范文一:_胰凝乳蛋白酶离子基团的离解常数的计算_cropped
( ) 第 30 卷 第 4 期Vo l. 30 No14 昆 明 理 工 大 学 学 报 理 工
版 ( )Jou rna l of Kunm ing U n ive rsity of Sc ience and Techno logy Sc ience and Techno logy 2005 年 8 月 A ug. 2005
α - 胰凝乳蛋白酶离子基团的离解常数的计算
邱开雄 ,付继军 ,简 虹 ,吉 玲 ,黄大荣
() 昆明医学院 化学教研室 ,云南 昆明 650031
摘要 : 研究了当离子基团从水中转至蛋白球中时 ,离解常数改变的测定 . 借助两种溶剂 —N , N —
()( ) 二甲基甲 DM F酰胺和甲酰胺 FA 模拟了近程相互作用的能量变化 . 考虑到处于蛋白球中的
离子与它们周围的电解质溶液的相互作用 ,研究了 Bo rn ian溶剂化能的变化 . 由于在酶分子中存
- 在内球静电场 ,研究了离子化能的变化 . 以上的每项效应对 A sp - 102 - CO 的能量都有较大的 2
贡献 ,且相互补偿.
α 关键词 : - 胰凝乳蛋白酶 ; 离解常数
( ) 中图分类号 : Q814文献标识码 : A 文章编号 : 1007 - 855X 2005 04 - 0120 - 05
α Ca lcu la t ion of D issoc ia t ion C on stan t of Ion ogen ic Group in - C hy try s in
Q U I Ka i2x io n g , FU J i2ju n , J AIN Ho n g , J IL in g , HUAN G D a 2ro n g
( )Facu lty of B a sic M ed ica l Sc ience s, Kunm ing M ed ica l Co llege, Kunm ing 650031 , Ch ina A b stra c t: Fac to rs de te rm in ing the change of d issoc ia tion con stan ts of ionogen ic group in to a p ro te in globu le from wa te r a re re sea rched. The change of the sho rt range in te rac tion is sim u la ted w ith the a id of two mode l so lven ts:
() ( ) d im e thylfo rm am ide DM Fand fo rm am ide FA . The change of Bo rn ian so lva tion ene rgy is stud ied w ith con2 side ra tion to the in te rac tion of ion s in side a p ro te in globu le w ith the su rround ing e lec tro lyte so lu tion. The change of ion ene rgy due to the in traglobu la r e lec tric fie ld p reexisting in the enzym e mo lecu le is a lso inve stiga ted. Each of the fac to rs listed above give s a con side rab le con tribu tion to the ion ene rgy in the ca se of A sp - 102 , and they comp en sa te each o the r to a grea t exten t.
α Key word s: - Chyiyp sin; d issoc ia tion con stan
0 引 言
活性中心的任何一个基团的 p K的变化对于酶的催化都具有很大的作用 ,一般根据这些基团在水中 的离解度 ,可推测它们离解的可能程度 ;但是 ,当从水中转至弱极性的介质 —蛋白球中时 ,这种推测则会产 生偏差 ,因为我们预测的是在弱的有机溶剂中 p K的实际变化 . 另一方面 ,在球内存在较大的电场 ,这种效 应在电离过程中不可能不表现出来 .
当由水中转至蛋白质中时 ,任何一个基团的 p K的总变化取决于离子间的静电相互作用能 、非静电的 近程相互作用和内球静电场的影响等 . 本工作的目标是 ,分析以上的贡献和提出定量的测定方法. 我们以
α 全部处在蛋白球中并不直接与外界的水接触的 - 胰凝乳蛋白酶的 A sp - 102 羧基为计算的具体对象 . 1 计算方法
考虑到内电场的影响 ,本文不打算进行离解值的静电计算 . 我们的程序是 ,从在水和其它无外电场的 介质的离解常数的实验值出发 ,而后考虑在蛋白球场的作用下 p K值的变化 . 这一程序的依据是电化学的 实验 、电极过程的特点和 V ena二级效应的理论 ,因而这些依据能解释在外电场作用下 ,反应能的变化 .
(()) 我们研究了离子和分子与周围介质的相互作用 ,众所周知 ,离子 按 Bo rn和极性分子 按 Ke rkvod的
() 收稿日期 : 2005 - 01 - 30. 基金项目 :本项目为昆明医学院科研基金资助项目 项目编号 : 03041 .
( ) 第一作者简介 :邱开雄 1964,,男 ,学士 ,讲师 . 主要研究方向 :结构化学和药物化学 .
溶剂化能的静电计算虽能给出正确的值 ,但此时所得结果的精度不大 . 产生偏差的原因是 ,静电的过程对 [ 1 ] 描述离子与邻近离子的相互作用是很近似的 ,而以远程溶剂的相互作用 ,用 B ik toff的模型较好. 应该指
) ε (ε 出 ,在转移能中 ,纯的 Bo rn ian 溶 剂 化 能 的 贡 献 一 般 比 较 小 . 例 如 , 由 = 78 水 的 介 质 中 转 至 = 37 ()( (ε ) )DM F的介质中 ,它得到的溶剂化能仅为 1 /37 ,1 /78 ,即为 1. 5 %. 但有趣的是 ,当转至蛋白球 = 4
( ) 中时 ,相应的效应增长达 1 /4,1 /78 0. 24 ,它能引起实质性的效应 .?
当酸由水中转至蛋白球中时 , p K值变化的计算 ,选择随后的步骤 . 首先 ,从水中转至模拟蛋白球介质
Δ的非水溶剂中 ,根据其实验资料的 p K值 ,这种离子和偶极的转移能 ,主要取决于与其邻近离子和偶极的
相互作用的变化 ,而不是静电作用.
酸性基团在蛋白球中的离解不同于在非水溶剂中的离解 ,即离解时 ,转至水中所形成的氢离子的离解
γ+ Δ甚至不如非水相 ,所以 ,与在蛋白质中的质子给予体的离解比较 ,不应采用 p K,而这个值要扣除 lg, H
+ γ+ —水的离子在该溶剂中的“绝对活度系数 ”,它又取决于 H 从水中转至溶剂中的能量. 众所周知 ,单个 H
离子活度系数严格的热力学测定是不可能的 ,但目前应用一些超热力学的假设 ,已拟定了测定这些值的可 靠方法.
)( 我们应用两个模型溶剂 - DM F和 FA 因它们的化学性质接近蛋白质 完成了进一步的计算. 这些溶剂原则上是不相同的 ,非质子的 DM F不可能象 FA 一样作为氢键的给予体 ,所以 ,在两个模型范围内 ,邻 近相互作用贡献的解释实质上是不同的.
第一阶段的计算是借助于模型溶剂估计邻近相互作用的贡献 ;第二阶段是离子和偶极由模型溶液转
[ 2 ] 至蛋白球中时 ,转移能的静电计算 ,在这一阶段蛋白球作为无结构的电解质研究 ,此时应考虑转移至处 于接近到蛋白质的介面的活性中心区的离子 ,它们既与蛋白球的介电质作用 ,又与外部的介质作用 ,离子
( )( ) 由一个介质 1 转至其它介质 2 中的转移能由下式计算 :
2 1 1 1 1 k 1 Δ( ( ) ) 1 ? ? G = N ?e? -- εεε2 a 2 a 4 d 212
εε这里 , N —阿佛加德罗常数 , e—电子的电荷 ,和 —统计的介电率 , a —离子半径 , d —界面至离子中心 1 2
的距离.
第一 、二项描述在介质 2和 1中离子电荷能 , 第三项是离子在介质 2中与它们在介质 1中的离子氛相互
(作用有关的能量 离子及其离子氛间的距离等于 2 d, 在研究电荷过程时 , 在 B o rn ian 溶剂化能项中 , 出现补
) 偿因子 1 / 2 . [ 3 ] ( ) 计算离子氛力的方法 是以伪金属 k = 1 和相应于整齐的半球形式的近似蛋白球作为外部介质为
() ( ) ( ε) φ根据来描述的 引出了三种离子氛 . 仿效方程 1 的结论 , 我们计算了溶剂化能 , 以 1 / 2替代了 2 i ?
(ε) φ后一项 , 这里的 是所有离子氛在离子中心构成的势 , 水 = 78 是实际反应的外部介质 , 所以 , 计算静 i 1
() (ε ε) 电贡献必需先计算离子由模型溶剂 M. S转至假想溶剂 = 的能量 : H O 2 2 N ?e ?1 11 Δ) ( )G 2 = - εε2 a H OM. S2
选择正确的离子半径是静电计算中最复杂的问题 , 显然 , 离子的有效半径应大于它非溶剂化的晶体衍 射半径. 因为 , 首先 , 应用这个半径计算的能量总是高于 B o rn ian溶剂化能 , 其次 , 此时并未考虑与邻近介质 的特殊相互作用. 对于不同的模型溶剂应考虑到这些特殊的差值 , 所以 , 以下将研究对每一种具体情况的
离子半径的选择.
偶极在能量中的静电贡献由以下方程计算 :
2 μ 1 ( )Δ3 G= - N ? ε ε - + 1 s 32 d
μ这里的 是偶极矩 , 其余的符号与前相同. 考虑到 , 当键离解后 , 遗下的偶极的变化不大 , 所以偶极对总的
(μ ) 溶剂化的贡献也不大 , 仅限制了一个偶极 , 即无离解时的键 O - H = 1. 5 D , 半径为 0. 2 nm 的超溶剂化 的计算. 要计算偶极与外部介质的相互作用 , 则应从分别带有电荷的 O 和 H 原子构成的离子氛的势能出
) ( 122 第 30卷昆 明 理 工 大 学 学 报 理 工
版
发 , 象对离子一样的进行计算 .
() ε第二阶段是对介电常数为的无规则球的离子 或偶极矩 的模型系统的计算. 第三阶段是对酶球结 2
构的计算 , 由于它们的刚性 , 而构成了被研究离子的外层 , 所以 , 它们的存在与静电场无关.
事实上 ,离子与内静电场的相互作用在一定程度上与定向极化的溶剂化能类似 ,在这里同样发生与固
定偶极间的相互作用 ,但是 ,在定向偶极的球中实际上与离子的存在无关 ,这就构成了原则的差异 ,所以 ,
当在各向异性的液体中 ,离子的溶剂化能在任一点都相同时 ,这一贡献与被研究离子的定域密切相关.
在进行具体的模型计算以前 ,还必需讨论一个问题 ,即活性中心离子基团间的氢键问题 ,我们采取以 下的氢键分布作为所有处于中性状态的基团的最佳构型 :
按照 [ 2 , 3 ]的的资料认为 ,在天然的丝氨酸蛋白酶中不存在 H is - 57 - ImSe r - 195 - OH 氢键 . 当由 ( )( )?转至 ?时 ,并不影响氢键的总数 ,在这里没有标明 A sp - 102 羧基的另一个氢键 ,因为在离解时它
们仍然保留原有的氢键不变 ,对于天门冬氨酸离解的状态最佳构型是保留相同数目的氢键 .
( )( )如果 O 原子是阴离子的一部分 ,则 N - H O 氢键更牢固 ,因此从结构 ?转至 ?时氢键系统的
- 能量增加 ,但是我们在一级近似的的情况下 ,将 N - H O 键的能量分为两部分 ,即中性氢键 N - H O 的
( )( ) 能量和 N - H 偶极与负电荷的静电相互作用的能量 ,在这一近似中 ,对于结构 ?和 ?的中性状态的
贡献可能是恒定的.
2 计算结果及讨论
现在计算 A sp - 102 的 p K值 ,我们用 DM F作为第一个溶剂模型 ,该溶剂的特点是与阴离子的范德华 [ 4 ] 作用很弱 ,按一系列羧酸的 p K值的资料 ,当由水中转至 DM F中时 , p K值提高到 6. 1 ?0. 2,文献 [ 1 ]指
+ γ出 ,它们间的偏差不会高于 0. 2 , lg= - 2. 5 即 DM F对质子的溶剂化比水强 . 因而 ,对于我们有趣的是 H
+ Δγ()p K - lg= 8. 6 等价于 + 0. 507 eV 的值 ,即在模型溶剂中 ,对羧基离解和在水中氢离子的产量都是极 H
- 为不利的 ,主要因为未考虑邻近相互作用能 . 在 DM F中 , CO 离子不形成氢键. 而中性的羧基形成一个氢 2 - -键 ,与此相反 ,在蛋白球中无论是 CO 或是 COOH 都形成四个氢键 . A sp - 102 离解后使 A sp - CO HN 2 2 [ 4 ] ( )( ) H is - 57 咪唑基 键的能值更有利 . NH O 键的平均能值约为 14. 63 kJ 0. 157 eV ,相应于校正后的 Δγ+ p K - lg值为 6. 0.H - - 现在来估计 CO 的有效半径 . 考虑到氧原子的范德华半径和邻近 C —H 键的碳原子的屏蔽 CO 离 2 2 子的特征大小约为 0. 50 nm ×0. 32 nm ×0. 36 nm. 我们取直径为算术平均值的球代替该离子的大小 ,即球 半径为 0. 2 nm ,考虑到邻近相互作用的离子被球部分包裹应在该值上加一个校正值 ,在 DM F中 , C —H 键 的氢原子对阴离子的旋转 ,故对于 0. 2 nm要加上 0. 06 nm ,即为氢原子范德华半径的一半 . 在 DM F中 ,对键
- 的所有偶极未考虑邻近相互作用 ,于是离子半径则取 0. 26 nm. 应当指出的是 ,如果 CO 离子是具有半轴 2 为 0. 310 ×0. 235 ×0. 235 nm的椭圆球 ,并应用金属椭圆球表面势计算该球的能量 ,其结果仅比具有半径为
0. 26 nm的球的能量高 0. 4 %.
当半径为 0. 26 nm的离子从 DM F 中转至蛋白球中的 A sp - 102 的羧基的位置时 ,计算能量的损失为
(εε )0. 440 eV ,这是当蛋白球的 = 4 时 ,球面离球的中心为 0. 16 nm时 其它值的结果列于表 1 计算得的结
( 果 . 由于邻近相互作用或是静电能都很弱 ,所以得到很大的总能量损耗值 0. 765 eV ,则应是很弱的酸 p K
) 为 17 ,它的酸离解是不真实的 ,而结果确发生实质性的内球静电场的补偿效应. 多肽链和它的偶极及离 子在 A sp - 102阴离子的中心构成了很大的正的势能 ,而获得了很大的能量 ,即在 4D和 6D的变体中分别计
算得 0. 479 eV和 0. 718 eV. 这一效应主要补偿了溶剂化能损失 ,考虑所有的其它因素 ,则较大地减少了这
(ε) 种效应 见表 2 ,而使自由能分别提高了 0. 317 eV和 0. 078 eV ,即使 p K提高了 5. 4 和 1. 3 个单位 . 从 3
变为 6 , - ?p K为 5. 6,5. 2和 0. 2 ,2. 5 结果无实质性的变化 ,
[ 5 ] γ + 第二个模型溶剂是 FA ,当羧酸由水中转至 FA 中时 , p K的平均变化值 ?p K = 1. 85, lg= - 0. 7 , H
γ+ 因此 ?p K - lg为 2. 55 ,效应比非质子的 DM F较大的减少 ,因为在 FA 中溶剂和阴离子间保持有较弱的 H - 氢键 ,在 FA 中和在蛋白球中 ,无论对于 COOH 或是 CO 氢键数都是相同的 ,故不须校正 . 2
表 1 溶剂化能的变化对 A sp - 102 - COO H离解能的贡献 ( eV) 在 FA 的 模 型 中
Ta b. 1 C on tr ibu t ion of the chan ge of so lva t ion en ergy to 对 Bo rn ian 溶 剂 化 能
the ion iza t ion en ergy of A sp - 102 - COO H 进行静电计算时 ,须研
Δγ()二 FA p K - lg= 8. 6 ?0. 507 eV + H Δγ()FA p K - lg+ = 2. 55 ?0. 150 eV 究电荷 与 介 质 的 相 互 H 氢键的校正为 - 0. 152 eV作用能 ,即处于球界面 ε ε 为以下值时球蛋白中的转移能为以下值时球蛋白中的转移能基 团 基 团 的牢固 的 邻 近 相 互 作 3 4 5 6 3 4 5 6 - - 用 ,所 以 , 在 该 球 体 中 CO 离子0. 611 0. 440 0. 388 0. 269 CO 离子0. 554 0. 409 0. 324 0. 266 2 2 包裹了与 O 连接成氢 OH 偶极- 0. 039 - 0. 03 - 0. 04 2 - 0. 033 - 0. 027 - 0. 023 0 - 0. 024 - 0. 020 OH 偶极
键 N —HO 的 NH - 基 ,这个球体的平均半径等于 0. 295 nm ,在 A sp - CO 的能量的静电贡献是 0. 409 eV ,离解的总能量损耗 2
() 等于 0. 526 eV 见表 1 .
既然在 FA 的模型中我们包含了蛋白球中邻近相互作用的氢键 ,就应从内球势场中由偶极基团与 A sp
- - CO 形成的氢键中除去 ,这就意味着 ,在 FA 的溶液中的四个氢键 N —H O 的能量等于在蛋白球中相 2
应的键能 . 象在 FA 中一样 ,在蛋白质中 ,氢键的能量会使它的静电组成相对偏低 ,因为在具有低介电常数 的介质中静电能较大 . 与 FA 的模型相反 ,在 DM F的模型中 ,我们计算了偶极 O —H 和 N —H 与天冬氨酸 盐的电荷形成氢键的相互作用 ,即相应的贡献并不偏低 . 这可能在 FA 中计算的 p K值比在 DM F中更加密
() 切相关 见表 2 .
ε表 2 电荷与 = 4的内球静电场的相互作用在 A sp - 102 - COO H离解能中的贡献 除去四个氢键所构成
Ta b. 2 C on tr ibu t ion of the in tera c t ion of the cha rge an d in tra g lobu la r e lec tr ic 的势能 , 而降低了内球静 εf ie ld(= 4 ) to the ion iza t ion en ergy of A sp - 102 - COO H 电 场 的 能 量 , 其 值 为 二甲酰胺甲酰胺基 团 (0. 34 eV和 0. 36 eV 相 应 6D 4D 6D 4D - ) 于 6D 和 4D 的 变 体 , 所 CO 离子- 0. 718 - 0. 479 - 0. 352 - 0. 091 2
以 ,在 FA 的 模 型 中 比 在 OH 偶极+ 0. 025 + 0. 025 - 0. 005 - 0. 005
在 H is - 57中 NH 偶极的位置改变DM F的模型中 ,其溶剂耗 + 0. 006 + 0. 006 + 0. 006 + 0. 006 ()见 ?、?式 损能减少 , 而与内球场相
互作用所得的能量则增加 ,结果两个模型计算的能差并不大 ,即为 0. 10 ,0. 12 eV , p K为 1. 65 ,2. 0 个单
Δ位 . 用两个相似模型的一套参数进行计算 ,得到相似的结论 ,若用两个完全不同的模型 ,它们的 p K值虽 差 6 ,7 ,对它们计算的结果也是比较吻合的 .
在以上的计算中阴离子的电荷中心定域在两个氧原子的中间 ,这只适用于在对称的环境中的离子或自由离子 ,但在蛋白球中离子的环境则是不对称的 . 在 O原子上的内球静电势为 0. 28 V比离子中心正 ,而 δ 2
() O为 0. 15 V比离子中心负 对于 4D 的变体分别为 0. 18 V和 0. 06 V ,因而 ,在这种情况下 O原子的负电δ δ 1 2 - + 向中心移 动. A sp —O 周 围 分 布 的 不 是 中 性 的 Im , 而 是 阳 离 子 ImH , 故 静 电 势 减 少 为 + 0. 19 eV和 2
)( ( ) - 0. 09 eV 6D 的变体 及 + 0. 11 V和 - 0. 01 V 4D .
- O O
[ 4 ] 但应着重指出 ,与羧基的两种形式 C 和 C 的能差 ?1. 5 eV相比势能差并不大 ,所以 ,全
- O O
) ( 124 第 30卷昆 明 理 工 大 学 学 报 理 工
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部电荷定域在一个氧原子上而使共振能的损失不大 ,电荷重心的较小移动在该近似计算中可认为是正确
的 . 而我们的计算仅限于电荷重心移动不大的情况 ,所以本计算的假设可认为是正确的.
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范文二:蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查
蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调
查
2007;33(1)蚕业科学CANYEKEXUE133
蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查
赵秀振赵巧玲唐顺明沈兴家'徐安英,张国政,郭锡杰,
(中国农业科学院蚕业研究所,农业部家蚕生物技术重点开放实验室,镇江212018;江苏科技大学,镇江212003)
摘要胰凝乳蛋白酶抑制剂(CI)为昆虫体内重要的调控因子,是昆虫体内免疫系统的重要组成部分.通过非变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳和活性染色方法,对2O个蓖麻蚕品种血液CI的种类进行了调查.在碱性聚丙烯酰胺凝胶
电泳中检测到7种CI,定名为E—CI1,E.CI2,E—CI3,E—CI4,E.CI5,E—CI6,E.CI7;在酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳中检
测到2种cI,定名为E—CIa,E?CIb.对同一蓖麻蚕品种不同发育时期血液cI的调查显示,cI5的活性有随5龄期经
过而递增的趋势.
关键词蓖麻蚕;血液;胰凝乳蛋白酶抑制剂;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
中图分类号$885.2文献标识码A文章编号0257—4799(2007)O1—0133—05 InvestigationofChymotrypsinInhibitorTypesFr0mHaemolymph
oftheEriSilkworm,Philosamiacynthiaricini ZHAOXiu.Zhen'ZHAOQiao.Ling''TANGShun—Ming''SHENXing—Jia''XUAn—Ying''
ZHANGGuo—Zheng''.GUOXi—Jie''
('TheKeyLaboratoryofSilkwormBiotechnology,MinistryofAgriculture,SericulturalRes
earch
Institute,ChineseAcademyofAgriculturalSconces,ZhenjiangJ~ngsu212018,China;
JiangsuUniversityofScienceandTechno#gy,ZhenjiangJengsu212003,China)
AbstractChyrnotrypsininhibitors(CIs)ininsecthaernolymphplayamajorfunctionofproteinasecontrollingwhich
iSessentiaItOIife.andtheyarealsoimportantfactorsininnatejmmunesystem,ByusingacidandalkalineNative—
polyacrylamidegelelectrophoresisfollowedbyactivitystaining,thepolymorphismofCIsintwentystrainsoferisilk?
worm,Philosamiacynthiaricini,wereinvestigated.SeventypesofCIs,designatedE—
CI1,E—CI2,E?CI3,E—CI4,E—
CI5.E.C16andE.C17byalkalineNative.PAGE.andtwotypesofCIs,designatedE—
ClaandE—CIbbyacidNative?
PAGEweredetected.respectively.InvestigationofCIsactivityofdifferentdevelopmentalstagesfromthesarne
strainrevealedthatCIsgraduallyincreasealongwiththedevelopmentoflarvaeinthefifthinstar,
KeywordsPhilosamiacynthiaricini;Hemolymph;Chymotrypsininhibitor;Native?PACE 蛋白酶抑制剂(proteinaseinhibitor,PI)是对蛋
白酶分解活性具有抑制作用的一类小分子蛋白或多
收稿日期:2006—09—05
资助项目:国家重点基础研究发展计划"973"项目(编号2005CB一
121000);江苏省自然科学基金前期预研重大项目
(编号BK2004206);江苏省高技术研究计划(农业)
(编号BG2005302).
作者简介:赵秀振(1976一),女,河北,硕士研究生.
E?mail:zhaoxiuzhen66@126.com
通讯作者:赵巧玲,研究员.
E—mail:qlzhao302@126.com
肽,为生物体内免疫系统的重要组成部分,在生物体
的一系列生理,病理过程中发挥着关键性的调控作
用.迄今为止,根据蛋白酶抑制剂所作用酶的活性
基团不同及其氨基酸序列的同源性,将P1分为4 类:丝氨酸蛋白酶抑制剂,巯基蛋白酶抑制剂,金属 蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂.胰凝乳蛋白酶 抑制剂(chymotrypsininhibitor,CI)是一类对胰凝乳 蛋白酶具有抑制作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂,广泛 存在于昆虫血液中.早在1960年,Peanasky等?报 道了来自蛔虫体内的CI,其后Kang等在黄果蝇
l34蚕业科学2007;33(1)
(Drosophilamelanogaster)体液中纯化了一种可抑制 牛一胰凝乳蛋白酶和蚊成虫胰凝乳蛋白酶的PI,但 对胰蛋白酶没有抑制活性,pH值和热稳定性都很 高.Hanschke等实验证明在7个不同目昆虫血 液中有蛋白酶抑制剂的存在,这些抑制剂中多数对 注射到血液中的灭活菌有抑制作用,并且随着致死 浓度的增加,对胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,链酶蛋白 酶P以及假单胞杆菌铜绿素胞外蛋白酶的抗性也 增强,认为这些PI可能是昆虫血液中抗菌防御系统 的一种活性因子.
1982年,Eguchi等报道了在家蚕(Bombyx mori),柞蚕(Antheraeapernyi),蓖麻蚕(Philosamia cynthiaricini)血液中存在对牛胰蛋白酶和牛一胰凝 乳蛋白酶具有抑制作用的因子,通过凝胶过滤技术, 在家蚕血液中分离到的3种蛋白酶抑制剂.不同 蛋白酶的抑制活性不同,而且有不同的热稳定性,在 柞蚕和蓖麻蚕血液中分离的蛋白酶抑制剂热稳定性 很强.1984年,Eguchi等通过凝胶电泳方法对 126个家蚕品系血液蛋白酶抑制剂的多样性进行了 调查,发现了8种cI,经遗传多样性分析认为在品
种间存在着多型性.Sasaki等从家蚕血液中分离 出了2种PI,它们分别对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 有抗性.Fujii等'通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对家 蚕的CI进行检测,发现在家蚕的血液中至少存在 16种CI.说明胰凝乳蛋白酶抑制剂在鳞翅目昆虫 尤其是蚕蛾科昆虫血液中广泛存在.本试验通过非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native—PAGE)和活性染 色方法,对20个蓖麻蚕品系血液CI的种类分布进 行了初步调查,有助于进一步开展蓖麻蚕生长发育 以及生理机制研究.
1材料与方法
1.1材料及主要试剂
试验用蓖麻蚕品种20个,家蚕品种7个,均由本 所保存.蓖麻蚕品种为斑马A,斑马B,徐一,花蓝, 南一,754,51甲,51乙,白黄,高一,印黄,闽75,蓖樗 A,蓖樗B,斑樗A,斑樗B,闽A,闽B,闽白,海黄,家 蚕品种为菁松×皓月,P50,三眠A,NG1,白玉,雪 松,C108.
主要试剂:仪一chymotrypsin,N—acetyl—DL—phenylM— anine—B—naphthylester,tetrazotized0rth0一dianiside为 Sigma公司产品,N,N'一dimethyl—formamide,Acrylam— ide,N,N—methylenebisacrylamide,TEMED为进口分装 产品;其他试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1血液样品的采集取蓖麻蚕和家蚕5龄幼 虫,用针刺破腹足,在冰上收集血液于1.5mL加有 少量的苯基硫脲的eppendof管中,5000r/min4? 离心10min,上清一20?保存备用.
I.2.2Native.PAGE参照DavisJo]的方法配置酸
性(pH4.0),碱性(pH8.3)非变性聚丙烯酰胺凝胶 和电极缓冲液,浓缩胶和分离胶的体积分数分别为 3.3%和8.2%.在两种缓冲体系下将收集的血液 直接上样于非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳.分别 在4?以恒定电流10mA电泳3—4h.
1.2.3CI活性染色经过Native—PAGE后,采用J0一 seUrielll的方法并略加改动,检测凝胶中CI活性. 2结果与分析
2.1蓖麻蚕血液中的C1种类
将采集的20个蓖麻蚕品种5龄第5天的血液, 分别在酸性和碱性缓冲体系下进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳和活性染色,结果如图1,2.在活性染色条件 下,由于N—acetyl—DL—phenylalanine——naphthylester
对胰凝乳蛋白酶有水解作用,使凝胶背景被染上亮 紫红颜色,但对酶.抑制剂复合物则没有水解活性, 所以在有抑制剂的区域就未被染上颜色而出现了白 色亮带,并且白色亮带的浓淡反应了抑制剂活性的 强弱.
图1显示在碱性凝胶电泳中,20个蓖麻蚕品种 中共检测到7条活性带,分别命名为E—CI1,E—CI2,E— CI3,E.CI4,E.CI5,E.CI6,E.CI7.7种CI的等电点依 次减小,其中:E.CI1,E.CI2和E—CI3等电点接近,在 所有的品种中活性都很强;E—CI4和E.CI5等电点极 为接近,不同品种呈现的带型不同,闽A,51甲,花蓝, 高一,闽75,蓖樗A,754,闽白品种共同呈现E.CI4和 E.CI5带,斑马,印黄,斑樗B,斑马A,51乙,南一, 蓖樗A,蓖樗B,斑樗A只呈现E.CI4带,白黄,闽B, 海黄只呈现ECI5带;E.CI6和E.CI7的等电点较接 近,两者活性都极弱,带型显现极淡.图2显示在酸
性凝胶电泳中,20个蓖麻蚕品种都检测到2条活性
带,分别命名为E.CIa,E.CIb,这两种抑制剂在品种间
的活性强度比较一致,但所有品种中E.CIb的活性均
明显强于E—CIa.
第1期赵秀振等:蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查135 E—CIl
E—CI2
E—CI3
E—CI4
E.CI5
E—CI6
E—CI7
1234567891011121314151617181920 1.闽A2.白黄3.斑马B4.51甲5.印黄6.斑樗B7.斑马A8.闽B9.51乙10.花蓝11.徐一l2.高一
l3.闽7514.南一l5.蓖樗A16.75417.海黄l8.蓖樗B19.斑樗A20.闽白 1.MinA2.Baihuang3.BanmaB4.No.51jia5.Yinhuang6.BanchuB7.BanmaA8.MinB9.N
o.51yi10.HuMan
11.Xuyi12.Gaoyi13.Min7514.Nanyi15.BichuA16.75417.Haihuang18.BichuB19.Banc
huA20.Minbai
E—CIa
E—Cm
图1蓖麻蚕品种5龄第5天幼虫血液的碱性Native.PAGE图
Fig.1Native—PAGEelectrophoreticpatternsofhaemolymphfromelisilkwormstrainsruninthealkalinebu
ffer
l236789l0lll2l3l4l5l6l7l8l920 1.5l甲2.印黄3.高一4.闽755.7546.白黄7.5l乙8.蓖樗A9.斑樗AlO.斑马Bl1.南一
l2.斑樗B
l3.海黄l4.斑马Al5.闽Bl6.闽Al7.徐一l8.蓖樗Bl9.花蓝2O.闽白 1.No.51jia2.Yinhuang3.Gaoyi4.Min755.7546.Baihuang7.No.51yi8.BichuA9.Banchu
A10.BanmaB
l1.Nanyi12.BanchuB13.Haihuang14.BanmaA15.MinB16.MinA17.Xuyi18.BichuB19.
Hualan20.Minbai
图2蓖麻蚕品种5龄第5天幼虫血液的酸性Native-PAGE图 Fig.2Native—
PAGEelectrophoreticpatternsofhaemolymphfromelisilkwormstrainsrunintheacidbuffer
2.2蓖麻蚕不同发育阶段血液cI活性的变化
以蓖麻蚕品种斑马A为材料,收集4龄起蚕到
5龄第6天(熟蚕)以及蛹期血液样品,分别在两种
电极缓冲体系中进行凝胶电泳和活性染色.酸性电 泳结果如图3一A,4龄期没有检测到E.CIa,4眠开始 有活性,且眠期活性强于5龄起蚕,5龄期的活性呈 上升趋势,在第4天明显增强,直到化蛹仍能检测到 活性;E—CIb从4龄第2天开始检测到活性,眠期和 5龄的变化趋势与E.CIa相同.
碱性电泳结果如图3-B所示,E—CI1,E—CI2,E- CI3和E.CI4从5龄第3天开始活性明显增强,直到 化蛹仍有较强的活性.E—CI6和E—CI7的活性在整 个蛹期都很弱,不易分辨.
2.3蓖麻蚕与家蚕的血液电泳图谱比较
如图4一A所示,在酸性Native-PAGE中,家蚕血
液共检测到4条活性带(CI-bl,CI-b2,CI-b3,CI—
b4),在蓖麻蚕血液中检测到E—CIa,E—CIb的等电点 分别与CI—b4,CI-b3相同,推测可能是CI—b4,CI—b3 的同源物.碱性Native—PAGE如图4一B所示,供试 的家蚕品种P50中共检测到3种CI(CI-3,CI一8和
cI—l3),蓖麻蚕E—CI4的等电点与CI-3相同,推测可
能是CI.3的同源物.
l36蚕业科学2007;33(1)
E—CIa
E—CIb
b4 CI—
CI_h3
CI_h2
CI_hl
12345678910
(A)
E—CIl
E—CI2
E—CI3
E—CI4
E—CI5
E—CI6
E—CI7
12345678910
(B)
A.酸性电泳图B.碱性电泳图1—10.分别表示斑马A4龄第1—2天,4眠,5龄第1—6天幼虫及蛹期
AandBrepresantNative—PAGEgelpatternmninthealkalinebufferandacidbufferrespectively.
Thesamplesoflane1to10arehaemolymphfromBanmaAfirstdayandseconddayofthe4thin
star
,
4molter,theday1to6offifthinstar,andpupalstage
图3蓖麻蚕幼虫不同龄期及蛹期的血液凝胶电泳活性染色图
Fig.3Native—PAGEelectrophoreticpatternsofchangesinchymotrysininhibitoractivityofthehaemolym
phduring
PhilosamiacynthiariciniBammaAdevelopmentofforthinstartopupal
l23456789l0
(A)
CI一3
CI-8
CI一3
CI一3
l23456789l0
(B)
E—CIl
E—CI2
E—CI3
E—CI4
E—CI5
E—CI6
E—CI7
A.酸性电泳图B.碱性电泳图1.三眠A2.P503.NG14.白玉5.雪松6.C108 7.菁松×皓月8.斑马B9.花蓝l0.闽75
AandBrepresantNative—PAGEgelpatternmninthealkalinebufferandacidbufferrespectively
1.SanmianA2.P503.NG14.Baiyu5.Xuesong6.C1087.Jingsong×Haoyue8.BanmaB9.Hualan10.Min75 图4蓖麻蚕和家蚕5龄幼虫血液Native-PAGE对比图
Fig.4Comparisonelectrophoreticpatternsofhaemolymphchymotrypsininhibitorsfromeri
silkwormandBombyxmoribyNative—PAGE
3讨论
昆虫血液中存在多种蛋白酶抑制剂,家蚕血液 中发现至少有16种CIJ.本试验通过聚丙烯酰 胺凝胶电泳和活性染色,在20个蓖麻蚕品种的血液 中检测到9种CI,说明CI在蓖麻蚕品种中也具有多 型性,但其多型性不如家蚕丰富,可能与本试验采用 的蓖麻蚕品种数量少,亲缘关系较近有关--. 蓖麻蚕血液中的9种CI类型(即E—CI1,E—CI2, E.CI3,E.CI6,E.CI7,E.CIa和E.CIb)为调查品种 所共有,其中E.CI4和E—CI5等电点极为接近,不同 品种呈现的带型不同,有的呈现E-CI4或E—CI5,有 的则是E.CI4和E.CI5共同呈现.在pH8.3Native— PAGE中,不同的CI活性强度差异较大,其中E— CI1,E.CI2和E.CI3在20个品种中都表现很强的 活性;E.CI6和E.CI7活性极弱.E—CI1,E—CI2,E— CI3,E.CI4或E.CI5从5龄第3天开始活性明显增 强,直到化蛹仍有较强的活性,表明它们的表达量与 幼虫发育时期有关.在pH4.0Native—PAGE中,E— CIa和E.CIb在品种间没有明显差异.
第1期赵秀振等:蓖麻蚕血液胰凝乳蛋白酶抑制剂种类的调查l37
如图4一B所示,在碱性Native—PAGE中,供试家 蚕品种P50(泳道2)的血液中检测到CI一3,CI一8和 cI一133种类型cI,与文献[13]的检测结果相同. 蓖麻蚕E—CI4的等电点与CI一3相同,E—CI4(或E— CI5)与CI一3(或CI-4)相对应.家蚕CI一3和CI-4为 等位基因所控制,推测E—CI4和E—CI5也为等位 基因所控制.E—CI1,E—CI2和E.CI3的等电点为中 性,与供试家蚕品种血液中的CI没有相对应的类
型,是否可能与家蚕品种的CI一1,CI-2和CI-2'相对 应,尚需进一步调查.在酸性Native—PAGE中,供试 家蚕品种中检测到4种类型的CI,即CI-b1,CI-b2,
CI-b3和CI—b4(图4一A),与赵萍等?的研究结果一 致;在蓖麻蚕中检测到E—CIa,E—CIb的等电点分别 与CI—b4,CI-b3相同,推测可能是CI—b4,CI-b3的同 源物.文献[13]分析cI-b3和cI—b4可能是CI一1或 CI一2和CI-2',那么E—CIa,E—CIb与E—CI3,E—CI2,E— CI1是否有关联还需进一步研究.
昆虫血液是昆虫重要的防御系统以及合成代谢 的场所,由于昆虫体内没有高等动物所具有的淋巴 细胞和免疫球蛋白,免疫系统主要靠蛋白酶以及相 应的抑制剂来调控'Hj.蓖麻蚕属于野生类型,在 长期的进化过程中,形成了自身独特的防御体系,与 家蚕相比,具有更强的抗逆性和适应能力.对蓖麻 蚕血液中蛋白酶抑制剂的调查,以及对其活性很强 的E—CI1,E—CI2和E—CI3等抑制剂的功能研究,将 有助于对蓖麻蚕及其他野生鳞翅目昆虫的生理,发 育以及防御体系的研究.
参考文献(References)
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范文三:两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析
生物技术通报
?研究报告?
B10TECHNOLOGY
BULLETlN
2011年第1期
两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析
陈文波
李卫国
(河南理-E大学资源环境学院生物系,焦作454000)
摘要:为研究胰凝乳蛋白酶原在鱼类中的生理功能和作用机制,利用生物信息学的方法,成功获得了鲤鱼两种胰凝
乳蛋白酶原的eDNA序列(eeCHTRl和eeCHTR2)并对其进行序列分析。结果显示,ceCHTRIeDNA含有792bp的开放阅读
框,编码263个氨基酸;eeCHTR2eDNA舍有798bp的开放阅读框,编码265个氨基酸。二者氨基端均含有18个氨基酸组成
的信号肽,同时,在成熟肽的第15和16个氨基酸(R.I)之间存在一个切割位点。氨基酸比对结果显示,eeCHTRl和ccCHTR2具备胰凝乳蛋白酶原的保守结构特征,同时二者有72.8%的同源性,且都与斑马鱼有最高的同源性,分别是93.3%和73.5%。进化分析显示,二者分别与斑马鱼和鳕鱼亲缘关系最近,与哺乳动物的亲缘关系较远。
关键词:
鲤鱼胰凝乳蛋白酶原
电子克隆表达序列标签
生物信息学
CloningandAnalysisofTwoCommonCarp
ChymotrypsinogenGenes/nsifico
ChenWenbo
(Schoolof
Resource
Li
Weiguo
University,Jiaoo454000)
and
Environment,HenanPolytechnic
Abstract:Tostudythephysiologicalfuntionsrypsinogen
andmechanismofehymotrypsinogen
infish,we
got
twomon
carpchymot—
cDNAs(ecCHTRIandeeCHTR2)successfullyusinginsilicocloning,andthenanalysedbythemethodofbioinformaties.
contained
an
TheresultsshowedthateeCHTRIeDNAeeCHTR2eDNAhad
was
a
an
openreading
frame(ORF)792bpinlength,encoding263aminoacids,and
a
ORF798bplong,encoding265aminoacids.Bothhad
signalpeptideconsistedof18aminoacids,andthere
on
cleavagesitebetweentheresudes15and16inthematuredprotein.Thealignmentandhomologyanalysisbased
theaminoacid
twotwo
sequences
revealedthatccCHTRlandccCHTR2hadconversedstructuralcharacteristics.Ithadtheidentityof72.8%betweenthe
of93.3%and73.5%tozebrafish.ThephylogenetiezebrafishandAtlanticcod,butlessrelated
Expressedsequencetag
to
tree
moncarpchymotrypsinogen.andthehighesthomologychymotrypsinogensofmoncarp
Keywords:
Commoncarp
were
showedthe
closelyrelated
to
themammalianspecies.
Chymotrypsinogen
insilicocloning
Bioinformaties
胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)(EC3.4.21.1)是胰脏分泌液中作用仅次于胰蛋白酶的一种蛋白酶,属于丝氨酸蛋白酶家族。胰凝乳蛋白酶以非活性的胰凝乳蛋白酶原(chymotrypsinogen)的形式合成并随胰液分泌出去。在小肠受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶一定地分解,转变成活性的胰凝乳蛋白酶,能专一性地水解Phe、Trp和Tyr等芳香氨基酸残基羧基侧链的肽键…。同时,胰凝乳蛋白酶也是水生生物消化系统内最为丰富的蛋白酶类之一旧-。对于金头鲷(印口兀岱aurata)的研究认为,胰凝乳蛋白酶主要分布
收稿日期:2010.07.16
基金项目:河南理丁大学博十基金项目(B2010-7)
在其消化管道,对蛋白质的降解和利用起到重要作用p’,所以胰凝乳蛋白酶在鱼体内起着重要的生理功能,研究其结构和功能对于促进水产养殖业的发展有一定的理论指导意义。到目前为止,在鱼类中关于胰凝乳蛋白酶的研究相对较少,仅仅只在斑马鱼(Daniorerio)H1、大西洋鳕鱼(能d啪nmrhu尬)is,s]、金头鲷‘”、牙鲆(Paralichthysolivaceus)¨一1等鱼类中克隆得到了基因序列并进行了结构分析。
鲤鱼(moncarp,Cyprinuscarpio)属于鲤形目
(Cypriniformes),鲤科(Cyprinidae),鲤属(Cypri一
作者简介:陈文波,男,博士,讲师,研究方向:鱼类生理学和分子生物学;E-mail:chenbo@hpu.edu.
2011年第1期陈文波等:两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析
125
nus)。鲤鱼几乎分布于北半球的所有淡水区域,特别是在东南亚和非洲。其生长速度快,肉质细嫩肥美,营养丰富,是淡水养殖鱼类中最常见的优良种类之一。为了更好地促进鲤鱼的养殖发展,本研究利用生物信息学手段克隆鲤鱼的胰凝乳蛋白酶原的基因序列,并对其蛋白结构、同源性和进化关系进行研究,为进一步深入研究奠定基础。
预测;利用NCBI中CDD数据库(://.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)进行保守区域
的预测。
1.3
同源性比较争进化分析
采用Clustalxl.83软件对多个物种的胰凝乳蛋白
酶原氨基酸序列进行比对,并用DNAStar软件包MegAlign子软件对各序列之间的同源性进行计算;运用Mesa3.1软件。采用Neighbor—Joining法构建胰凝乳蛋白酶原的系统进化树。所需的各物种的胰凝乳蛋白酶原氨基酸序列的GenBank登录号为人CTRBl(NP一001897)、人CTRB2(NP一001020371)、牛CTRBl(NP一001098800)、大鼠(NP_036668)、小鼠(NP_079859)、非洲爪蟾(AAH89075)、斑马鱼(NP_997783)、大西洋鳕鱼(CAB43766)、牙鲆CHTRl(BAA82365)、牙鲆CHTR2(BAA82366)、金头鲷CHTRI(ABE68637)和金头鲷
CHTR2(ABE68638)。
1材料与方法
1.1
鲤鱼胰凝乳蛋白酶原B基因的电子克隆以斑马鱼胰凝乳蛋白酶原B1的氨基酸序列
(GenBank登录号:NP一997783)对GenBank中鲤鱼EST数据库(taxid:7962)进行tBlastn同源性检索,将检索到的同源性较高的所有EST序列利用DNAStar软件包中的SeqMan子软件进行拼接,形成连接体(contig),从而得到鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的cDNA序列片段。1.2蛋白质结构预测与分析
用DNAtools6.0对开放阅读框进行分析并翻译成
2结果与分析
2.1
鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆结果
蛋白质;利用SignalP3.0Server((://.cbs.dtu.
利用斑马鱼胰凝乳蛋白酶原B1的氨基酸序列对GenBank中鲤鱼EST数据库进行检索分析,发现有19条鲤鱼EST序列与之有较高的匹配度(图1)。将这些EST序列进行组装,结果得到两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因cDNA序列,分别命名为鲤鱼胰凝乳蛋白酶原l(mon
carp
dk/service/SignalP)进行信号肽的预测;利用ProtParam软件(://.expasy.org/tools/protparam.html)进行编码蛋白的基本理化特性分析;利用NetOGlyc
3.1
sen,er(://.cbs.dtu.dE/services/NetOGlyc/)和
NetNGlyc1.0Server(://.cbs.dtu.dk/serv-
chymotrypsinogen1,
carp
ices/NetNGlyc/)分别进行O.糖基化位点和N-糖基化位点的预测;利用NetPhos
2.0Server(://.cbs.
ccCHTRl)和鲤鱼胰凝乳蛋白酶原2(mon
chymotrypsinogen2,ccCHTR2)。
dtu.dE/services/NetPhos/)进行磷酸化(Ser、Thr、防)
图l用斑马鱼鲤鱼胰凝乳蛋白酶原Bl基因搜索
GenBank中鲤鱼EST数据库的结果
2.2鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的结构特征分析
将推导出的氨基酸序列利用SignalP
3.0
别进行信号肽分析,发现两种蛋白均含有长度为18个氨
基酸(1一18个氨基酸)组成的信号肽序列(图2,图3)。
Server分
126
生物技术通报Biotechnology
Bulletin
201
1年第1期
下划线表示信号肽部分,粗体表示催化三联体氨基酸残基,方框表示潜在的糖基化位点,阴影表示胰凝乳蛋白酶原切除序列,星号表示终止密码子
图2鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因1cDNA序列及推导的氨基酸序列
下划线表示信号肽部分,粗体表示催化三联体氨摹酸残基,阴影表示胰凝乳蛋白酶原切除序列,星号表示终止密码子
图3鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因2
cDNA序列及推导的氨基酸序列
2011年第1期陈文波等:两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析
127
经NetOGlyc3.1Server和NetNGlyc1.0Server
分析后显示,在ccCHTRl中分别存在一个潜在的Ⅳ.糖基化位点(1。”NIT)和一个O-糖基化位点(222TSS),而在ccCHTR2中则没有发现潜在的糖基化位点(图2,图3)。利用NetPhos
2.0
Server进行
磷酸化预测,结果显示,ccCHTRl中存在8个Ser、3个Thr和2个Tyr磷酸化位点,而在ccCHTR2中则存在7个Ser和6个Thr磷酸化位点,缺失Tyr磷酸化。
利用NCBI中CDD数据库预测结果显示,两种蛋白皆含有类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶超家族所共有的结构域(Tryp—SPc),在成熟肽的第15和16个氨基酸(R—1)之间存在一个胰蛋白酶的切割位点。同时,胰凝乳蛋白酶的催化活性位点分别位于ccCHTRl的第57位组氨酸、102位天冬氨酸、195位丝氨酸和ccCHTR2的第57位组氨酸、104位天冬氨酸、197位丝氨酸。
2.3
鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的基本特性分析利用ProtParam软件分析ccCHTRl成熟蛋白,结
果显示,其245个氨基酸残基中包含3637个原子:碳原子(carbon)l153个、氢原子(hydrogen)l800个、氮原子(nitrogen)322个、氧原子(oxygen)350个、硫原子(sulfur)12个,结构式为Cll5,H。啪N3220,,。S12,其分子量为26.2kD,等电点为7.15;在氨基酸组成方面(表1),丝氨酸含量最高有27个,占27%;其次是缬
裹1鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的氨基酸组成
氨基
数目
百分比(%)
氨基
数目百分比(%)
酸CHTRl
CHTR2
CHTRlCHTR2
酸CHTRl
CHTR2CHTRl
CHTR2
Ala
19167.86.5
Leu
19
16
7.86.5
Arg
9
8
3.7
3.2
Lys8
5
3.32
Asn13
135.35.3
Met
2
4
0.81.6
Asp
tO
1l4.14.5Phe3
61.2
2.4
Cys10104.I4.0Pro14
13
5.7
5.3
GIn
6102.44.0Ser27261l10..5
Glu7102.94.0Thr18
20
7.38.1
Gly
2221
9.0
8.5
Trp
993.7
3.6
His
772.92.8
Tyr
652.42.0
lle14135.75.3Val22
24
9.09.7
氨酸和甘氨酸,均有22个,各占8%。总的带负电荷和总的带正电荷的氨基酸残基数相等,都为17个。预测该蛋白不稳定指数(instabilityindex,II)为28.7l,为稳定的蛋白,在哺乳动物体外网状细胞中的半衰期为1.2
h。
ccCHTR2成熟蛋白2.47个氨基酸残基中包含3
637
个原子:碳原子(carbon)1171个、氢原子(hydrogen)
1
804个、氮原子(nitrogen)322个、氧原子(oxygen)364
个、硫原子(sulfur)14个,结构式为C㈣H删N,∞O獬sH,其分子量为26.7kD,等电点(pI)为5.24;在氨基酸组成上(表1),丝氨酸含量也最高,为26个,占10.5%;其次是缬氨酸、甘氨酸和苏氨酸,分别含有24、21和20个。总的带负电残基(Asp+Glu)为21个。总的带正电残基(Arg+Lys)为13个。该蛋白不稳定指数(instabilityindex,II)为31.21,也为稳定蛋白,在哺乳动物体外网状细胞中的半衰期为1.2
h。
2.4鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原的二级结构分析
利用SOPMA软件分析两种蛋白的二级结构,结果表明,ccCHTRl蛋白中d螺旋(alphahelix)有40个占16.33%,延伸直链(extendedstrand)有60个占24.49%,无规则卷曲(randomcoil)有122个占到tum)有23个占9.39%;ccCH—TR2蛋白中a螺旋(alphahelix)有32个占12.96%,延伸直链(extendedstrand)有64个占25.91%,无规则卷曲
(randomcoil)有134个占到54.25%,3-转角(betaturn)
有17个占6.88%。二者在羧基端都具有一段较长的d螺旋区域。
氨基酸序列比对和同源性分析
多个物种的氨基酸序列比对利用Clustalxl.83
比对后结果(图4)显示,氨基端和羧基端的保守
度较高,中间区域则相对较低。催化活性部位丝
氨酸附近的氨基酸(第193—198位)在各个物种中全部一致(Gly?Asp—Ser—Gly?Gly—Pro)。参与形成底物结合口袋的第216、226和189位氨基酸分别为甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸。利用MegAliga进行同源性分析显示,鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原之间的同源性为72.8%。ccCHTRl与斑马鱼的同源性最高,为93.3%;其次是与牙鲆和金头鲷的2型胰49.80%,B一转角(beta2.5
凝乳蛋白酶原;而与其他物种的同源性均在60%一70%之间。ccCHTR2也是与斑马鱼的同源
128
生物技术通报Biotechnology
Bulletin
201
1年第1期
性最高,但仅有73.5%;其次是与大西洋鳕鱼为72.0%;与牙鲆和金头鲷的1型胰凝乳蛋白酶原
的同源性在70%左右,而与其他物种的同源性均在65%以下。
。}~:~.”分别表示一致的、高度保守度的和低保守度的氨基酸;阴影表示成熟肽第一个氨基酸(c,半胱氨酸)和形成催化三联体的3个氨基酸(”H,”2D和”5S)
图4胰凝乳蛋白酶原的氨基酸序列比对
2.6系统进化树分析
从GenBank上获得已知的脊椎动物胰凝乳蛋白酶原的氨基酸序列经ClustalW方法比对后,利用Mega3.0以邻位相接(N.J)构建系统进化树,结果(图5)与之前的氨基酸比对结果类似。鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原均位于同一分支上,且ccCHTRl和ccCHTR2分别与斑马鱼和大西洋鳕鱼的进化关系最近,与哺乳动物较远。
atlanficcodCTRB▲mon
carp
CHn匕
I
zebrafishCTRB▲lYlon
carp
CHTRl
flounderCHTR2
scabream
cattle
CHTRH
CTRBl
mouseCTRBl
ratCTRBl
humanCTRBlhumanCTRB2
western
clawedfrog
CHTR
l
CTRBl
3讨论
本研究利用生物信息学的手段从鲤鱼EST数据库中成功获得了两种胰凝乳蛋白酶原cDNA序列,并分别对编码的蛋白质基本性质、蛋白结构、同源性和进化关系进行了研究。鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原
flounder
scabrcamCHTILl
各分支数值代表置信度(%);鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原B
用▲标m;CHTR.chymotrypsinogen;CTRB.chymotrysinogen
B
图5胰凝乳蛋白酶原B的进化树分析
2011年第1期陈文波等:两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原基因的电子克隆及分析
129
的同源性为73%,都具备胰凝乳蛋白酶原的结构特征。例如,通过保守区域预测,两种蛋白均具有含有类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶所共有的结构域(Tryp—SPe),表明它们属于丝氨酸蛋白酶家族;在成熟肽第15—16位氨基酸之间存在一个胰蛋白酶切割位点,切割后使之成为有活性的胰凝乳蛋白酶。尽管N一端15位氨基酸切除是酶原激活所必须,但是切除后这个N一端小肽通过一个二硫键(1和122位半胱氨酸)继续与此酶分子相联系以保证该酶原受到其它非特异性的激活¨…。在鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶原中这两个半胱氨酸同样保守(ccCHTRl:l和122位;eeCHTR2:1和124位);57H、102D和”5S3个氨基酸对于胰凝乳蛋白酶活性至关重要,它们在酶发挥催化活性时形成催化三联体进行电荷的传递…o。这3个氨基酸在两种鲤鱼胰凝乳蛋白酶原中同样保守;在这个催化三联体中活性丝氨酸部位附件的几个氨基酸具有高度保守性,均为Gly—Asp—Ser.Gly-Gly.Pro¨1。这个基序在鲤鱼的两种胰凝乳蛋白酶原中同样具有。尽管二者结构类似,但也有区别:ccCHTR2在74位和75位多了两个氨基酸,分别是甘氨酸和丝氨酸;ceCHTRl的第14、15位氨基酸分别是丝氨酸和精氨酸。但在ccCHTR2中则分别是丙氨酸和精氨酸;在ceCHTRl中发现两个潜在的糖基化位点;而在ceCHTR2中则没有;ccCHTRl中存在酪氨酸磷酸化位点,而ccCHTR2中没有,另外在氨基酸组成上也有一定的差异。这些性质和结构上异同对其功能有无影响还需要迸一步研究。
以往研究发现,丝氨酸蛋白酶家族表面的两个环对酶与底物的结合较为重要¨“。环1在鲤鱼eeCHTRl中和其它大部分脊椎动物一样,氨基酸残基组成为ASGV,而在ccCHTR2中则为AAGA,这与大西洋鳕鱼中的序列一致”一1。环2的序列在各物种中的保守度相对较低,在鲤鱼ccCHTRl中氨基酸组成为STSSP,这与其他物种中类似,但在鲤鱼ccCHTR2中相对应的序列为DTTIP,变化较大。两种蛋白结构上的差异预示着鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶对底物的结合力有可能不同。
对不同物种的胰凝乳蛋白酶研究认为,胰凝乳蛋白酶A和B对底物的选择性有不同的特异性¨“。Hud6ky【141进一步研究显示,Ala226对胰凝乳蛋白酶
B的底物选择特异性有重要作用,并认为牛胰凝乳蛋白酶A和B对底物的特异性主要由这一氨基酸决定。但是,与包括斑马鱼在内的大部分物种的胰凝乳蛋白酶B不同的是,鲤鱼两种胰凝乳蛋白酶中Ala226替换成了Gly。迸一步氨基酸同源性分析表明,ccCHTR和ccCHTR2与斑马鱼CHTRBl的同源性高达93.2%和73.8%。所以,鲤鱼的两种胰凝乳蛋白酶究竟是A型还是B型,或者在鲤鱼中胰凝乳蛋白酶对底物的选择与其他脊椎动物中是否有差别。还需要结合鲤鱼的生理特点作进一步深入研究。
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BMPl5编码序列同源性低,仅为46%一51%的结果相protein。15似‘91。以上结果表明,尽管BMPl5基因在物种的进
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role
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本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swjstb201101021.aspx
范文四:胰凝乳蛋白酶原激活过程的分子动力学研究.pdf
湖南农业大学学生纠察队章程
总 则
第一条 为维护学生纠察队的良好形象,规范纠察队成员的作风养成,提高团队战斗力。结合实际情况,特制订《湖南农业大学学生纠察队章程》。
第二条 学生纠察队是由在校大学生组成的一支“自我管理、自我教育、自我服务”的校级学生组织,学生纠察队成员均为校级学生干部。
第三条 学生纠察队实行半军事化管理,隶属于校学生工作部,在业务上接受保卫处的指导。
第四条 学生纠察队秉承“展当代大学生风采,做服务同学的卫士”的队训。
第一章 队长及教导员
第五条 凡在学生纠察队队委岗位任期届满,政治思想端正、学习成绩优异,愿意带领学生纠察队成员积极工作,发扬和延续学生纠察队光荣传统,可以提出书面申请,经学工部考察任命。
第六条 队长对全队训练和勤务工作负完全责任。
第七条 队长的职责:
(一)熟悉全队情况,根据上级的指示和要求,结合实际,计划安排各项工作,切实保证贯彻执行。
(二)教育和培养队委以及业务骨干,提高其组织指挥能力和管理教育能力。
(三)带领全队严格执行校纪校规,严格组织纪律,养成良好作风。
(四)完成上级赋予的其他任务。
第八条 教导员对全队思想政治教育工作负完全责任。
第九条 教导员的职责:
(一)及时掌握队内成员的思想学习情况,做好思想政治工作,搞好内部团结,保证各项任务的顺利完成。
(二)重点抓好队风建设工作,树立纠察队的良好形象。
(三)完成上级赋予的其他任务。
(四)做好爱国教育、国防教育等活动的策划工作。
第十条 队长、教导员的权利:除享有队委的所以权利外,还享有代表学生纠察队与其它社团组织交流的权利和提名副队长侯选人的权利。
第十一条 特殊情况下,队长和教导员可从队员中直接产生。
第二章 队干部及队委
第十二条 凡在学生纠察队工作满一届,愿意在其中积极工作,发扬和延续学生纠察队的光荣传统,可以提出书面申请,经学工部考察任命。
第十三条 学生纠察队的队干部及队委必须政治思想端正,学习成绩优异,业务素质强,对所分管的工作负完全责任。
第十四条 队干部的职责:
(一)带领所分管的队员完成上级下达的各项任务。
(二)带领所分管的队员严格执行校纪校规以及《学生纠察队管理章程》,严格组织纪律,养成良好作风。
(三)完成上级赋予的其他任务,完成上级赋予的其他任务,主要承担管理工作职能,协助队长、教导员开展工作。
第十五条 队委的职责
(一)队委由队长、教导员直接管理,主要承担相应部门业务工作传授。
(二)协助本部门参与策划各项活动事务,引导队员角色转变,使其适应相关工作和队内生活,起好“传、帮、带”职责。
(三)掌握所分管队员的思想学习情况,及时做好思想政治工作,搞好内部团结,保证各项任务的完成。
(四)完成上级赋予的其他任务,协助队长、教导员开展工作。
第十六条 队干部及队委的权利:副队长及队委除享受第二十二条(一)(二)(三)(四)款所规定的权利外,有监督队长、教导员工作的权利。
第四章 队 员
第十七条 凡我校本(专)科学生,经个人书面申请,由所在学院学工组推荐,即可成为学生纠察队预备队员。
第十八条 预备队员的预备期从入队申请批复之日算起,预备期为二个月。
第十九条 预备队员必须经过严格的考察和素质训练,方可成为学生纠察队的正式队员。
第二十条 预备队员转正时,须进行入队宣誓,誓词如下:我是湖南农业大学学生纠察队队员,我宣誓:热爱湖南农业大学,热爱学生纠察队,服从命令,听从指挥,严守纪律,忠于职守,努力工作,坚决完成任务,展当代大学生风采,做服务同学的卫士。
以上誓词,我坚决履行,决不违背。
第二十一条 队员的职责:
(一)努力学习政治,不断提高思想觉悟。
(二)服从命令,听从指挥,坚决完成任务。
(三)积极学习科学文化知识,提高文化素质。
(四)严守纪律,服从管理,尊重师长,团结同学,爱护集体荣誉。
第二十二条 队员的权利:
(一)有权参加学生纠察队的有关会议,接受政治思想教育和培训。
(二)有权参加执勤活动,并按规定行使其职能。
(三)有权对学生纠察队的工作提出建议或倡议。
(四)有权行使表决权、选举权及被选举权。
(五)有权监督队委的工作。
第二十三条 学生纠察队的队员除规定范围内的职权外,不得谋求任何私利和特权。
第四章 机构设置及主要职责
第二十四条 学生纠察队设置有办公室、国旗班、保卫部、晚巡部、宣传部、信息部、女生部、内勤部。
第二十五条 办公室。负责学生纠察队文书、财务管理和日常事务的处理;协调各部门工作的开展。
第二十六条 国旗班。负责学校的日常升降旗以及学校大型活动的仪仗任务。
第二十七条 保卫部。负责学校大型活动的安全保卫工作。
第二十八条 晚巡部。负责校园内的日常巡逻和突发性事件的处理。
第二十九条 宣传部。组织开展各类文艺活动,培养队员的艺术情操,丰富队员的课余生活,宣传队内先进事迹。
第三十条 信息部。负责校园内各类信息的收集与反馈,开展失物招领的工作。
第三十一条 女生部。负责开展队内及学校女生文化活动。
第三十二条 内勤部。组织开展学生宿舍(公寓)的内务卫生学风纪律检查工作,协助上级部门认真做好园区管理的各项评奖评优工作。
第五章 着装仪容
第三十三条 队员执勤时必须按照规定着装、佩带工作证,保持军容严整,维护学生纠察队的良好形象。
第三十四条 严禁队员将制服借与其他同学以及社会人员使用。严禁在非执勤时段着制服离开学校。
第三十五条 当接到执勤巡逻以及大型活动保障任务时,应当按规定着装,严禁着便装出勤。
第三十六条 队员应当随时保持仪容整洁,男队员不得留长发和胡须;女队员不得烫发和佩带耳环、项链、戒指等首饰。队员均不得染与原发色不一致的颜色。
第三十七条 队员执勤必须举止端正,谈吐文明,精神振作,姿态良好。不得袖手背手和将手插入衣袋,不得搭肩挽臂,不得披衣敞怀、挽袖卷裤腿。
第六章 奖 励
第三十八条 奖励的目的在于鼓励先进,调动全体队员的积极性、创造性,提高团队精神,确保执勤、训练和其他各项任务的完成。
第三十九条 奖励应当坚持下列原则:
(一)严格标准,按绩施奖;
(二)发扬民主,严格审批;
(三)以精神奖励为主,物质奖励为辅。
第四十条 奖励权限:按编制员额的10%评选每月先进个人,评奖权限由学生纠察队执行;按编制员额的10%由学工部每年评选一次年度优秀。
第四十一条 评优的参考依据:
(一)个人在遵守纪律、在执勤、训练或者完成其他任务中表现突出者;
(二)对学生纠察队的发展献计献策作出贡献者或争得荣誉者;
(三)参与省级竞技比赛活动为学校争得荣誉者;
(四)坚决执行命令,正确指挥,密切协同,在组织指挥完成任务中表现突出者。
第七章 处 分
第四十二条 处分的目的在于严明纪律,教育违纪者,加强集中统一,巩固和提高团队战斗力。
第四十三条 处分应当坚持的原则:
(一)依据事实,惩戒恰当;
(二)纪律面前人人平等。
第四十四条 处分项目:
(一)警告;
(二)严重警告;
(三)留队察看;
(四)开除出队。
第四十五条 处分应当根据违纪者所犯错误的事实、性质、情节以及影响,本人一贯表现和对错误的认识等情况,按照处分项目慎重实施。
第八章 军事技能训练
第四十六条 学生纠察队定期进行军事技能训练,正式队员每周出操不少于4小时。
第四十七条 队员训练内容、动作要领参照《中国人民解放军队列条令》执行。
附 则
第四十八条 学生纠察队各部门管理细则另行规定。
第四十九条 本章程由湖南农业大学学生纠察队负责解释,由校学生工作部指导、监督实施。
二??七年四月第一次修订
二?一?年七月第二次修订
二?一一年七月第三次修订
范文五:CdTe量子点对胰凝乳蛋白酶的荧光标记
第27卷第2期分析测试学报Vol 127No 12 2008年2月FENX I CESH I XUEBAO (Journal of I nstrumental Analysis ) 188~191
CdTe 量子点对胰凝乳蛋白酶的荧光标记
陈启凡1, 2, 杨冬芝, 王文星, 徐淑坤111
(1. 东北大学 化学系, 辽宁 沈阳 110004; 2. 辽东学院 实验中心, 辽宁 丹东 118003)
摘 要:用巯基丙酸作为表面修饰剂在水相中制备了稳定的CdTe 纳米量子点。利用量子点外层包被的巯基
丙酸上的羧基, 实现了量子点与胰凝乳蛋白酶的直接偶联。偶联后溶液的吸光度值略有增大而吸收峰位不
变, 同时荧光强度明显增强, 荧光发射峰位稍有蓝移。通过荧光发射光谱确定了CdTe 量子点与胰凝乳蛋白
酶偶联的最佳反应条件为:pH 910, 反应温度37℃, 反应时间115h 。重点考察了NaCl 浓度和胰凝乳蛋白酶
浓度对量子点与胰凝乳蛋白酶偶联产物荧光强度的影响。
关键词:CdTe 量子点; 胰凝乳蛋白酶; 生物标记; 荧光探针
中图分类号:T L27115; Q783. 1 文献标识码:A 文章编号:1004-4957(2008) 02-0188-04
The Fluorescence Labeling of Chy motryp sin by CdTe Quantu m Dots
CHEN Q i 2fan 1, 2, Y ANG Dong 2zhi , WANG W en 2xing , XU Shu 2kun 111
(1. Depart m ent of Che m istry, Northeastern University, Shenyang 110004, China;
2. Experi m ent Center, L iaodong University, Dandong 118003, Ab s trac t:Stabilized CdTe quantu m dots were p repared s t op r op i 2onic acid (MP A ) as the surface modifier . W on the surface of CdTe
QD s, direct conjugati on of A slight increase of the s oluti on ab 2s orbance but or p on peak was observed and the fluorescence intensity
was a n m blue shift of the fluorescent e m issi on peak . The op ti m um pH,
reacti on te and ti m e f or conjugating the CdTe quantum dots with chy motryp sin were 910,
37℃and 115h, res pectively . The effects of NaCl and chy motryp sin concentrati on on fluorescence
intensity of QD s 2chy motryp sin s oluti on were discussed .
Key wo rd s:CdTe quantum dots; chy motryp sin; bi o 2labeling; fluorescence p r obes
量子点(quantu m dots, 以下简称QD s ) 是一种半导体纳米晶体, 它具有巨大的比表面积、小尺寸效应和化学反应活性。与传统的有机染料荧光探针相比, QD s 的激发光谱宽, 且连续分布, 其发射光谱呈对称性且半峰宽较窄, 颜色可调。基于QD s 的这些优良光谱特性和光化学稳定性, 使其与生物体或生物大分子通过特殊的相互作用链接并作为荧光探针在生物分析方面取得了很大的进展[1-3]。QD s 用
[4-5]于荧光探针一般通过偶联的方式与生物分子结合, 偶联的方法主要有共价结合法和静电吸附法
科学中具有广阔的应用前景[6]。QD s 稳定性好、荧光杂质少、不易漂白、与生物体链接后不影响其活性、特异性高, 从而使其在生命。
胰凝乳蛋白酶是一种丝氨酸肽链内切酶, 主要切断以芳香族氨基酸或带有较大非极性侧链的氨基酸羧基形成的肽链。它有着许多重要的生理、生化功能, 如蛋白质的消化、凝血、溶血栓、痛觉敏感、受精等, 所以一直是人们研究的热点。本文在水相中合成了巯基丙酸包被的单分散的CdTe 量子点, 并将其与胰凝乳蛋白酶进行偶联。根据荧光发射强度进行优化, 确定了量子点与胰凝乳蛋白酶的偶联反应条件, 考察了NaCl 浓度和胰凝乳蛋白酶浓度对量子点与胰凝乳蛋白酶偶联产物(QD -chy motryp sin ) 荧光强度的影响。该研究为量子点作为荧光探针进一步用于生物大分子的检测提供了有益的参考。收稿日期:
基金项目:
第一作者:
通讯作者:2006-12-15; 修回日期:2007-02-13国家自然科学基金资助项目(20675011) ; 教育部博士点基金资助项目(20021045001) 陈启凡(1964-) , 女, 辽宁铁岭人, 教授, 博士研究生徐淑坤, Tel:024-83681343, E -mail:xushukun46@1261com
第2期陈启凡等:CdTe 量子点对胰凝乳蛋白酶的荧光标记189
1 实验部分
111 仪器与试剂
LS 255荧光分光光度计(美国Perkin El m er 公司) ; 紫外可见分光光度计(北京瑞利公司) ; 往返气浴恒温振荡器(江苏金坛) ; Phili p s E M 420透射电镜(Holland, 工作电压100k V ) ; X ’Pert Pr o MP D 衍
α, 波长01154060nm , 管电压40kV, 管电流40射仪(荷兰P ANALYTI CALB. V. , X 射线源为CuK
mA ) ; pHS 23C 型酸度计(上海雷磁分析仪器厂) ; 所有测试均在室温下完成。碲粉(Te, 991999%) , 氯化镉(CdCl 2?215H 2O ) , 硼氢化钠(96%) , 中国医药集团上海化学试剂公司; 32mercap t op r op i onic acid (MP A , 巯基丙酸) (Fluka 公司) ; 胰凝乳蛋白酶(chy motryp sin ) (Sig ma 公司) ; N 2hydr oxysuccini m 2ide (NHS, N 2羟基琥珀酰亚胺) (Ne w Jersey 公司, US A ) ; L 2甘氨酸(鼎国生物技术有限公司) ; 所用水为3次蒸馏水。
112 巯基丙酸包覆的CdTe 量子点的制备[7]
在氮气饱和的100mL 浓度为0102mol/LCdCl 2水溶液中加入418μL 巯基丙酸, 用011mol/LNa OH 溶液调节pH 值在912左右, 剧烈搅拌下用N 2脱氧20m in, 然后迅速加入新制备的无氧碲氢化
2+2-钠溶液(Cd 、Te 、MP A 的摩尔比为1∶015∶214) , 继续搅拌20m in, 得桔黄色透明CdTe 量子点
原溶液。取一定量CdTe QD s 原溶液加入到聚四氟乙烯反应罐中, 将罐密封, 然后放入烘箱中, 在140
2-℃下加热不同时间, 得到不同尺寸的CdTe QD s 胶体水溶液, 以Te 计合量子点浓度是
1×10-2mol/L。
113 量子点与胰凝乳蛋白酶的共价偶联
-42-取500μL 浓度为5×10Te ) CdTe QD s 溶液, 用100μL 100
mg/L的NHS 01磷酸盐缓冲溶液(P BS, pH 910) 混匀, 放置大约10m in 后Na pH 值到910, 加入100μL 110g/L的胰凝乳蛋白酶溶液, 放在37℃115h, 然后
加入100μL 110mol/L的L 2甘氨酸终止反应, 所
得混合液稀释到一定浓度后进行测定。
2 结果与讨论
211 CdTe 量子点溶液的光学性质
图1为所合成的CdTe QD s 在水溶液中的紫外
可见吸收光谱和荧光光谱。由图可见, CdTe QD s
吸收光谱在502n m 有一明显吸收峰, 其荧光激发
光谱很宽, 发射光谱在538n m 处有一较强的带边
发射(F WH M 为48n m ) 。表明所合成的量子点具
有较好的光学性质。
212 CdTe 量子点的结构表征
图2A 为在140℃加热50m in 所合成的量子
点的透射电子显微镜照片和其对应的电子衍射图,
从图中可见所合成的量子点呈近似球形, 粒径分
布较均匀, 平均粒径为3nm , 其对应的电子衍射
图是一衍射环, 表明所合成的晶体是纳米微晶结
θ值是构。图2B 是与其对应的X 射线衍射图, 2
241532、401600、481010, 很好地对应于立方晶
型CdTe 的(111) 、(220) 、(311) 3个晶面(03-
065-1046) , X 射线峰的宽化显示出所合成的晶
体是非常小的纳米晶体。
190分析测试学报第27卷
213 量子点与胰凝乳蛋白酶结合物的光谱分析
图3和图4分别为发射峰位在538n m 的QD s 溶液及其QD s -chy motryp sin 溶液在37℃空气浴摇床中振摇115h 后测得的可见吸收光谱和荧光发射光谱。从图3可见, QD s -chy motryp sin 与单独的QD s 溶液有相同的吸收峰(502n m ) , QD s -chy motryp sin 溶液的吸光度比QD s 略有增加。从图4可见, QD s -chy motry p sin 溶液的荧光发射光谱与单独的QD s 溶液相比发生了略微的蓝移(约2nm ) , 发射光谱的半峰宽不变, 其荧光强度增加了71%。QD s -chy motryp sin 溶液的发射光谱发生蓝移可能是因为蛋白质表面结合的QD s 所处的环境与水溶液中的QD s 不同。QD s -chy motry p sin 处于相对较低的极性环境中, 降低了QD s 周围分子的定向极化率, 使St okes 位移减小, 所以QD s -chy motryp sin 溶液的发射光谱相对于水溶液中QD s 的发射光谱发生了蓝移。发射光谱半峰宽不变表明链接胰凝乳蛋白酶后的QD s 仍然保持着原来QD s 对称分布的窄谱特性。由于胰凝乳蛋白酶包被在量子点的表面, 对其起到修饰作用, 减少了表面缺陷, 因而荧光强度增强。
考察了QD s -chy motryp sin 溶液及单独的QD s 溶液的荧光稳定性, 实验发现将QD s -chy motryp sin 溶液与单独的QD s 溶液在室温或4℃的冰箱中放置1周, 它们的荧光强度基本不变, 由此表明本实验研究的量子点探针具有较好的稳定性。
214 CdTe 量子点与胰凝乳蛋白酶偶联条件的优化
通过测定CdTe QD s 与胰凝乳蛋白酶偶联后溶液的荧光强度, 确定CdTe QD s 与胰凝乳蛋白酶偶联的最佳反应条件。在NHS 存在下, 考察了反应温度对QD s -chy motryp sin 。结果表明, 升高温度能使偶联速率加快, , 37℃作为偶联反应的温度。, , QD s -chy motryp sin , 5, , 荧光强度增强幅度不大, h , 分别选用不同pH 值的P BS 缓冲溶液进行s , 然后测定QD s -chy motryp sin 溶液的荧光发射光谱, 实验结果显示, , 因此选定偶联反应在碱性条件下进行。如图5所示, pH 910时QD s -chy motry p sin 溶液的荧光强度与单独QD s 溶液相比荧光强度增加最大, 因此选定偶联反应的pH 值为910。
215 NaCl 浓度对QD s -chy motryp sin 溶液荧光强度的影响
采用不同浓度NaCl 溶液稀释QD s -chy motryp sin 溶液, 然后进行荧光发射光谱的测定, 结果发现, 随NaCl 浓度的增加, QD s -chy motryp sin 溶液的荧光强度下降。当QD s 溶液和胰凝乳蛋白酶的含量分别为215μmol/L和015mg/L时, 如果氯化钠浓度控制在0104mol/L以下, 便可满足生物荧光探针的需要。
216 胰凝乳蛋白酶的浓度对QD s -chy motryp sin 溶液荧光强度的影响
实验考察了胰凝乳蛋白酶的浓度对QD s -chy motryp sin 溶液荧光强度的影响。实验发现, 在0~
第2期陈启凡等:CdTe 量子点对胰凝乳蛋白酶的荧光标记191
0188mg/L范围内, 随着胰凝乳蛋白酶浓度的增加, 荧光强度逐渐增大, 这主要是由于随着胰凝乳蛋白酶含量的增加, 与量子点共价链接的胰凝乳蛋白酶越多, 对量子点表面的包被效果越好, 从而减少了量子点的表面缺陷, 使得量子点的荧光强度增加。而当胰凝乳蛋白酶的浓度增加到一定值时, 蛋白量趋于饱和, 表面缺陷得以修复, 此时再增加浓度, 荧光强度也变化不大。
3 结 论
本文利用巯基丙酸作为稳定剂直接在水相中合成了CdTe 量子点, 反应条件温和、成本低、操作简便。利用CdTe 量子点表面带有的羧基实现了与胰凝乳蛋白酶的偶联, 偶联后溶液的吸光度略有增加, 而荧光强度明显增大, 同时荧光发射光谱发生了蓝移(2nm ) , 发射光谱的半峰宽不变。考察了QD s -chy motryp sin 溶液在室温和4℃时的荧光稳定性, 结果表明QD s -chy motryp sin 作为生物探针可以满足生物研究的需要。该研究为量子点进一步应用于生物分析和检测提供了有益的参考。
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