量
碳源:过多则容易形成较低的pH;不足则容易引起菌体的衰老和自溶.
碳氮比:菌丝体生长阶段氮源需求高;孢子生长阶段氮源需求低.100:(0.2~2.0
4. pH的要求
微生物在利用营养物质后,由于酸碱物质的积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系的pH的波动.因而在配制培养基选取营养成分时,除了要考虑营养的需求外,还要考虑其代谢后对培养体系pH缓冲体系的影响 (二)培养基优化的原理和试验设计方法
1.培养基优化的基本原理
一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形成期两个阶段.
第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微生物催化产物合成所需酶系的形成.
第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最佳或底物的消耗最经济
2. 实验设计方法
单因子实验确定培养基的成分:多因子实验确定各成分对培养基的影响大小及适宜浓度
多因子:通过较少的实验次数获得所需的结果,正交实验设计、相应面分
析等
, 为了追求可比性,正交表中的每个水平都要有适当的重复。正交实验
所需的实验次数(NL)是有实验需要的水平数(q)决定的:NL,nq2。n
为自然数。
, 正交表具有3个主要特点:(1)任何两因素之间的都是全面实验,从而保持了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭配在实验中都出现了,并且出现了相同的次数。(2)任一因素个水平的重复次数相等。(3)绝大多数正交表中各列是等价的,可以任意取用。因此,正交表的实验结果非常易于分析,以至于不需要进行复杂的统计计算,就可直接求出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。
正交实验:
1.根据问题的要求确定因子和水平,列出因子水平表
2.根据因子和水平数选用合适的正交表,设计表头,安排实验
3.根据正交表给出的实验方案,进行实验
4.对实验结果进行分析,选出较优的“实验条件” 以及对结果有显著影响的因子
三. 实验材料
1.菌种:产黄青霉菌(Pencillium chrysogenum); 金黄色葡萄球菌(Staphyloco ccusauoreus)
2.培养基
, 发酵培养基:乳糖22.5g,葡萄糖7.5g,醋酸铵8.0g, Na2SO40.5g,MgSO4
?7H2O 0.25g, FeSO4?7H2O 0.1g,CuSO4?5H2O 0.005g,MnSO4?7H2O 0.02g,CaCl2?2H2O 0.05g,ZnSO4?7H2O 0.02g,苯乙酸1.0g,蒸馏水1000ml,pH 6.5,121?灭菌20min.
注意:微量元素配成母液,按需要加入,苯乙酸用乙醇溶解后再加入
3. 设备和器皿:摇床,三角瓶,牛津小杯,平皿,离心机,分光光度计,容量瓶等
, 生物测定培养基:牛肉膏0.5% 蛋白胨1% 酵母膏0.3% NaCl0.3% 琼脂1.5% 葡萄糖5% pH 6.0 121?灭菌20min 需要250ml
4. 试剂:1% pH6.0磷酸缓冲溶(K2HPO4 2g, KH2PO4 8g,蒸馏水1000ml);0.85%生理盐水
四. 操作步骤
1. 发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml.
(三组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml三角瓶装液量为50ml) 2. 摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体培养基, 25?、200rpm培养
6-7天,可进行青霉素的效价测定
3.金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37?培养16-18h的斜面菌种,用0.9%的生理盐水洗下,将菌悬液稀释至波长650nm透光率为20%的溶液,需要12ml 4.生测平板的制备:生测培养基400ml,加入适当稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*6+2个平板
5.青霉素发酵液效价的测定: 发酵结束后5000rpm 离心5min(每个被测样品用3套平皿进行测定;37?培养18-24h后,量取抑菌圈直径的大小 6.填写正交实验表格,确定最适培养基配方
五. 实验结果与分析
因子水平表
水平/因子 乳糖/葡萄糖 醋酸铵 苯乙酸 1 20/10 7.0 0.7 2 22.5/7.5 8.0 1.0 3 25/5 9.0 1.3
L9(34)正交实验结果
试验号 1 2 3 4 抑菌圈
乳糖/葡醋酸苯(mm)
萄糖 铵 乙酸
1 1 1 1 1 2.148 2 2 1 2 3 1.939 3 3 1 3 2 1.7 4 1 2 2 2 1.753 5 2 2 3 1 1.898 6 3 2 1 3 1.928 7 1 3 3 3 1.85 8 2 3 1 2 1.649 9 3 3 2 1 1.528 k1 1.921.1
9 908 .858
k2 1.861.1
0 74 .701
k3 1.671.1
6 816 .906
极差 0.250.0
3 168 .205
1.95
1.9
1.85
1.8
1.75系列11.7
1.65
1.6
1.55
1.5
20.0/10.022.5/7.525.0/5.0
乳糖/葡萄糖 A/g
1.95
1.9
1.85
1.8系列1
1.75
1.7
1.65
789
醋酸铵 B/g
1.95
1.9
1.85
1.8
1.75系列1
1.7
1.65
1.6
1.55
0.711.3
苯乙酸 C/g
实验分析:
1.在试验选择的水平范围内。极差可以直接反映各个因素选取的水平变化对优化目标影响的大小。从本实验各因素极差的比较重,可根据极差的大小顺序排除因素影响的主次顺序,为乳糖/葡萄糖>苯乙酸>醋酸铵
2.试验的目的是产黄曲霉的效价,需要抑菌圈大的。从试验中可以看出乳糖/葡萄糖,苯乙酸,醋酸铵各自在水平一的时候抑菌圈最大。
3.从上图看出3个因素水平在试验范围内都没有极大值,这与理论结果有很大误差,因此还应该开展进一步的试验。
范文四:青霉素种子罐工艺影响因素的研究
青霉素种子罐工艺影响因素的研究
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ExperimentalStudyonIn?ouencingFactorofPenicillinFermentationProductioninSeeding
Tank
RENChong-lian1,2
,WANGFeng-shan1
(1.SchoolofPharmaceuticalSciences,ShandongUniversity,Jinan250012,China;2.LunanPharmaceuticalGroup
Co.,Ltd.,Linyi276000,China)
Abstract:ObjectiveTostudythein?ouencingfactorofpenicillinfermentationproductioninseedingtank.Methods
UsingPenicilliumchrysogenum8621astheexperimentalstrain,thefermentationtechnologyintheseedingtankwas
optimized.ResultsThebestcontrolconditionandtheoptimaltimefortransplantingofthestraincultureintheseeding
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KeyWords:Penicilliumchrysogenum;penicillin;fermentation;seed;optimization
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范文五:青霉素种子罐工艺影响因素的研究
食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第11期 415
青霉素种子罐工艺影响因素的研究
任崇莲1, 2 王凤山1*
(1. 山东大学药学院,山东 济南 250012;2. 鲁南制药集团股份有限公司, 山东 临沂 276000)
摘 要:目的 研究青霉素种子罐工艺的影响因素。方法 以产黄青霉菌突变株Penicillium chrysogenum 8621为实验菌种,优化种子罐培养工艺条件。结果 获得了种子罐培养的最佳控制条件与最适移种时机。结论 使用优化后的工艺条件,该菌株发酵生产青霉素的最终发酵效价提高了5 %。
关键词:产黄青霉菌;青霉素;发酵;种子;优化
中图分类号:R978.1+1 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(2010)11-0415-04
Experimental Study on Influencing Factor of Penicillin Fermentation Production in Seeding
Tank
REN Chong-lian1, 2, WANG Feng-shan1
Co., Ltd., Linyi 276000, China )
Abstract: Objective To research the influencing factor of penicillin fermentation production in the seeding tank. Methods Using Penicillium chrysogenum 8621 as the experimental strain, the fermentation technology in the seeding tank was optimized. Results The best control condition and the optimal time for transplanting of the strain culture in the seeding tank were obtained. Conclusion The fermentation titer of penicillin produced by Penicillium chrysogenum 8621 can be increased by 5 % using the optimized condition.
Key Words: Penicillium chrysogenum; penicillin; fermentation; seed; optimization
控制青霉素发酵过程是指在测量生产菌的环境条件和代谢变化参数的基础上,结合代谢调控基础理论,使生产菌沿着最佳轨迹代谢变化,实现以较低的能量和物料消耗生产更多的青霉素[1]。提高青霉素生产水平,一要不断优化发酵工艺技术,二要筛选生产菌种。优良菌种影响发酵全过程较大,是提高青霉素发酵效价的基础。本研究选择30 m3通用型发酵罐作为种子罐,在原有工艺基础上使用Penicillium chrysogenum 8621进行进罐实验。根据青霉素种子生长过程调整工艺,摸索种子罐培养工艺的最佳条件。1 材料1.1 实验材料
菌种 Penicillium chrysogenum 8621(鲁南制药菌种选育中心);蔗糖(食用级,广西凤糖);玉米浆(工业级,华北制药);硫酸铵、碳酸钙(分析纯,天津恒兴);玉米油(食用级,金龙鱼公司)。
收稿日期:2010-03-22
作者简介:任崇莲(1976-),女,山东临沂人,工程师,从事生物制药研究 E-mail:ren2007-1@163.com
*
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China; 2. Lunan Pharmaceutical Group
培养基 组成(g/L):蔗糖12,玉米浆75,碳酸钙10,玉米油0.8,硫酸铵3.5;配制方法:称量培养基各原料,投入种子罐,加纯化水,开启搅拌充分混合溶解,先按80 %定容,加30 %氢氧化钠溶液调pH 6.10,定容。1.2 设备
BX-30JS 通用型发酵罐(上海保兴)。2 方法2.1 培养条件
灭菌后培养基pH 6左右;接种量:1.4亿米孢子/m 3;罐温:25~26 ℃;罐压:0.04~0.06 MPa;通气比1.3;周期70~75 h。2.2 菌丝浓度测定
取摇匀的发酵液10 mL置于刻度离心管中,3 000 r/min离心10 min,静置后读取菌体所占体积,该体积数值的1/10 即菌丝浓度。
通讯作者:王凤山,男,教授 E-mail:fswang@sdu.edu.cn
416 食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第11期
2.3 青霉素含量测定
用剩余碘量法[2]检测摇瓶效价。准确吸取离心后发酵液的上清,然后按摇瓶效价的高低分别稀释成不同的倍数。再取样品置入2个碘瓶中,分别作为空白和样品。
2.4 米孢子数计数
取1瓶250 mL 茄子瓶装的小米培养基的米孢子(小米25 g),全部倒出,用水定容至2 000 mL,搅匀,用规格25~16格的血球计数板在显微镜下计数,计四角和中间5个中格的孢子数,所得数据即为每瓶米孢子的亿数。
2.5 采用最初工艺种子罐培养
最初发酵工艺为:(1) 种子罐配方(g/L):蔗糖12,玉米浆75,碳酸钙10,玉米油0.8,硫酸铵3.5;(2) 种子罐的灭菌后体积:约24 m3;(3) 接种孢子量:每立方米1.4亿以上;(4) 过程控制:温度25~26 ℃,压力0.05~0.06 MPa,通气量1∶3;(5) 移种条件:菌丝浓度70 %,周期60~65 h,pH 值达最低点5.60时移种。
按上述条件运行,种子罐的过程表现为:50 h 前菌丝生长代谢较缓慢,pH 变化不剧烈,菌丝浓度30 %~50 %;50 h后pH 值加速下降,菌丝浓度加速上升,60~65 h 时,pH 降至5.6左右,菌丝浓度达到65 %。分析种子罐代谢情况,要控制菌丝数量,防止菌丝过度分化,需熟练掌握影响种子罐的各种因素,找出最佳移种时机。2.6 种子罐工艺的优化试验
2.6.1 孢子接种量对种子生长的影响 在培养条件和控制条件相同的情况下,用不同的孢子接种量,观察和检测移种于发酵罐时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化,根据最终的发酵结果,确定合适的孢子接种量。
2.6.2 种子罐罐压对种子生长的影响 在孢子接种量相
同、培养条件相同的情况下,调整种子罐的罐压,观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化,根据最终的发酵结果,确定合适的罐压。2.6.3 温度对种子生长的影响 在孢子接种量相同、培养条件和控制条件相同的情况下,调整种子的培养温度,观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化,根据最终的发酵结果,确定合适的培养温度。
2.6.4 培养基浓度对种子生长的影响 在孢子接种量与培养条件相同的情况下,通过降低培养基灭菌后的体积即增大培养基的浓度,观察和检测移种时种子的生长周期、菌丝浓度、pH 的变化,根据最终的发酵结果,确定合适的培养基体积。
2.6.5 种子罐移种条件的确定 种子罐的移种标准即种子的最佳状态为:菌丝舒展、粗壮,菌丝浓度70 %左右,pH 值约5.60。3 结果与分析3.1 种子罐工艺的优化
3.1.1 孢子接种量对种子罐的影响 孢子接种量是影响下一级发酵生产代谢的重要因素。接种量过大必然加剧孢子在发芽、生长、繁殖过程中对营养物质和溶氧的竞争,导致种子液中由于菌丝体数量多、营养不足而老化断裂、发酵活性差。孢子接种量、典型种子罐生长速度相关的数据和最终发酵数据见表1。
由表1可见,接种孢子数在1.0 亿/m3左右时,发酵效价最高;小于1.0 亿/ m3时,种子罐中菌体生长相对较慢,生长周期长;大于1.0 亿/ m3时,种子罐中菌体生长相对较快,生长周期短,但两种情况下发酵效价均低于1.0 亿/ m3左右时,发酵效价比孢子接种量1.4 亿/ m3时提高了9.0 %。
3.1.2 种子罐罐压对菌种生长的影响 就耗氧发酵而言,溶氧水平是决定发酵成功的关键因素之一。在种子罐原控制工艺的基础上,用分段控制方法,即前40 h
表1 孢子接种量对种子罐的影响
批次12345
孢子接种量/亿·m -3
1.071.400.920.851.01
生长周期/h7068747572
pH 6.716.666.596.506.68
菌丝浓度/%7169686570
发酵罐效价/U·mL -17985473250766907268678520
食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第11期 417
降低罐压为孢子提供较低压环境,加快孢子发芽和生长速度;40 h 后提高罐压以抑制菌丝生长过快。调整前后典型种子罐的相关数据和最后发酵结果的据见表2。
由表2可见,降低种子罐前期的培养罐压,可以延长种子罐的生长周期,菌丝浓度相应增加,种子质量和发酵水平有较大幅度的提高。因此在种子培养过程中,分段控制种子罐的罐压:前40 h为0.06 MPa,40 h后为0.10 MPa。发酵效价提高了4.2 %。
3.1.3 温度对种子生长的影响 微生物自身的酶系统活力在最适温度范围内才得以最大发挥[3],温度是影响微生物生长发育及代谢活动的重要因素。青霉素发酵温度一般为25~26 ℃,分别用25℃和26℃两种温度的种子罐培养,考察温度对新菌种生长代谢速度的影响,结果见表3。
由表3可见,种子罐合适的培养温度为25 ℃。生长周期相同(72 h),26 ℃培养条件生物量高于25 ℃。因此生产时,可通过提高种子罐培养温度促进菌丝分化和生长。生长过快时,可适当降低培养温度抑制菌丝生长[4],以确保移种的最佳周期和发酵罐的高效价。
3.1.4 培养基消后体积对种子生长的影响 培养基成分的选择、配比与组合直接影响产生菌的生长发育和最终发酵单位。种子培养过程中既要保证菌体生长所需营养成分的适量供给,还要适当提高培养基中基质浓度以避免菌丝过早分化。在种子罐的培养基配料不变的情况下,将30 m 3种子罐消后体积由24 m 3降低为22 m3,相当于提高了培养基营养成分的浓度,30 m3种子罐消后体积调整前后,典型种子罐与生长速度相关的数据以及最后的发酵结果见表4。
表2 种子罐罐压对菌种生长的影响
孢子接种量/亿
·m -3
调整前调整后
1.061.06
40 h前罐压/MPa
0.100.06
40 h后罐压/MPa
0.100.10
种子罐移种周期/h
6872
种子罐移种pH 值
6.586.35
菌丝浓度/%6870
发酵效价/ U·mL -1
78 66581 980
表3 不同温度对菌种生长的影响
温度/℃2526
孢子接种量/亿·m -3
1.061.06
pH 6.406.55
生长周期/h
7271
菌丝浓度/%
6770
发酵效价/ U·mL -1
81 09080 745
表4 种子罐消后体积调整前后生长速度对比
灭菌后体积/m3
调整前调整后
24.022.0
孢子接种量/亿·m-3
1.061.06
生长周期/h
7072
移种pH 值6.606.40
移种菌丝浓度/%
6871
发酵效价/ U·mL-1
75 39077 958
由表4可见,在种子罐配料量不变的情况下,降低灭菌后体积,相应地丰富了培养基的营养成分,控制了菌体的生长速度,延长了种子罐的生长周期,避免了菌丝过度分化,提高了生物量和种子质量。同时发酵效价提高了3.4 %。
3.1.5 种子罐移种条件的确定 通过研究种子罐工艺,对菌种种子罐的代谢有了进一步认识。种子罐前期的孢子要从休眠状态逐渐苏醒、吸水膨胀、萌发,这个过程基本不消耗养分,所以基本不会影响种子液的pH 值。随着孢子发芽、菌丝形成,菌丝的生长代谢
产生酸性物质,pH 值逐渐下降。随着菌丝的繁殖生长,种子液黏度增大,菌丝浓度上升,利用碳源的同时消耗氧,所以溶氧量随着下降。当培养基中碳源浓度低于支持菌丝继续生长时,由于菌丝生长旺盛,即使调节通气量,因黏度太大溶氧量达到低值,pH 达到最低值[5],菌丝浓度也达到相对稳定值。随着碳源耗竭,溶氧有所回升,菌丝开始利用玉米浆中氨基酸等有机物中的碳源生长,菌丝浓度继续增加,溶氧又开始下降,随着氨基酸等有机碳源的利用,有机物中结合的氨氮释放,导致氨氮上升、pH 上升,菌丝出
418 食品与药品 Food and Drug 2010年第12卷第11期
现分化趋势进入对数生长期,这时种子罐种子具备了移种条件。根据这一代谢规律绘制了种子罐中种子的代谢曲线,见图1。
根据菌种Penicillium chrysogenum 8621在种子罐发酵过程中表现出的特性,该菌种的菌丝充分分化,pH 明显回升时,即种子处于生长的稳定期,此时是移种的最佳时期,到达此时所需的时间称为种子罐的最佳培养周期。结合种子罐的基本代谢规律和标准代谢曲线,最终确定种子罐的移种条件为:(1) 最佳培养周期72 h左右;(2) 种子液pH 值从最低点回
120100806040200
0 30 40 5054586062 64 66 68 707275
7
6.86.66.46.26 5.85.65.45.25
生长周期/h
图1 种子罐中溶氧量、生物量和pH 值变化曲线图
表5 种子罐工艺调整前后对比
孢子接种量/亿·m3
调整前调整后
1.41.06
罐压 /MPa0.05~0.06前40 h 0.06,后40 h 0.1
生长周期/h
6872
pH 6.506.40
生物量 /%
6570
消后体积/ m3
2422
培养温度 5批平均效价
/℃ / U·mL-1
25~26 78 09525 81 801
升至6.40以上时;(3) 种子液pH 开始回升约5 h;(4) 菌丝浓度达到70 %以上。3.2 重复试验
围绕确定合适的移种条件,依据实验所得数据,种子罐工艺调整前后变化见表5。
由表5可见,种子罐发酵工艺的最优条件为:(1) 接种孢子量1.0 亿/m3;(2) 罐压采取分段控制,前40 h罐压0.06 MPa,40 h后0.10 MPa;(3) 种子罐最佳培养温度25 ℃;(4) 消后体积降低8 %左右;(5) 移种pH 控制在6.40;(6) 生长周期即最佳移种时间控制在72 h。
根据调整后的种子罐工艺,5批重复试验平均发
酵效价比调整前提高了5.0 %左右。参考文献
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[5] 贺小贤.生物工艺原理[M].北京:化学工业出版社,2003:4.
本刊采用“中华人民共和国法定计量单位”,如:物质的量浓度c (M r 或A r 已准确测得时)及其单位mol/L,mmol/L,μmol/L等;或质量浓度ρ(混合物或M r 、A r 未准确测得时)及其单位g/L,mg/L,μg/L等。组合单位符号中的斜线只限 1条,如 mg/kg/d应改为 mg/(kg ? d)。单位与数值之间均空1/4字。参考文献所用计量单位,在引用时可不修改。
文中表述尽量使用国际代号和缩写,如:3 d,4 h,5 min,6 s,100 IU(国际单位); r /min(转速),P (概率),n (样本数)等。国际代号不能用于无数字的文句中,如每天不应写作每d 。非公知缩写在文中首次出现时应注明中(英)文名称。
只在必要时使用图和表。图应清晰。表采用“三线式”。图和表均应有序号和题名。图表中量和单位采用量/单位的形式,如:λ/nm;l /m;t /d。
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