范文一:流式细胞仪检测
细胞前处理实验方案(流式细胞仪)
注:由于本实验仪器较为昂贵,操作较为复杂。如想真正上手进行操作,之前应对其原理,仪器相对构造有所了解,并跟随相关操作人员学习。本方案不包括仪器操作具体步骤,只是对上流式细胞仪之前细胞处理方法进行介绍。
A.细胞表面分子表达水平检测(直接免疫荧光法标记)
试剂:
荧光素标记的抗体及同型对照抗体
细胞洗液:含2%BSA、0.1%NaN3的PBS
封闭液:羊血清
实验步骤:
一、细胞的采集:
(1) 悬浮细胞的采集:1000 r/min,离心5-10 min,弃上清。用含0.1%牛血清蛋白(BSA)
的PBS离心洗涤1-2次,采集1.5×106个细胞/管至1.5 mL EP管中备用。若细胞悬液中有明显的沉淀块,需要用100目的滤网过滤。
(2) 贴壁细胞的制备:
① 吸除培养上清液,用无钙、镁离子的PBS漂洗一次。
② 采用细胞刮小心挂下贴壁细胞,或采用胰酶消化法:加入胰酶消化液(10 mL培养瓶约加入0.5 mL,覆盖生长面即可,不需浸没),室温(25℃)或37℃
消化2-5 min,倒置显微镜下观察,发现胞质回缩、间隙加大,立即加入5 mL
含血清的培养基终止消化。
③ 反复吹打瓶壁细胞。吹打动作要轻柔并尽量避免产生泡沫。
④ 转移至离心管中,1000 r/min离心10 min,离心洗涤1-2次,采集1.5×106个细胞于1.5mL EP管中备用
二、直接免疫荧光法标记
(1) 将EP管离心,1000 r/min离心5-10 min,倒弃上清(注:此操作EP管中仍然会残
留约100 μL液体)。
(2) 加入10μL羊血清(羊血清终浓度10%)。4℃封闭细胞表面Fc受体10 min。
(3) 加入细胞洗液,1000 r/min,离心6 min,弃上清,如此洗涤细胞1-2次,倒弃上清。
分别于同型对照管中加入荧光素标记同型抗体作为阴性对照,待测管加入荧光素标记的抗体为试验管,加入量为1 μL(各荧光标记抗体具体使用量参见说明书,可根据实际情况,在保证实验成功的前提下酬量降低用量)。轻轻吹打混匀。4℃避光孵育30 min。
(4) 加入细胞洗液,1000 r/min,离心6 min,弃上清,如此洗涤细胞2-3次。用300 μL
细胞洗液重悬细胞,上流式细胞仪检测。
注意:
1. 为保证最后上流式细胞仪检测的细胞数量在1.0×106 左右为好,初始细胞采集数可相对多点(1.5×106),如果可减少预处理实验中细胞的损失。
2.如最后上流式细胞仪检测的细胞数量较少,可相对减少重悬细胞洗液的体积(可少于300 μL)。
3.标记好的细胞应尽快上流式细胞仪检测。检测之前,应注意低温避光保存。
4.可多准备几组对照细胞,以用于仪器参数调整。
B.细胞周期检测(Annexin V/PI双染色法)
一、基本原理
细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面,目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一是磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移到细胞膜外,使PS暴露在细胞膜外表面。PS是一种带负电荷的磷脂,正常主要存在于细胞膜的内面,在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca+依赖的磷脂结合蛋白,最初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于结合到磷脂类如PS的特性。对PS有高度的亲和性。因此,该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的PS。PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的,也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的,而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。因此,可以建立一种用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。
试剂:
孵育缓冲液:10 mmol/L HEPES/NaOH,PH 7.4,140 mmol/L NaCl,5 mmol/L CaCl2
实验步骤:
一、细胞的采集:
悬浮细胞直接收集到10 mL的离心管中,每样本细胞数为(1~5)×106/mL 500~1000 r/min离心5 min,弃去培养液。
贴壁细胞的采集参考表面分子表达检测中贴壁细胞的采集方法,每样本细胞数为(1~5)×106/mL。
2. 用孵育缓冲液洗涤2次,500~1000 r/min离心5 min。
3. 加入100 μL Binding Buffer和FITC标记的Annexin-V (20 μg/mL)10 μL,室温避光30 min。
4. 加入PI(50 μg/mL)5 μL,避光反应5 min后,加入400ul Binding Buffer。
5. 流式细胞仪分析(一般不超过1h):流式细胞仪激发光波长用488nm,用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光,另一波长大于560nm的滤器检测PI。 同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。
6. 结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性,坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光,而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此,在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上,左下象限显示活细胞,为(FITC-/PI-);右上象限是非活细胞,即坏死细胞,为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞,显现(FITC+/PI-)。
注意:
1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。
2. 操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测。
范文二:流式细胞仪检测细胞凋亡
:PI
其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。这些改变包括细胞
核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等,其中细胞核的改变最具特征性,主要
包括以下几个方面:
1. 细胞核的改变:由于凋亡细胞核的改变,造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。研究表明,用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色,其DNA可染性降低。许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性:凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。在流式细胞仪上,前散射光与细胞的大小
有关,而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用,与细胞内的颗粒多少有关。在细胞凋亡时,细胞固缩,
体积变小,故前散射光降低,这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。此外细胞凋亡时由于染色体降
解,核破裂形成,细胞内颗粒往往增多,故凋亡细胞侧散射光常增加。细胞坏死时,由于细胞肿胀,其前
散射光增大;侧散射光在细胞坏死时也增大,因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是,根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆
比率影响很大。因此在某些淋巴细胞凋亡中,用光散射特性检测凋亡的可靠性较好,而在肿瘤细胞凋亡中,其可靠性就较差。根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光
分析结合起来,用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。也可用于活细胞的分类。
PBS溶液;
PI染液:将PI溶于PBS(pH7.4)中,终浓度为100ug/ml。用棕色瓶4?避光保存。 70%乙醇
400目筛网
流式细胞仪
1. 收集细胞{数目约(1~ 5)×106个/mL},500 ~ 1000 r/min离心5min,弃去培养液。 2. 3ml PBS洗涤1次。
3. 离心去PBS,加入冰预冷的70%的乙醇固定,4?,1—2小时。
4. 离心弃去固定液,3mlPBS重悬5min。
5. 400目的筛网过滤1次,500—1000r/min离心5min,弃去PBS。
6. 用1ml PI染液染色,4?避光30min。
7. 流式细胞仪检测:PI用氩离子激发荧光,激光光波波长为488nm,发射光波波长大于630nm,产生红色荧光分析PI荧光强度的直方图也可分析前散射光对侧散射光的散点图。 8. 结果判断:在前散射光对侧散射光的散点图或地形图上,凋亡细胞与正常细胞相比,前散射光降低,而
侧散射光可高可低,与细胞的类型有关;在分析PI荧光的直方图时,先用门技术排除成双或聚集的细胞以
及发微弱荧光的细胞碎片,在PI荧光的直方图上,凋亡细胞在G1/G0期前出现一亚二倍体峰。如以G1/G0期所在位置的荧光强度为1.0,则一个典型的凋亡细胞样本其亚二倍体峰的荧光强度为0.45,可用鸡和鲑鱼的红细胞的PI荧光强度做参照标准,两者分别为0.35和0.7,可以确保在两者之间的不是细胞碎片而是
完整的细胞。
细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应
该注意。
范文三:流式细胞仪检测凋亡
流式细胞仪检测凋亡
细胞凋亡的检测方法众多,流式细胞仪检测凋亡,是常用的方法。由于流式细胞仪固有的特点――可以准确的进行凋亡细胞的计数。因此,具有其它方法无可比拟的优越性。本文主要结合我室的一些实际经验,力图简单明了的介绍流式在检测凋亡方面的应用。
下面是一幅凋亡过程图。在凋亡诱导剂的作用下,首先是细胞色素C和apa f-1形成复合体,线粒体的功能发生衰退;后是caspase家族激活,磷脂酰丝氨酸外翻,这时细胞的形态已经发生了改变,可以看到细胞变小,胞核皱缩;最后是细胞内DNA断裂,形成凋亡小体。
在凋亡发生的各个过程当中,都有相应的流式细胞仪的检测方法,我室曾经检测过的方法包括:
1 线粒体功能
2 DNA Cycle
3 Caspases
4 Annexin V Assay
6 DNA Fragmentation Assays
基本上涵盖了细胞凋亡的各个期,对各种检测方法的原理和特点做一个简单介绍。
线粒体功能检测的试剂盒有深圳达科为公司代理的试剂盒(产品编号为BVK250)和BD公司出售的盒Apo-Alert试剂盒。其检测主要采用阳离子型荧光染料。原理是:正常细胞中,染料可以在线粒体内聚集,发出明亮的红色荧光;而细胞凋亡后,其线粒体膜电位发生改变,染料无法进入线粒体,只能在胞质中以单体形式存在,发出绿色的荧光。可以在荧光显微镜下,或流式检测。采用488nm激发,其检测波长分别是527nm和590nm。整个实验过程操作简单,只需要30min就可以见到结果。
Caspase
家族可以检测的分子非常多,也有不少商业的试剂盒可以应用。即
使没有相应的试剂盒,只要有相应抗体基本上是可以检测的,具体的方法是参照细胞内蛋白检测的步骤。
在细胞凋亡过程中伴随着一系列的形态特征改变,细胞膜的改变是这些特征中较早出现的一种。在凋亡细胞中,细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的外侧。Annexin-V是一种35-36 KD的钙粒子依赖的磷脂结合蛋白,它对PS具有较高的亲和力。细胞凋亡时,可以和外翻的PS结合,从而可以检测凋亡的细胞。发生死亡的细胞其细胞膜上的PS也外翻,因而也会阳性。因此,常用的凋亡试剂盒除了采用Annexin-V标记之外,还会加一种DNA染料,常用的有PI和7-AAD,由于死亡的细胞膜通透性增高,染料可以进入细胞内和DNA结合,从而可以发荧光,区分出死细胞。
下图给出的是在使用FAS单抗诱导前后的检测结果,横坐标是Annexin-V FITC, 纵坐标是PI,左上、右上、左下、右下四个象限中右上象限代表死亡的细胞,左下象限是存活的细胞,右下象限是凋亡的细胞。
在采用Annixin V方法检测凋亡细胞时,要特别强调一点:该方法适用于悬浮生长的细胞,如:淋巴细胞等细胞的检测。对于贴壁生长的细胞,由于在胰酶等消化处理过程中会造成细胞膜的损伤,会造成较高的假阳性,从而影响检测结果。尽管目前,包括国外也有一些单位采用该方法检测贴壁生长的细胞。我不推荐用该方法检测。因为其重复性较差,且需要操作时非常小心。
DNA周期检测原本是用来反应细胞各个期,即细胞增殖状况的。利用细胞内DNA能够和荧光染料,如PI,结合的特性。细胞各个期由于其DNA含量不同从而结合的荧光染料不同,流式检测的荧光轻度也不一样。G2-M期DNA含量是G0-G1的两倍,而S期介与两者之间。
但是由于发现凋亡的细胞DNA含量较少,因而可以在细胞G0-G1期前面有一个亚二倍体峰,从而认为是凋亡细胞。但是由于死亡的细胞本身其DNA含量也是减少的,因而非常难于区分凋亡和死亡的细胞。在90年代,该方法曾经风靡一时,现在看来,那时的实验结果需要推敲。尽管,经典的流式检测资料给出的图是认为凋亡的细胞是紧挨着G0-G1期峰的一个峰,死亡的细胞峰离G0-G1期峰较远,但是这种典型的结果似乎很难获得。有其它的替代方法,完全可以不用这种方法。
下图横轴代表PI的荧光强度,纵轴代表细胞数目,各个期根据荧光强度可以简单的进行区分。
晚期凋亡的细胞由于DNA的断裂,因而可以出现DNA ladder,从而也就有了经典的检测方法TUNEl。流式也能也能进行Tunel检测,其检测原理与经典Tunel原理基本一致。以BD公司的为例,其利用TdT能将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端,从而使凋亡的细胞具有荧光。但是由于在细胞内标记,细胞需要进行固定处理,操作类似免疫组织化学法,容易造成假阳性。建议采用原装大厂的试剂盒,并且严格的设立对照。经过预实验方法稳定后再进行大规模实验。标本处理后,均可以用荧光纤维镜进行观察,拍照。流式检测后,可以进行精确的计算凋亡百分比。这一点,经典TUNEl是做不到的。
范文四:流式细胞仪检测技术
实验七 流式细胞仪检测技术
免疫细胞是一组不均一的细胞群体。各种特定的细胞群其细胞表面表达有各自特异的表面标志分子,利用这些特异的表面标志,可以鉴定、分离和纯化相应的细胞群。随着单克隆抗体技术的诞生和免疫标记技术(特别是荧光标记技术)的发展,以及计算机科学的应用,使利用仪器的方法检测特异的细胞膜表面分子成为可能。本章介绍的荧光激活细胞分类技术就是采用单克隆抗体技术和免疫荧光标记技术,并结合光学检测和计算机分析技术而产生的鉴定和分离特定细胞亚群的技术。
实验原理
流式细胞仪(flow cytometer)是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置,由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物,因此,用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪(fluorescence activated cell
sorter,FACS),是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。其原理是在一组混合的细胞群中,加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体,这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合,结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面,称为荧光抗体标记的靶细胞;将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中,再通过FACS的进样吸管孔,仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时,带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光,通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光(scattered light )可得到细胞大小及颗粒状态的信息;而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息,进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。
在流式细胞仪分离装置中,返回到计算机的信号,可用来产生一种电荷,这种电荷以特定准确的时间通过FACS的吸管孔,在与吸管孔的液体流相相遇时,可将液体流打碎成只含一个细胞的微滴。含有电荷的微滴就会从主液体流中偏移,穿过一双极板。带正电荷的微滴被吸引至阴极,而带负电荷的被吸引至阳极。以这种方式,特定的细胞亚群由于标记着不同的荧光抗体而带有不同的电荷,从而将目的细胞从混合的细胞群中分拣出来。
实验应用
流式细胞仪主要有两个最基本的用途:第一是可以定量分析鉴定活细胞表面表达的特异分子,第二是进行特定的活细胞群的分离和纯化。
1. 免疫细胞群的分类 静止淋巴细胞之间从其外观形态难以区分,都是以致密的核及少量细胞质组成的小而圆的细胞为特征。然而,这些细胞确是由功能各异的不同细胞亚群所组成,各种细胞群表达各自特殊的表面分子。例如,B淋巴细胞上表达有特异的膜表面免疫球蛋白(mIg),而成熟的T淋巴细胞表面表达特异的CD3分子。T淋巴细胞又可进一步按其表达的不同表面标志细分成不同的亚群,如CD4+CD8-和CD4-CD8+亚群。因此,可由这些特征性的表面标志,将细胞分为不同的群或亚群。
2. 免疫细胞的分化发育 免疫细胞分化发育的不同阶段,其表面标志也在不断地发生着变化。如胸腺细胞(发育过程中的T淋巴细胞),在发育的不同阶段从不成熟到成熟,其表面标志经历了从双阴性(CD4-CD8-)到双阳性(CD4-CD8-),直到单阳性(CD4+CD8-或CD4-CD8+)的过程。正常生理状态下,发育不同阶段的胸腺细胞以一定的比例存在于胸腺中。通过检测这些标志,即可判定某些因素(基因突变等)对胸腺细胞发育的影响。
3. 免疫细胞的分子表达 免疫细胞的不同因素的影响下,其表达的分子也会发生变化。通过检测这些分子的变化,可分析细胞功能以及细胞分化状态等。例如,静止的T淋巴细胞不表达或低水平表达CD69分子;而一经活化,其表达CD69分子数量明显增加。因此,可通过检测这些活化标志的变化来判定细胞状态以及研究影响细胞活化状态的因素。
4. 免疫细胞的分离 如前所述,免疫细胞是一组极不均一的群体。所以在研究免疫细胞功能时,常常需要把某些特异的细胞分离和纯化。虽然免疫细胞分离的方法很多,但用FACS来纯化特定的细胞群是目前最为有效和方便的手段。例如,最近颇受关注的CD4+CD25+T淋巴细胞是一群具有免疫调节(免疫抑制)功能的细胞群。在对其特点及功能进行研究时,首要的问题是分离该细胞群。用相应的单克隆抗体与其结合,再用FACS进行分离,就能得到纯度很高CD4+CD25+T淋巴细胞细胞群。而其他分离方法不仅分离过程烦琐,也很难控制无菌条件及保证细胞纯度。
实验方法
流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一,是仪器前阶段,包括试剂的准备,细胞制备、细胞的荧光染色;第二,是流式细胞仪阶段,主要是仪器的操作;第三,是结果分析阶段。
(一) 细胞和试剂的准备
材料
(1)细胞样品:来源淋巴细胞或外周血的白细胞。
(2)荧光标记单克隆抗体:常用的有FITC(fluorescein -isothiocyanate)和
PE(phycoerythrin)标记的单克隆抗体。
(3)封闭抗体:抗Fc受体抗体
免疫细胞表面一般表达有Fc 受体,能和抗体的Fc段结合。封闭抗体的作用就是阻断荧光标记的单克隆抗体的Fc段与免疫细胞表面Fc受体结合所产生的非特异性的结果。
(1) FACS缓冲液:
1×PBS 950ml
FCS 40ml
10ml 10%叠氮钠溶液
(2) 仪器缓冲液(FACS-flow):仪器厂家提供
(3) FACS清洁液(FACS clean )和FACS洗净液(FACS rinse):仪器厂家提供。
操作步骤
57(1) 单细胞悬液的制备:将1×10~1×10的细胞放入1.5ml离心管中3000r/min离心5分钟,弃上清;加入FACS缓冲液100μl悬浮细胞。
(2) 封闭细胞表面Fc受体:在步骤1中加入Fc受体抗体0.5μl(0.5mg/ml),水浴3分钟。
(3) 细胞与荧光抗体结合:在步骤2中加入荧光抗体1μl(0.5mg/ml),水浴30分钟。
(4) 洗细胞去除游离的荧光抗体:在步骤3中加入FACS缓冲液350μl,轻轻混匀,3000r/min,离心5分钟,弃上清,重复步骤(4)2次。
(5) 上样前处理:取100μl仪器缓冲液加入步骤(4)获得的细胞沉淀中,轻轻混匀悬浮细胞,将细胞悬液移入FACS专用管中,准备进行仪器检测和分析。
(二) 仪器的操作
以FACSCaliburTM(BD Biosciences)仪器为例。仪器主要分为主机部分(包括激光激活源,射流,射线探测器)和计算机部分(CELLQuest softwere)。仪器的操作分为使用前的准备、使用中的操作和使用后的清洗。
1.使用前的准备
(1)打开电源:包括系统电源和主机部分电源。
(2)检查供液槽和废液槽:供液槽应含足够的仪器缓冲液,废液槽应在上次使用后清洗干净。
(3)使机器处于负亚状态,才能使细胞悬液被吸入至机器的吸管口。
(4)机器处于可应用状态时,指示灯会变成绿色。
2.使用中的操作
(1) 计算机部分——使用CELLQuest程序系统软件:
设定所要检测细胞的数量:一般设10 000~20 000个细胞。
命名本次实验:一般含使用者的姓名和实验日期。
打开记数部分:显示进入的细胞数以及检测一定量的细胞所需要的时间。
将微机与主机连接:控制检测时的预检测和实际检测。
主机设定:一般是已设定好的适合测定淋巴细胞的条件,包括探测器的电压。探测器
的电压是调空光电倍增管所能检测荧光密度的范围。
选择检测的波长和表达方式(plot):如果用一种荧光抗体,一般选直方图(histogram)
(表11-1):如果用两种荧光抗体,常选点状二维图(dot plot)或轮廓线图(contour plot)表
CD69分子表达检测直方图的数值说明
anti-CD3(-)检测结果 a.
marker Left,right events %gated %total mean Geo,meCV median Peak
an Ch All 1,9910 10000 100.00 100.00 12.06 4.59 1453.37 3.22 1 M1 1,105 9969 99.69 99.69 8.04 4.53 134.41 3.22 1 M2 105,9910 31 0.31 0.31 1304.57 309.78 223.13 164.00 112
b.abti-CD3(2ng/ml)检测结果
marker Left,right events %gated %total mean Geo,mean CV median Peak
Ch All 1,9910 10000 100.00 100.00 200.53 48.90 193.68 61.53 1 M1 1,100 5776 57.76 57.76 24.41 11.69 109.22 12.86 1 M2 100,9910 4237 42.37 42.37 440.31 344.57 114.76 361.90 417
c.abti-CD3(10ng/ml)检测结果
marker Left,right events %gated %total mean Geo,mean CV median Peak
Ch
All 1,9910 10000 100.00 100.00 236.90 74.05 155.88 113.42 495
M1 1,90 4602 46.02 46.02 25.13 12.83 101.67 14.42 1
M2 90,9910 5425 54.25 54.25 415.81 327.83 102.28 349.12 495
CD4及CD8细胞点状二维图结果 quad events %gated %total Xmean Xgeo.mean Ymean Ygeo.mean UL 1614 16.14 16.14 3.68 2.99 346.86 291.03 UR 7425 74.25 74.25 99.38 76.39 308.36 256.26 LL 558 5.58 5.58 4.00 3.39 9.91 6.88 LR 403 4.03 4.03 123.32 93.65 7.14 4.35
不同的荧光物要求选择不同的激发波长,参见下表
用于FACS的荧光物
荧光物 激发波长(nm)
FITC 525(green)
PE 575(orabge-red)
RED613 610(red)
PI 620(red)
PerCP 650(red)
TRI-COLOR 650(red)
CyChrome 670(red)
(2)细胞的吸入:将装有细胞的FACS测定管放置到机器吸管孔处。
先预检测样品,然后进行实际检测。可根据细胞的浓度选择测定的速度(低、中或高)。所有的数据将自动存入微机。
3.使用后的清洗 所有样品测定完后,要进行仪器的清洗。
1)将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入1分钟。 (
(2)将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入 1分钟。
(3)再将装FACS清洁液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入5分钟。
(4)同样再将装FACS洗净液的FACS管放置机器吸管孔,高速吸入5分钟。
(5)最后将一装有双蒸水的FACS管放置机器吸管孔后,关闭机器。
(6)将废液槽中的废液倒掉,并清洗干净废液槽。
应用举例
(一)小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子表达的检测
a .简要说明
(1)细胞为小鼠胸腺细胞。
(2)抗体为PE标记的抗CD4抗体和FITC标记的抗CD8抗体。
b.结果 以点状二维图( dot plot)表示,见表11-2。横坐标为CD8分子,纵坐标为CD4分子。所以右上代表双阳性细胞群,左下代表双阴性细胞群,左上代表CD4+CD8-的单阳性细胞群,右下代表CD4-CD8+单阳性细胞群。
c.结果分析 胸腺中存在着发育不同阶段的胸腺细胞,这些发育不同阶段的胸腺细胞表达CD4及CD8分子存在着差异。上面的结果是正常小鼠胸腺细胞CD4及CD8分子的表达情况:?存在着4种亚群:CD4-CD8-的双阴性细胞群(5.6%),CD4+CD8+的双阳性细胞群(74.3%),CD4+CD8-的单阳性细胞群(16.1%)和CD4-CD8+的单阳性细胞群(4.0%);?在这4种亚群中以CD4+CD8+的双阳性细胞群为主(75%)。
(二)小鼠脾细胞中T细胞和B细胞的组成
1. 简要说明
(1) 细胞为小鼠脾细胞
(2) 抗体为PE标记的抗CD3抗体和FITC标记的抗CD45R抗体
2. 结果 以点状二维图表示,见表11-4。横坐标为B220分子,纵坐标为CD3分子。因此,左上为T细胞群,右下为B细胞群。
3. 结果分析 在脾脏中主要存在有两大类淋巴细胞群——T细胞和B细胞。其中B细胞占60%左右,T细胞占30%。
B220及CD3细胞点状二维图结果
quad events %gated %total Xmean Xgeo.mean Ymean Ygeo.mean UL 3067 30.67 30.67 2.36 2.08 87.39 50.96
UR 371 3.71 3.71 183.95 86.41 1888.23 141.27 LL 619 6.19 6.19 3.77 3.23 3.82 3.07
LR 5943 59.43 59.43 215.54 186.49 1.91 1.60
(三)活化T细胞CD69分子的表达
1.简要说明
(1) 成熟T细胞来自正常小鼠脾脏,经纯化而获得,通常情况下T细胞处于静止状态,而在不同浓度的抗CD3抗体的刺激下T细胞活化。
(2) 抗体为FITC标记的抗CD69抗体。
2. 结果 以直方图表示,参见表11-1。横坐标为荧光的强度,纵坐标为具有相应荧光强度的细胞数。
3. 结果分析 在没有抗CD3抗体刺激时,绝大多数处于静止状态的T细胞不表达CD69分子(CD69+0.3%);在2μg/ml抗 CD3抗体刺激下,42.4%的 T细胞表达CD69分子;在10μg/ml抗CD3抗体刺激下,54.3%的T细胞表达CD69分子。说明静止的T细胞不表达或表达较少的CD69分子,而活化的T细胞则表达高水平的CD69分子,并且该分子的表达随着
活化的强度而增加。因此,检测CD69分子可作为T细胞活化的标志。
关键点
(1)减少非特异荧光染色
细胞的活性和状态:流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光,也可探测细胞内的荧光。因此,如果要检测细胞表面的分子,一定要保证细胞的活性,还应尽可能保持细胞静止,通常在4度进行操作。否则,荧光抗体进入死细胞内,会产生非特异结果。
封闭抗体的应用是必不可少的,因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后,一定要用FACS缓冲液洗2~3次,以除去游离的抗体。
(2)单染色时以FACS最常用,FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。
(3)如果同时要检测两种以上的分子,一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。
实验八 杀伤细胞功能的检测
杀伤功能是机体免疫功能的一个重要方面,免疫系统中有多种具有杀伤功能的靶细胞,如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T细胞(CTL)、具有ADCC作用的单核细胞巨噬细胞等。在体外,多种细胞因子(如IL-2)可明显促进某些效应细胞的杀伤功能(如LAK),此外,通过识别靶细胞某些膜分子的抗体可介导重导向杀伤功能。本章主要介绍NK、LAK和重导向杀伤试验。由于混合淋巴细胞培养(MLC)可诱导出NK、CTL和LAK靶细胞,因此在本章一并介绍。
一.自然杀伤细胞(NK)和淋巴因子激活杀伤功能(LAK)的检测
原理
NK细胞存在于人或动物外周血、脾脏、淋巴结和骨髓中,能杀伤某些肿瘤细胞、病毒
感染靶细胞,无需抗原或有丝分裂原刺激,也不依赖抗体或补体,在机体杀伤肿瘤、防御感染及免疫调节中发挥重要作用。
LAK是NK或T细胞在体外高剂量IL-2诱导下,获得能杀伤NK抵抗的肿瘤细胞的功能,在过继免疫治疗肿瘤中已得到广泛的应用。
51通过将同位素Cr掺入到NK的靶细胞K562(红白细胞白血病细胞)或LAK的靶细胞Libr(黑色素瘤细胞),按一定细胞比例与效应细胞(NK或LAK)孵育4小时,根据细
51胞上清中靶细胞被杀伤后所释放的Cr水平计算出杀伤细胞的杀伤活性。
试剂和器材
1. 细胞系:K562、LiBr
2. 10%FCS RPMI 1640
3(rHu IL-2
3514. H-TdR、Cr
5(培养瓶、培养板、CO孵箱、离心机 2
6(β-液闪仪、γ-计数仪
操作步骤
1( 效应细胞的制备
NK功能效应细胞可取静止的PBMC,或经不同细胞因子诱导的PBMC。
LAK功能的效应细胞通常将PBMC或肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或体液(癌性胸腺水)
6中分离的淋巴细胞(110/ml)在含有高剂量IL-2(200~1000ul/ml)的10%FCS RPMI 1640诱导2~5d而成。
2( 杀伤试验
513 主要有Cr4h释放法和H-TdR释放法,前者操作时间短,非常敏感;后者需要无菌操作,所需时间较长。
51(1) Cr4h释放试验:
6?收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等),洗涤后调整细胞浓度为2×10/ml
651?取1×10细胞(0.5ml),加NaCrO 100uCi,37度孵育2~3h,每15min轻轻振摇一24
次。
?用10%FCS RPMI 1640洗涤3次,每次800rpm、5min。
5?重悬细胞浓度1×10/ml。
4?96孔v型或U型培养板中,每孔加100ul(1×10细胞),设3个复孔。
?每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100ul1%Triton X-100;自然释放组加100ul完全培养基。
200g离心1min。 ?
?37度、CO孵箱培养4h。 2
?200g离心1min。
?每孔取出100ul上清,β计数仪测定值。
计算:特异性杀伤率(%)=(实验组cpm-自然释放cpm)/(对照组-自然释放cpm)
3(2) H-TdR释放试验
6 ?收获处于对数生长期的靶细胞(K562、LiBr等),洗涤后调整细胞浓度为2×10/ml,3加H-TdR 20uCi。
?7度孵育2~3h。
5?用10%FCS RPMI 1640洗涤3次,每次800rpm、5min,调整浓度为1×10/ml。
4?96孔U型或平底培养板中,每孔加100ul(1×10细胞),设3个复孔。
?每孔加入100ul不同细胞浓度的效应细胞,最大释放组加入100ul1%Triton X-100;自然释放组加100ul完全培养基。
?CO孵箱培养18~24h。 2
?每孔取出100ul上清,加入胰蛋白酶(终浓度0.15%)和DNA酶(终浓度为0.0125%)
?继续孵育30min。
?用细胞收集仪收获于玻璃纤维纸上。
?烤干后,β计数仪测定值。
计算:特异性杀伤率(%)=(1-实验组cpm/对照组cpm)×100%
(二) 注意事项
1(每次试验最好取3~4个不同的效应细胞/靶细胞比例,常用效靶比例为100:1、50:1、25:1、12.5:1。
2(诱导LAK细胞过程中要注意无菌操作。
3(避免同位素污染。
根据实验需要,可采用纯化的NK细胞作为效应细胞,常用Percoll不连续密度梯度离心纯化NK细胞(见表)。
用Percoll不连续密度梯度离心纯化人NK细胞
梯度顺序 加样
细胞 1 2 3 4 5
Percoll
40.0 42.5 45.0 47.5 50.0 浓度
(%)
细胞回
100 1.6 3.5 8.5 28.5 21.5 收率
(%)
LGL
12 5 82 74 7 2
(%)
7LU/10
42 16 192 143 4 1
细胞
3 1个溶解单位(Lytic unit,LU)为一定效应细胞30%溶解(杀伤)5×10/靶细胞(K562)的水平。
如需进一步纯化LGL,可通过除去具有高亲和性羊红细胞受体细胞(T细胞),因为NK细胞只具有低亲和性的绵羊红细胞受体(ER)。具体方法是将Percoll分离的位于第2、
683梯度间的细胞洗涤后,调整细胞浓度为5×10/ml,移入试管,加入2mlFCS和2ml 1×10/ml SRBC,100g离心5min,29度孵育1h,轻轻重悬细胞,叠加于3mlFicoll上,400ug室温下离心30min,界面不形成花环的细胞即为LGL,纯度可大于90%。
在用PBMC作为效应细胞进行NK活性测定时,如想除去PBMC悬液中混杂的红细胞,可用蒸馏水低渗的方法除去红细胞,而不用N HCl方法,因为后者可降低NK功能。 4
在小鼠NK实验中必须注意小鼠的品系和周龄。
不同小鼠系NK活性的差别
NK
高
CBA/J C3H/J C57BL/6 C57BL/10 DBA2 水
平
系
NKA/Sn A/J AKR SJL BALB/c
低
水
平
系
三周内或3月龄以上小鼠的NK水平一般很低。
二、混合淋巴细胞培养
混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)以往为用于器官移植前的组织配型,以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。由于MLC中淋巴细胞接受同种异型抗原的刺激而发生活化、增殖,产生种类众多的细胞因子,促进NK、LAK和CTL等杀伤细胞的分化,因此MLC又是免疫调节研究中常用的实验模型。
原理
两个无关个体功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时,由于HLA?类抗原不同,可相互刺激对方的T细胞发生增殖,此外双向混合淋巴细胞培养(two way MLC);若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂酶C处理或射线照射使之细胞中DNA失去复制能力,但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化,称为单向混合淋巴细胞培养(one way MLC)。两个个体间HLA抗
3原差异程度越大,反应越强烈,可通过细胞数量、形态检查或H-TdR掺入率检测反应细胞的增殖水平。EB病毒转化的B淋巴细胞表达高水平的HLA?类抗原,常作为单向混合淋巴细胞培养中的刺激细胞。
试剂器材
1(细胞:刺激细胞N23细胞系,反应细胞:外周血单个核细胞。
2(10%FCS RPMI 1640培养基。
60 3(照射源:Co装置
4(细胞培养瓶、培养板、滴管、吸管等。
5(CO孵箱、超净台。 2
操作步骤
1(刺激细胞的准备:常用的刺激细胞有EB病毒转化的B淋巴细胞(如N23细胞)或PBMC。取处于对数生长期的N23细胞,离心后重悬于新鲜完全培养基中,调整细胞数为1
6660×10/ml~2×10/ml,移置于塑料培养瓶或者50ml离心管中,用Co照射3000rad。
2(反应细胞的准备:分离纯化待检个体的PBMC。
65 3( LC:按2×10PBMC与1×10经3000rad照射的N23细胞的比例,重悬于4ml10%FCS RPMI 1640,放置于小培养瓶中进行MLC,培养瓶保持直立,培养4d内不要晃动,第5d加
3入1ml新鲜培养基。如要测定H-TdR掺入率,一般可在MLC的第5d进行;如要检测MLC中NK、LAK或特异性杀伤性T淋巴细胞(CTL),一般在7~10 d左右收获效应细胞。杀伤细胞功能检测参见本章“自然伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞的杀伤功能”,所不同的是CTL的靶细胞选用作为刺激细胞的N23细胞。
注意事项
1(注意无菌操作
2(刺激细胞接受照射剂量要准确,是细胞暂时存活,但失去增殖的能力。
3(可用RAJI或Daudi细胞作为刺激细胞,也可将不同的细胞混合作为刺激细胞。不同刺激细胞与反应细胞的合适比例有所不同,应做预实验选择最佳的实验条件。
实验九 吞噬功能试验
一(中性粒细胞吞噬功能测定
试剂与材料 2g/L NBT盐水(室温搅拌1小时或80度水浴中搅拌溶解,滤纸过滤,4度保存有效期3~6个月),用时与Ph7.2 0.15mol/L PBS等量混合,即为工作液。肝素、甲醇溶液、10g/L沙黄水溶液、小试管、毛细滴管、玻片、温箱以及显微镜等。
试验步骤 采用硝基蓝四氮唑还原试验。
(1) 试管法:
肝素抗凝血0.1ml滴于小试管底部,再加入等量NBT应用液
37度,30分钟(中间摇动一次),再置室温15分钟
摇匀,用毛细管取一滴放于玻片一端,做血涂片
立即用电吹风吹干,甲醇溶液固定1分钟,10g/L沙黄水溶液染色5分钟
PBS冲洗、自然干燥、油镜检测
(2)微量法:
取硅油处理的1mm×75mm的毛细管取末梢血至30mm处
立即吹入硅油处理的凹玻片中,与1/30量的0.05%肝素溶液混合
加等量的1g/L NBT,轻轻摇动混合,湿盒内,37度,室温15分钟
用毛细管吸去表层上清液,用硅油处理的毛细管吹数次混匀
吸出少许制成血片,空气干燥,沙黄水溶液染色,油镜观察
试验结果 血片中有10%以上的中性粒细胞的胞质中有蓝紫或蓝黑颗粒沉着,其沉着颗粒形状大小不一,有的呈大块状,有的呈点状或放射状。
关键问题 NBT配制一定要完全溶解,滤液要呈透明的淡黄色,储存于棕色瓶中,NBT应用液应于用前配制。血涂片要求推出尾部,不可过厚或过薄。血液与NBT要充分混合,保温时间不能过长。
二(小鼠巨噬细胞吞噬功能测定
试剂与材料:
昆明种小鼠(体重18,22g)、用生理盐水配制的10g/L淀粉溶液、2,鸡红细胞、肝素注射液、瑞士,姬姆萨染液、注射器、毛细管、解剖用具。
实验步骤:
小鼠腹腔注射10g/L淀粉溶液2ml
?
24h后,小鼠腹腔注射2,鸡红细胞1ml
?
30min后,小鼠脱臼处死,腹腔内注射0.2ml肝素注射液,揉动腹部
?
毛细管吸取腹腔液,滴一滴于玻片上,将毛细管平放于液滴上展开液滴,自然干燥
?
瑞士,姬姆萨染液染色5min,pH7.2PBS浸泡5,6min自然干燥后,油镜观察
结果判定 观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况,计数200个局势细胞,以及其中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数,计算吞噬百分率。
吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数吞噬百分率,,100, 200个巨噬细胞
三、人巨噬细胞吞噬功能测定
实验材料
(1)斑蟊浸液制备:斑蟊以95,乙醇溶液制成10,酊剂,室温下浸泡2周后使用。
(2)人巨噬细胞的获取:取滤纸片蘸斑蟊酊,置于一侧前臂皮肤上,在滤纸片上盖一塑料片,再以清洁纱布固定4,5小时,取下滤纸片,再用塑料瓶盖将局部罩上,以防形成的水疱破裂,48小时即可形成完整的水疱。
实验步骤
取水疱渗出液0.5ml,加5,鸡红细胞悬液0.01ml
?
混匀,置37?水浴30分钟(每10分钟轻轻摇晃一次)
?
1000r/ min离心5分钟,弃上清,留少许液体混匀细胞,涂片
?
用甲醇溶液固定后,用瑞士,姬姆萨染色,油镜观察
关键点 细胞涂片要轻,以免推破巨噬细胞。涂片不可过厚或过薄,以免影响观察结果。
斑蟊酊剂皮肤炎性渗出液大多再1,ml,最多的可达6ml,渗出液中所含巨噬细胞平均
为30,,40%,最多可达80,。抽取水疱液时,将皮肤消毒后,用无菌注射器抽取,盛于无菌试管中;局部敷以无菌纱布,24小时后取下纱布。用此方法病人无痛苦及不良反应。
实验十 细胞因子活性检测
检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子,分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性,其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株(即靶细胞)的促增殖作用,以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标,间接推算出细胞因子的生物学活性单位。
一、IL-1生物学活性检测
白细胞介素-1(IL-1)主要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子,具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反应等多种生物学功能。IL-1有IL-1α和IL-1β构成,结合同种受体,表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性
4细胞测定法等。 的方法有多种,如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-
小鼠胸腺细胞增殖法
3IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时,IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过H-TdR掺入法或染料摄入法判定小鼠胸腺细胞增殖量,推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性,可了解单核-巨噬细胞等的功能。
试剂与材料
(1)10%FCS-RPMI-1640培养液。
(2)LPS 用10% FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。
(3)刀豆蛋白A(ConA) 用10% FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。
3 (4)H-TdR
(5)C57BL小鼠,6~10周龄,雌雄均可。
操作流程
(1)小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导
6 ?常规收集小鼠腹腔巨噬细胞,10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2×10/ml,接种于
24孔培养板,0.5ml/well。
每孔加20ug/ml LPS0.15ml,37度,5%CO孵育36~48小时。 2
?此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1,收集培养上清,12000r/min离心15分钟,将上清移入新的1.5ml试管中,-20度冻存。
(2)IL-1的生物学活性测定
?胸腺细胞的制备:颈椎脱位处死小鼠,无菌取胸腺至于平皿中,加入5ml10%FCS-IMDM培养液,200目不锈钢网制成单个细胞悬液;1500r/min离心10分钟,再用5%Hank’s液洗涤细胞2次后,重悬于10%FCS-IMDM培养液中,调细胞浓度为1.0×710/ml。
?加样:取胸腺细胞加入96孔细胞培养板,0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品,50ul/well,实验孔再加入50ul ConA(终浓度0.625ug/ml),同时设培养液对照孔(0.1ml细胞+0.1ml培养液)、ConA对照(0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA),均设3复孔。37度,5% CO孵育36~60小时。 2
3103 ?H掺入:每孔加1.85×10uBq/20ul(0.5uCi/20ul)H-TdR,继续培养8小时。
3 ?测定:多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上,用β液体闪烁仪测定H-TdR
掺入量(cpm)以净cpm值(实验孔- ConA对照孔cpm值)为纵坐标,对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标,在半对数图纸上绘制出标准曲线,再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。
关键点
(1)吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时,必须离心,以除去细胞及细胞破碎成分。
(2)ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量,即选择能够激活胸腺细胞,又不引起明显增殖的量,如果ConA过量,则不能有效反应IL-1的刺激活性。
二、IL-2生物学活性检测
白细胞介素-2(IL-2)是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子,具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法,通过测定CTLL-2细胞的增殖量,确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性,可以间接了解辅助性T细胞的功能。
试剂与材料
(1)1)10%FCS-RPMI-1640培养液,含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml
青霉素、100ug/ml链霉素。
(2)MTT(4,5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole)用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液,4度避光保存。
(3)IL-2标准品。
(4)PHA(200ug/ml)。
操作流程
(1)人外周血T细胞分泌IL-2的诱生:
?人PBMC分离:采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC,用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为
加样:接种细胞悬液于24孔培养板,每孔0.5lml,每孔再加PHA0.5ml,37度,5% CO2孵育48小时。
?回收上清:吸出细胞培养上清,12000r/min离心15分钟,收集上清,-20度冻存。
(2)IL-2生物活性测定
?CTLL-2细胞制备:取传代培养24~48小时对数生长期的CTLL-2细胞,用培养液离心洗涤2次,每次1000r/min离心5分钟,再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为
51×10/ml。
?加样:将细胞接种于96孔培养板,每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释,每孔加入0.1ml,每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔(100ul细胞+100ul培养液)。37度,5% CO孵育40小时。 2
?MTT掺入:轻轻吸取上清液100ul,加MTT(1mg/ml)100ul,37度,5% CO孵育22小时。
?测定:离心培养板,2000r/min,5分钟,吸弃上清液,每孔加100ulDMSO,作用30分钟,用酶标测定仪于波长570nm测吸光值(A)。
?计算:用标准品浓度和对应的净A值(实验孔-阴性对照孔的A值)绘制标570nm570nm准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。
关键点
(1)CTLL-2细胞存活率应大于95%。
(2)因标本中含IL-4等,可影响IL-2的测定,最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。
三、IL-4生物学活性检测
IL-4主要是由T细胞活化后产生的一种细胞因子。CT.4S细胞为IL-4的依赖细胞株,H
对IL-2呈现低反应性,其增殖反应与IL-4的活性呈正相关系。检测IL-4的生物学活性水平,可间接了解T2细胞及与抗体介导的一些体液免疫的功能。 H
试剂与材料 CT.4S细胞株,A23187(钙离子载体)(用生理盐水配制成0.1ug/ml浓度)。其他同IL-2测定。
操作流程
(1)IL-4诱生
?人PBMC分离:淋巴细胞分层液常规分离PBMC,用10%FCS-IMDM培养液调细胞
6浓度为1×10/ml。
?加样:将细胞接种于24孔细胞培养板,每孔0.5ml。再分别加0.25mlPHA(200ug/ml)和0.25A23187(0.2ug/ml),37度,5% CO孵育24小时。 2
?回收上清:将细胞培养板1500r/min离心10分钟,收集细胞培养上清液,-30度冻存。
(2)IL-4生物学活性测定
CT.4S细胞悬液制备 ?
接种细胞于96孔培养板 ?
加待测样品和标准品 ?
3加H-TdR ?
3 收集细胞,测定H-TdR掺入量 ?
绘制标准曲线,计算待测样品的IL-4的活性单位 ?
*注:
?用0.25%胰酶消化、收集生长旺盛的贴壁CT.4S细胞;经Hank’s液离心洗涤2次后,
510%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×10/ml。
?接种细胞于96孔细胞培养板,每孔0.1ml。
?加入适当稀释的待测样品和标准品,每孔,.,ml。每个样品设,个复孔,同时设培养液对照。37度,5% CO孵育,,小时。 2
?与?同IL-2。
?以cpm为纵坐标,对应的不同稀释浓度IL-4标准品浓度为横坐标,在半对数图纸上绘制出标准曲线,再从标准曲线上查出待测样品中的IL-4含量。
关键点 在IL-4诱生过程中,常同时产生一定量的IL-2,将影响IL-4的检测结果。因此,最好采用IL-2mAb吸附剂除去IL-2。
四、IL-6生物学活性检测
MH60.BSF2为IL-6依赖细胞株,MH60.BSF2细胞增殖量同IL-6的生物学活性呈正相比。
试剂与材料 同IL-2的生物学活性检测。
操作流程
(1)IL-6的诱生:诱生过程与IL-2基本相同。用于诱导产生IL-6的细胞可用PBMC。诱生剂用PHA。
(2)IL-6的生物学活性测定:采用MH60.BSF2细胞增殖法,测定过程IL-2。应用的
5MH60.BSF2细胞浓度为2×10/ml。
五、IL-8生物学活性检测
IL-8 中对中性粒细胞具有激活和趋化作用,通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性,即对中性粒细胞的趋化活性。
试剂与材料
(1) 6%右旋糖酐生理盐水溶液。
(2) 淋巴细胞分层液比重为1.077+(-)0.001。
(3) 2%琼脂糖:称取2g琼脂糖,加入到100ml蒸馏水中,煮沸溶解。
(4) 0.1%白明胶Hank’s液。
(5) DMEM培养液(2×浓缩),内含20%FCS和0.75mg/mlNaCO溶液。 23
(6) 甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。
(7) 洁净载玻片。
(8) 打孔器,直径为3mm。
操作流程
(1)IL-8的诱生
6? 常规分离PBMC,洗涤后,调细胞浓度为5×10/ml。
? 将细胞接种于24孔细胞培养板,每孔0.5ml。
? 加诱生剂LPS(20ug/ml),每孔0.5ml,37度,5% CO孵育48h。 2
? 离心收集细胞培养上清液,用HCl溶液调为酸性(PH4.0),经SephadxG-75柱分
离,收集活性组分即为待测的IL-8粗品。
(2)IL-8的生物活性检测
?琼脂板的制备;取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液(2×浓缩),混合,取3ml加到洁净的载玻片上,铺成薄层,室温凝固后,放4度,进一步凝固30~60分钟,红打孔器打孔。
? 中性粒细胞制备:常规分离人外周血中性粒细胞。
? 加样:取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔,分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔,取10ulDMEM培养液加入对照孔;将玻片置于湿盒内,37度温育2小时。
?染色:用甲醇溶液固定30分钟,用瑞氏染液染片并干燥。
?检测:显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离(趋化游走距离)及向阳性对照孔的游走距离(自发游走距离),趋化 活性以趋化指数表示。
趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离
关键点 为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应,最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。
六、IL-10生物学活性检测
在小鼠IL-4(Mil-4)存在的情况下,IL-10可刺激D36小鼠肥大细胞株增殖。而单一的m IL4或h IL-10则仅有很低的增殖刺激活性。
试剂与材料
(1) 20%FCS-IMDM培养液,含8U/ml的rm 里减四。
(2)rh IL-10标准品。
3 (3)H-TdR。
(4)D36小鼠肥大细胞株。
操作流程
D36细胞悬液制备 ?
接种细胞于96孔培养板 ?
加待测样品和标准品 ?
3 加H-TdR ?
3 收集细胞,测定H-TdR掺入量 ?
绘制标准曲线,计算待测样品的IL-10的活性单位 ? *注:
?取生长旺盛的D36细胞用IMDM培养液洗涤2次,悬于20%FCS-IMDM培养液,并
4调制浓度为2×10/ml。
?~ ?参考IL-4测定。
附 录 一.几种营养液,缓冲液和试剂的配制 1(10%NaHCO溶液: 3
取NaHCO 10克加蒸馏水100毫升,高压灭菌1.5磅/10分钟 3
即可使用
2(Hanks液:
原液甲 NaCl 160 克
KCl 8克
MgSO7HO 2克 42
MgCl6HO 2 克 22
按顺序溶于800毫升双蒸馏水
CaCl 2克 2
溶于100毫升双蒸馏水中
两液混合加双蒸馏水1000毫升,再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧瓶塞。保存于4?
原液乙 NaHPO12HO 304克 242
KHPO1.2克 24
葡萄糖 20克 按顺序溶于800毫升双蒸馏水 0.4%酚红溶液 100毫升
将酚红液加到上述溶液中,加双蒸馏水1000毫升,再加入2毫升氯仿做防腐剂。盖紧
瓶塞。保存于4?
用时按原液甲 1份
原液乙 1份
双蒸馏水 1份
于10磅10分钟高压灭菌,4?保存一个月。用前用5.6%碳酸氢钠调PH7.2—7.4,根据
需要加青链霉素。
3(阿氏液 用于保存红细胞
葡萄糖(A*R级) 2.05克
柠檬酸钠 2水 0.8克
氯化钠 0.42克
无离子水或双蒸馏水100毫升
?冰箱内保存备用 高压灭菌8磅20分钟,置于4
4(小牛血清 (FCS)
购得的小牛血清必须先经过56?,30分钟灭活后才可使用。应分装小瓶冰冻保藏,长期备用。
5.吸收过的胎牛血清
除去胎牛血清中对绵羊红细胞的嗜异性抗体,可取经56?30分钟加热灭活的小牛血清,加半量压积绵羊红细胞,混合后,37?水浴20分钟。水浴后,2000转每分钟,10分钟。吸取上清液即成。
6(肝素溶液
将注射用的肝素(每支含12500单位)。用无菌生理盐水稀释成250单位每毫升。放4?保存,使用时取2滴(约含25单位)可抗凝1毫升全血。
7(1%硫柳汞
硫柳汞 1克
丙酮 10毫升
乙醇 50毫升
溶解后加蒸馏水至100毫升
8(玻璃器皿清洗液
稀浓度:重铬酸钾 50克
自来水 850毫升
浓硫酸 100毫升
浓浓度:重铬酸钾 4克
自来水 160毫升
浓硫酸 800毫升
重铬酸钾加匀后加热搅拌溶解,冷却(不能让重铬酸钾结晶析出)倒入教大的器皿(瓷钵等)内将器皿放入冷水中。再将浓硫酸缓慢加入,边加边搅拌,最初加的100—200毫升浓硫酸要求特别慢,待全部浓硫酸加完后,配好的洗液应呈酱色,无红色结晶物析出。
9(1N NaOH溶液
称取化学纯NaOH 40克 溶于1000毫升蒸馏水中。
10(1N HCl溶液
取比重为1.19的盐酸8.3毫升,加蒸馏水稀释成1000毫升。
瑞氏液 11.
称取瑞氏染粉0.1克,溶于60毫升甲醇中,过滤,贮存于棕色试剂瓶中。保存半年以上染色效果好。
12.吕氏碱性美蓝染液
溶液A 美蓝 0.6克
95%乙醇 30毫升
溶液B氢氧化钾 0.01克
蒸馏水 100毫升
分别配制溶液A和B 配好后混合即可。
二.基本实验操作
1.家兔心脏穿刺采血法:
一个人固定兔子用两腿夹住兔子的两条后腿,两手握住两前腿,使家兔前胸尽量向前突。用剪刀去左前胸的毛,以碘酒消毒,再用酒精棉球擦去碘酒。
先用手指按摸心脏搏动最强部位(约在左侧胸骨的第三肋间)将针头刺入,如已刺入心脏则可见针头随心脏搏动而上下跳动,此时轻轻抽动注射器,可见血液涌出。一般家兔抽取30—50毫升仍可生存,如不需保存动物可抽取80—120毫升。
2.家兔颈动脉放血法
将家兔仰卧固定,使头部后仰,整个颈部伸直露出,用消毒液擦拭,除颈部外的其它部位用消毒湿纱布覆盖起来将颈下皮肤纵向切开,剥离皮下组织,分离肉与气管,在颈静脉下可见迷走神经平行强烈搏动的动脉血管。将血管周围的结缔组织分离后,用止血钳夹死上下两端,在两钳中间切断血管,再用镊子夹住心端,然后在钳子和镊子中间的血管壁上斜开小口,放入采血瓶中松动镊子,血液便可留入瓶中。放血速度可由镊子掌握,以免过快发生溶血。(此法可 用于豚鼠的全采血,也可用于牛马羊等大动物)
3.家兔耳静脉采血法:
轻弹兔耳,再用75%酒精深擦,使其充血和消毒,然后刺破静脉,用注射器轻轻抽取血液。
4.血液分离方法
分离血清通常心脏采血,也可由颈动脉放血。
方法:
1(将抽的血收集在无菌三角烧瓶或无菌小克氏瓶中,令其凝固,贴壁。
2(置冰箱内24—48小时,待血块收缩后,用无菌吸管吸出上层澄清血清。
3(用无菌玻璃棒将血块与容器壁分开,又可释出一部分血清,但这部分血清可能含有血球,需离心沉淀除去血球。以吸管吸取上层血清。
4(取出的血清可测定效价加以注明供使用时参考,于灭菌后加入0.5%石灰酸或0.01%硫化汞等防腐剂,保存于冰箱中备用。
范文五:BD流式细胞仪
目录
简介流式细胞仪……………………………………………………3
流式细胞仪的临床检验项目
淋巴细胞亚群分析……………………………………………………………4
肿瘤细胞DNA检测分析………………………………………………………5 白血病及淋巴瘤免疫分型……………………………………………………6 残余白血病检测……………………………………………………………..6 网织红细胞计数……………………………………………………………..7 造血干细胞计数……………………………………………………………..7 血小板疾病及活化血小板检测……………………………………………..8 HLA-B27检测…………………………………………………………………8
器官移植的配型及免疫状态监控…………………………………………..9
AIDS诊断及治疗监控……………………………………………………….9
流式细胞仪的临床/医学研究……………………………………10
流式细胞技术的发展及国内现况……………………………….10
建议流式细胞仪之机型----BD公司FACSCalibur
仪器主要特点……………………………………………………………..11
配套设施(计算机、软件、试剂、样本制备仪、售后服务)………..12 仪器主要技术参数…………………………………………………………15
BD公司全球及中国业务介绍
BD公司流式细胞仪培训计划
BD公司推荐配置单
BD公司仪器与其他厂家仪器比较表
一、简介流式细胞仪
(一)流式细胞仪概念
流式细胞术(Flow Cytometry ,FCM)是一种对处在液流中的细胞或其它生物微粒
(如细菌)逐个进行多参数的快速定量分析和分选的技术。
简言之,流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪,是在单个细胞
分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质,如大小、内部结构、DNA、
RNA、蛋白质、抗原等进行快速测量并可分类收集的高技术,FCM以其快速、灵活、大
量、灵敏和定量的特色,广泛应用于基础研究和临床实践各个方面,包括细胞生物学、
肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等,在各学科领域发挥着重要
的作用。
(二)原理
待测样本的细胞悬液,在鞘液的包围和约束下,细胞排成单列高速由流动室喷嘴喷
出,形成细胞液柱。当液柱通过检测区,在入射的激光束照射下产生前向散射光(FSC)
和侧向散射光(SSC),它们分别反映细胞大小和颗粒度,根据这些特性可以将细胞分
类。经一种或几种特殊荧光标记的样本,在激光束的激发下所产生的特定荧光,可被光
学系统检测并输送到计算机进行分析,得到细胞相应的各种特性。
(三)流式细胞仪检测的细胞特性
二、 流式细胞仪的临床检验项目
目前在国内最常见的临床应用有两大类:一为肿瘤细胞的DNA含量析;
另一为细胞表面的表型测定,包括淋巴细胞亚型分析、免疫功能监测、白血病和淋巴瘤
免疫分型、残余白血病检测、以及HLA-B27组织抗原检测等等。
1、淋巴细胞亚群分析
淋巴细胞亚群分析可以通过相对计数、绝对计数与率的变化监控疾病状态下的免疫状
况(如肿瘤、感染性疾病、免疫性疾病等),以此辅助诊断、追踪病情发展及决定用药
时机。
2
检测原理:利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合,再配合多色荧光染料,
即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来,进而得到各亚群的相对比例。最常检测的
亚群包括T细胞(CD3)、B细胞(CD19)、NK细胞(CD16+56)、辅助性T细胞
(CD3+CD4+)和抑制性T细胞(CD3+CD8+)等。
应用实例:SimulSET系统利用CD14/CD45设门技术精确检测淋巴细胞亚群 比例。
* 其中绿色细胞群体为淋巴细胞,红色为单核细胞,蓝色为粒细胞。
2、DNA分析
肿瘤细胞的DNA倍体分析是流式技术另一重要应用,临床上可对一些恶性肿瘤进行早
期诊断,跟踪随访和早期治疗,大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。
检测原理:正常人体细胞的DNA含量是二倍体,细胞群体具有特定的增殖比例。通过
检测细胞的DNA含量和增殖比例,可以了解细胞群体的倍体性和增殖能力。具体操作时,
先将实体组织制备成单细胞悬液,用固定或去污剂在细胞膜上打孔,使DNA特异的荧光染
料如PI(碘化丙啶)导入细胞核,PI和DNA缄基对特异结合后上机检测PI的荧光强度,并
进行数据分析。
3
应用实例:乳腺癌病人的手术标本分析图。
*其中红色群体为二倍体,黄色群体为异倍体。
3、 白血病和淋巴瘤免疫分型
正常白细胞在其分化过程中,随着系列的不同、成熟阶段的差异,会在细胞膜表面表
达不同的分化抗原。白血病细胞则在癌变的过程中,丧失了正常细胞底系列专一性和分
化阶段规律性,在本质上有别于正常骨髓细胞。应用此特点可进行免疫表型分析,以鉴
别各种白血病和淋巴瘤,辅助临床诊断、评估疗效和预后。
常用的抗原包括:CD3、CD5、CD7、CD19、CD20、CD22、CD10、HLA-DR、
CD13、CD14、CD33、CD34、GLY-A、MPO等等。
应用实例:利用CD45三色分析急性髓性白血病。
* 左图为正常骨髓,绿色为正常淋巴细胞,深红为单核细胞,玫瑰红为成熟粒细胞,浅蓝为有核
红细胞,深蓝为未成熟细胞;右图为急性髓性白血病图形,可见与正常明显的差别。
4、 残余白血病检测
病缓解后仍残留在病人血中的极少量白
4 残余白血病是指经过适当的治疗、疾
血病细胞。通常白血病病人经过化疗后的疾病复发率为60-80%,经过自体或异体骨髓移
植后的复发率仍偏高(20-50%)。所以如果能早期检测到复发的迹象,即白血病细胞的
再增生,则可以提前给予病人及时恰当的治疗。
依照不同的白血病,选用不同的抗体组合(如下表)来检测残余白血病。流式细胞术
可在一万个骨髓细胞中检测到一个白血病细胞;尤其是TdT的应用大大提高了检测灵敏
度。
5、网织红细胞分析
网织红细胞计数是骨髓红细胞造血功能的重要指标。传统手工计数耗时耗力,缺乏准
确性。流式细胞仪网织红细胞计数系统由于采用系统试剂与全自动软件,可在短时内分
析大量细胞,低水平网织红细胞也可达到统计分析精度,省时省力,结果正确可靠。
* 左图中红色群体为红细胞,右图利用RNA染料噻唑橙(TO)区分成熟红细胞和网织红细胞。
6、造血干祖细胞检测
在治疗恶性血液病时,大剂量化疗或放疗摧毁有病的骨髓后,干细胞移植保证了健康
的干祖细胞重建骨髓,产生正常的血细胞,实体肿瘤病人亦可通过干细胞移植抗衡大剂
量化疗导致的致死性血液毒性。与大剂量化疗相配合的干细胞移植已在临床大大提高了
某些肿瘤病人的长期存活率,如乳腺癌、儿童神经母细胞瘤、卵巢癌等。另外,干细胞
移植与再生障碍想贫血、免疫缺隐、血红蛋白病等非恶性造血系统疾病治疗的相关性也
5
正在研究中。
* 上图中红色群体是经过多参数设门后精确设定的CD34阳性细胞群体,绿色部分是进行定量计数
的标准微球。
7、血小板疾病及活化血小板检测
通过血小板膜糖蛋白的检测可以诊断先天性或获得性血小板疾病如Bernard-Soulier
综合征(CD42b-42a),血小板无力症(CD41-CD61),免疫性血小板减少等等。
评价血小板活化程度的应用领域包括:缺血性冠状动脉疾病如心绞痛、心肌梗死、血
管成形术、心肺旁路术等;缺血性脑血管病如脑梗塞、TIA、脑动脉硬化等;糖尿病;恶
性肿瘤;高血压病;高脂蛋白血症;高粘滞血症;抗血小板药物机制研究与疗效监测;
吸烟;情绪性应急等。
应用实例:CD61/CD62P/PAC-1三色标记分析血小板活化。
6
8、HLA-B27检测
由流行病学统计结果显示,HLA-B27基因型阳性的人患数个遗传性免疫疾病的机率,
比一般人要高很多,以强直性脊柱炎为例,约为87倍。因此HLA-B27检测可以有效帮助
临床鉴别诊断强直性脊柱炎等血清阴性骨关节疾病。其他相关性疾病有:遗传性关节炎
如Reiter’s综合征, 反应性关节炎,肠性关节炎等。
检测时选用CD3/HLA-B27双标记抗体,圈定T淋巴细胞亚群,再分析其细胞表面是否
表现HLA-B27组织抗原。因为T细胞表面只表达ClassⅠ型HLA抗原,可避免ClassⅡ型
HLA抗原引起的误差。应用此法无需分离细胞,比传统的微量细胞毒实验节约时间,且检
测结果更敏感、客观、容易判读。
9、 器官移植的配型及免疫状态监控
以流式细胞仪进行器官移植前配对(Flow Cytometry Cross Match,FCCM)的优势
在于抗体检测的特异性、敏感度以及检测结果和手术成功率之相关一致性。利用多参数
测定,可了解受者血中是否有抗供者抗体,此抗体与供者的哪种白细胞反应,以及该抗
体是否会造成细胞毒性。移植前的评估包括HLA配型及混合淋巴细胞反应,移植后的评
估包括外周血淋巴细胞亚群测定、抗供者抗体检测等等。移植后定期检查外周血淋巴细
胞亚群,可以预估排异反应,以及病毒感染等问题。
10、AIDS诊断及治疗监控
由于 特定细胞群体的绝对计数在临床诊断与治疗上具有极大意义,如CD4+细胞绝对
计数可辅助HIV监控治疗,也可通过定量标准微球得到亚群的绝对数值。
应用实例:检测艾滋病人血中辅助T细胞和抑制T细胞的比例及绝对数。
7
三、 流式细胞仪的临床/医学研究
流式细胞仪应用的灵活性允许临床医生科学家们充分发挥想象,满足他们的临床
研究需要:细胞免疫功能、细胞凋亡、胞内细胞因子、胞内Ca2+及 PH值、多药耐药
性、寄生虫、细菌、病毒、环境科学等等。
流式细胞仪多参数分析配合细胞分选,可以提供样本的更多有效信息。细胞分选
是确认细胞形态、进行后续分子生物学研究(如FISH、PCR等)或细胞功能性研究的理想
手段。
四、 流式细胞技术应用的发展及国内现况
从1930年,Caspersson 和Thorell以细胞的计数开始,试图寻找研究细胞的新工
具,到1973年,BD公司与美国斯坦福大学合作,研制开发并生产了世界第一台商用流式
细胞仪FACS I,流式细胞术进入了一个空前飞速发展的时代。进入九十年代,流式细胞
术作为一门生物检测技术已经日臻完善,仪器的硬件平台也已达到稳定的技术状态,科
学家们、仪器制造商们又纷纷将研究焦点转向荧光染料的开发、单克隆抗体技术、细胞
的制备方法和提高电子信号的处理能力上来,以拓展日趋广泛的应用领域。流式细胞技
术的强大生命力植根于生物学、医学的各个领域,正是无数日新月异、变化多样的应用
项目在全球范围内推动了流式细胞技术的发展。
自1981年, 北京师范大学生物系引进中国第一台流式细胞仪(FACS Ⅲ, BDIS)
至今,各种型号的流式细胞仪在国内安装使用已超过300台,其中BD公司的流式细胞仪
近230台(FACSCalibur已超过140台,详见附录2“BD公司国内流式细胞仪用户名
单”)。从仪器引入中国二十年的发展历史来看,最早的流式细胞仪大都应用在纯科研
领域。随着流式技术的发展,方法学的成熟,尤其是越来越多的用于临床的试剂推出,
流式细胞仪已成为国内各大教学医院和医学中心重要的诊断工具,被广泛地应用于新的
临床实验上。
五、 建议流式细胞仪之机型----BD公司FACSCalibur:
FDA通过的世界唯一全自动四色台式分选机
8
FACSCalibur集分析和分选功能为一身,配置灵活,结合自动化的样本处理系统、极
宽的试剂选择范围、强大的计算机和软件系统,绝对配合今天高效多能的实验室需要。
FACSCalibur性能卓越,不仅通过其用户友好的整体设计帮助临床医生快速实现常规
免疫表型、DNA、网织红细胞、血小板、绝对计数等临床分析,FACSCalibur更以其完美
的四色分析和独特的分选功能成为遗传、肿瘤、血液、免疫功能等诸多研究不可或缺的
重要工具。
(一)、FACSCalibur仪器主要特点
? BD专利的立体空间激发系统采用双激光实现4色分析,最大程度地减少荧光信号之间
的补偿,提高检测灵敏度;双激光的应用大大扩展了染料的选择范围,相应地扩大了
仪器的应用领域。
立体空间激发系统为流式细胞仪多色分析设立了行业标准,并使染料的选择更为自
由,避免了染料之间的相互干扰。
? 独特的分选及浓缩系统
FACSCalibur是世界上目前唯一的台式分选机。
FACSCalibur采用不同于传统分选方式的“捕获管(catch tuber)”新技术,使整个
分选操作极其简便,无需长时间液流稳定,只需设定感兴趣的细胞群体,鼠标轻轻一
按就能实现对目标细胞的分选。细胞可分选到试管中,或根据需要直接分选到细胞浓
缩系统提供的滤膜或培养皿上。
FACSCalibur分选为全封闭系统,安全性好,可实现无菌分选和细胞培养。
细胞浓缩系统使细胞回收简单方便,减少离心步骤,大大提高细胞回收率。
? FACSCalibur以用户为中心的系统设计,从自动化样本处理、自动上样,到按钮式液
流控制、自动化软件获取和分析,每个环节操作都保证简便快捷, 并提供准确客观的
实验结果,重复性极好。
? FACSCalibur荧光检测全部采用大型流式细胞仪国际通用的光电倍增管以保证最快的
分析速度10000个细胞/秒,避免了使用----导致的低速度。FACSCalibur是目前世界
上分析速度最快的台式机。
9
DNA分析的解决之道
DDM (Doublet Discrimination Module)双粘体辨别模式
通过FL2-W和FL2-A检测分析区别实体组织标本中的粘连细胞群体,最大程度的减少
假阳性,是实体组织标本DNA分析不可缺少的工具之一。
? 最大程度减少无关噪音,增加获取分析速度,从而使含量极微的细胞检测成为可能。
?
开机后即可检测样本。机器无噪音。
设计灵活,提供多种配置供用户选择
第二根激光、分选及其浓缩系统、自动进样系统等都可以由用户根据实际需要和资金
情况自由选配。
(二)、配套设施
1、FACStation数据处理系统
采用最先进的Macintoshi苹果计算机系统,用户友好MacOS界面设计,易学易操
作;与PC兼容性好,数据可在PC机上分析;网络功能强大,可与Internet和Intranet
连接;不易感染病毒超强图形处理功能,可进行多维多色分析,是处理流式数据最佳的
选择。
最新配置Macintosh G4: 512 MRAM;
80GB Hard Disk ;
CD-RW,容量大,为回顾性研究带来方便;
多媒体系统;
17’ 高分辨率纯平显示器
FACStation提供多种功能强大的自动化软件用于数据获取、分析和报告。
并提供多媒体学习光盘。
主软件CellQUEST具有完成所有流式实验的仪器设置、数据获取和统计分析等功能,
设计灵活全面,是流式细胞仪系统不可缺少的全能工具。
全面配合各种临床检验的自动化软件系统包括:
FACSComp
SimulSET 自动校准仪器设置进行质量控制,自动设置流式双色、三色、四色分析条件,并可选择进行样本设置条件的优化。自动存储仪器条件。 双色淋巴细胞自动化分析:CD45/CD14自动淋巴细胞精确设门与分析;软件
内一致性检测作为内在质控;可自行定义抗体组合,灵活方便;自动打印
标准化实验室报告、医生报
告和总结报告。 10
MultiSET
三色与四色淋巴细胞自动化分析:提供CD45/SSC淋巴细胞门的手动与自动设置与分析;应用Attractor技术自动检查细胞群体
位置漂移;客户可自定义试剂与抗体组合;绝对值定量简单快速准确;自动打印标准化实验室报告、医生报告和总结报告。
造血干祖细胞自动化分析软件;使用ProCOUNT试剂自动获取分析造血干细胞;与TroCOUNT管组合实现绝对计数;操作简单,快速;降低CD34计数的变异;自动打印标准化实验室报告、医生报告和总结报告。
ProCOUNT
HLA-B27
自动分析软件;自动获取分析报告全血HLA-B27结果:支持HLA-B27系统试剂;应用FACSLoader组合可实现自动获取批量分析;配合FACSComp 软件进行自动校正;自动打印标准化实验室报告。
ModFIT
Attractor 多色自动快速批量分析软件:独家专利全自动设门技术可快速
准确圈定客户自定义的目的细胞群;最小群体标色算法便于分辨小群体
ReticCOUNT 网织红细胞计数自动化软件:自动设门分析报告网织红细胞计数,检测重
复性好,低水平网织红细胞也可达到可靠的统计精度。
QuantiCALC 标准荧光定量分析:分析获取QuantiBRITE试剂或微球的资料时,FL2轴自
动转化为每个细胞上抗体数(ABC)自动进行荧光定量;无限的条带设置充分满足对所有感兴趣细胞群体的研究;
强大的数据库满足长期研究与大型科研工作需求
Paint-a-gate 相互作用多维资料分析软件:独家专利混色算法可同时分辨与显 示多个细
胞群体;强大的上色工具为研究复杂资料间 相互关系提供帮助。
高精度DNA自动分析软件:快速正确DNA分析;强大的批量分析功能;便捷的数据库输出;自动打印标准化实验室报告。
2、全面的配套试剂
BD公司提供通过FDA标准的体外诊断临床试剂和广泛的科研试剂,并拥有全面的质量控制和质量保证产品线以确保检测结果的可靠性:包括仪器状态、实验方法全程控制、绝对计数控制以及试剂配套中一致性检测等,如:
CaliBRITE微球 配合全自动软件FACSComp可自动进行仪器的灵敏度、补偿等校正,确保仪器正常运行。其设置条件还可用于淋巴细胞分析。
BD Multi-Check 全血质控试剂全程监控免疫表型分析检测结果的准确性。 BD Multi-Check CD4 LOW为艾滋病检测提供标准。
结果。
TruCOUNT Control 可确保绝对计数的线性精度。 DNA QC保证DNA 分析的线性与分辨率均达到最佳。 (详见试剂报价单)
另外,PMG、TL、Clontech等BD子公司的涵盖细胞生物和分子生物各领域的试剂供应将满足您多方位的需求。(详见附录2 BD公司全球及中国业务介绍)。
3、样本制备仪
?
免疫样本制备仪
BD FACS Sample Process SP-1采用免洗程序,为细胞免疫表型分析提供自动化样本处理,简单易学,安全性好。
?
DNA样本制备仪
BD公司的Medimachine系统是一套安全的,标准化的样本制备系统,可对植物或动物的实体组织进行自动机械分离,为流式分析、细胞培养、或DNA扩增技术提供高质量的样本,是对各种类型的组织实现标准化的样本处理的最佳选择。 4、售后服务
BD公司深知每一台仪器正常运转的重要性,所以每一台FACSCalibur、每一个软件和每一个试剂背后都有着最及时、最专业的支持。
BD总部率先建立了流式行业第一个在线远程诊断系统,用户通过互联网和BD总部进行实时的网上交流,BD技术支持专家在自己的计算机上看到用户的问题并迅速提出评估和解决方案。
在中国,BD建立了专业资深、经验丰富的工程师队伍和技术支持队伍,为用户提供仪器安装调试、维修保养、技术培训和咨询等服务。另外来自BD、PMG、CLONTECH、Transduction Laboratory等总部科学家们的不遗余力的技术支持也是我们的有力后援。
BDFACS品牌流式细胞仪在中国的二十年发展,拥有由一大批国内知名专家、教授组成的用户群体,他们也成为了BD流式技术在中国推广、发展的主要动力。
BD公司每年召开的用户大会,论文交流和新技术介绍讲座,以及定期出版的Flow Cytometry专业技术杂志保证了用户及时了解最新的技术进展和相互交流。
(三)FACSCalibur仪器主要技术参数:
BD公司全球和中国业务介绍
(一) BD公司全球业务
BD公司成立于1897年,总部设于美国的新泽西州。一百多年来,BD公司已发展成为机构遍布全世界九十多个国家和地区、全球雇员近二万名的跨国公司,由最初发明世界上第一支塑料注射器的家族式企业发展为纽约交易所的上市公司,由产品单一发展成为业务涵盖皮下注射、血液采集、微生物产品、流式细胞仪等诸多领域世界著名的医疗技术综合公司,并且多次荣幸地跻身于美国《财富》杂志五百强之列。在产品质量方面,BD公司上市的所有产品均符合或高于同行业最高质量要求并获得ISO及CE质量认证。在1998年度公司全球销售额为31亿美元,用于研究开发新产品方面资金为2.18亿美元。
BD公司主要产品为:
1、 BD生物科学系统(BD Biosciences,BDB)
BDB是BD公司的高科技部分,致力于为生命科学的基础研究和临床应用提供全方位强有力的支持 和帮助。BDB由以下世界著名的品牌组成: BD Immunocytometry Systems(BDIS) PharMingen (PMG)
Transduction Laboratories(TL) BD Labware
BD Microbiology Systems (BDMS) Biometric Imaging (BMI) Clontech.。
作为流式技术领域的先锋企业,BDIS的使命是通过采用划时代的技术为科学发展提供有诊断意义的解决方案和工具来扩展我们的全球领导地位。目前BD品牌的流式细胞仪占全球同类产品总量的70%,占美国总量的80%,为肿瘤、白血病、爱滋病及其它免疫系统疾病的诊断作出了积极的贡献。
BD公司提供的流式细胞仪包括:
? FACSCalibur: 世界上唯一的自动化四色台式分析和分选机.。提供自动进样系统、分选浓缩系统、自动免疫样本制备仪和DNA样本制备仪等选配功能。常规应用包括免疫表型分析、DNA分析、多色分析等,可广泛应用于临床和科研。
? FACSVantageSE:具有最佳分析灵活性和高速度分选功能,可通过Autosort进行自动化分选。除常规应用外,还可进行高分辨率的染色体分析。
BD公司同时提供FDA批准的体外诊断试剂和研究试剂。通过最优良流式仪器、系统化软件以及试剂的完美配合,BD公司力争在科研和临床,尤其在肿瘤和免疫系统疾病的控制(如HIV)方面竭尽所长。
BD公司始终遵循用户至上,多方位满足用户的需要。几年来BD公司不断壮大,PharMingen、ClonTECH、Transduction Laboratories等高科技公司的加盟无疑进一步巩固了BD公司在细胞生物和分子生物多学科领域的绝对领先地位。
PMG建立在涵盖免疫学、细胞生物学、神经科学、分子生物学/蛋白质表达系统、蛋白质化学等多学科多样化的技术基础上,提供3000多种具领先技术的高质量产品,并继续在细胞因子、信号传导、凋亡、细胞周期调控、神经科学等战略性领域开发最新产
品。具体分类如下:
1. 抗体:
? CD Antigens and Cell Surface Molecles
? Adhesion Molecules
? Cytokines, Chemokines and Cytokine Receptors
? No Azide/Low Endotoxin (NE/LE) Products for Functional Studies ? ? ? ?
Tumor Suppressor/Onco-Proteins Signal Transduction Proteins Cell Cycle Related Proteins Apoptosis-Associated Proteins
? Transcription Factors ? Neuroscience ? 2nd Step Reagents ? Isotype Controls
2. 分子生物学产品:
? BD BaculoGold Baculovirus Kits, Vectors and Expression Systems ? GST/6x His Purification and Expression Systems
? BD BioColors Green Fluorescent Protein Expression Vectors ? BD RiboQuant Ribonuclease Protection Assay Systems ? Luciferase Assay & Detection System ? DNA Damage & Repair
? Custom Molecular Biology Products
3. 重组蛋白质:
? Signal Transduction Proteins ? Cytokines And Chemokines ? Cell Cycle Proteins
BD Transduction Laboratories 正是迅速发展的信号传导研究领域提供高质量的单克隆抗体。成立于1993年,1998年成为BD的有机组成,BD TL 已经从最初的25个产品成长为超过700个产品的专业公司。 产品包括:
? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
Phosphorylation & Dephosphorylation Nitric Oxide Calcium Signaling Apoptosis Cell Cycle Gene Regulation Cell Biology Cancer Ressearch Neuroscience Immunology
?
GTPases & Regulators
BD Labware作为BDB的一员,以多种多样的高质量试剂、培养基及其添加物、生物活性细胞外基质等产品为防止和治愈疾病作出贡献。BDL 产品包括:
? BD Falcon: 实验室塑料用品的首选,包括细胞培养、液体操作及其他生命科学应用;
? ?
BD BioCoat Cell Enviroments:全面提供细胞培养用品及细胞外生物活性基质;
Collaborative Biomedical Products: 高质量细胞培养试剂和培养基添加物的革新者和创造者。
Clontech是功能性基因时代的科学家最忠实最有力的支持者。成立于1984年, CLONTECH 一直以迅猛的速度增长.CLONTECH的使命始终是通过提供先锋性的工具辅助科学家们提出超越从前的新问题和新观点, 最终加速科学发现的过程. 基于强大的R&D计划,CLONTECH 发明了一些划时代的研究技术, 如GFP-based (green fluorescent protein) reporters, 用于研究蛋白质相互作用的two-hybrid analysis systems , 用于表达差异分析的gene array technology等等.所有这些产品都以其质量和革新性极大地促进了分子生物研究的进展.
CLONTECH 主要的强项在于:
PCR & PCR-based technologies; cDNA technologies; gene analysis;
expression systems including retroviral expression; two hybrid technologies; reporter systems; apoptosis detection;
and nucleic acid chemistry.
2、 感染性疾病诊断系统( Infectious Disease Diagnostics): 3、 临床标本采集系统( Sample Collection) 4、注射器产品系列(Injection System)
5、糖尿病及运动保健系统(Diabetic Health Care) 6、静脉输液系统(Infusion Therapy)
在新技术日新月异的今天,BD公司在不断创新,追求产品品质卓越的同时也十分重视中国用户的需求,力争把适合中国市场的一流的产品及服务提供给中国用户。在当今医疗行业相互联合、兼并以增强竞争力的今天,BD公司以其强大的竞争优势相继收购了Ohmeda、Difico、Pharmingen、Boin等多家公司,使公司的经营规模、市场份额及综合竞争能力有了飞跃性的发展,再次为世界同行所瞩目。
1994年BD公司进入中国以来,发展迅猛,已在全国设立北京、上海、广州、哈尔滨等九个代表处,并在苏州兴建了合资厂。展望下一个百年,BD公司提出了“To help all people live healthy lives”(令全人类享有健康生活),力争在全中国、全世界有更好的表现。
BD公司流式细胞仪培训计划
为了使贵院技术人员和临床医生能够迅速掌握流式细胞仪的应用,早日收回投资成本,我们特意制定这份计划书,以供贵院作为采购之参考。
一. 技术培训
技术培训的目的是让技术人员迅速掌握标本处理、上机操作和结果分析等操作技术。
装机后技术培训(名额不限)
时间:仪器安装调试完毕后一周内,为期一周。 地点:医院实验室 对象:操作仪器的技术员 内容:
1、 流式细胞仪基本原理及结构 2、 开机、关机程序及软件使用; 3、 自动、手动仪器校正及补偿调节; 4、 DNA标本处理及测定; 5、 免疫标本处理及测定; 6、 仪器维护与保养。
技术提高培训:(名额不限)
时间:仪器使用半年后,根据医院需要决定具体时间 地点:医院实验室 对象:技术人员 内容:
1、 白血病分型; 2、 微小残留病变检测; 3、 PNH诊断; 4、 血小板活化测定; 5、 CD34检测; 6、 HLA-B27检测。 7、 细胞内细胞因子检测 8、 细胞凋亡检测
二.应用培训
应用培训的目的是让临床医生尽快掌握流式细胞仪在临床上的应用,将流式检测项目应用到自己的临床诊断、鉴别诊断和治疗监测中,迅速提高全院的流式应用水平,同时让医院早日收回投资成本。
全院讲座
时间:装机培训结束后一周内,半天时间 地点:医院安排 对象:全院临床医生
内容:流式细胞仪临床应用及进展
血液科讲座
时间:由医院和科室安排 地点:由医院和科室安排 对象:血液科临床医生 内容:
1、 白血病免疫分型 2、 白血病和淋巴瘤诊断
3、 血小板表面糖蛋白检测与血小板疾病诊断 4、 白血病淋巴瘤治疗过程中免疫状态的监测 5、 如何阅读流式细胞仪化验报告单
肿瘤科讲座
时间:由医院和科室安排 地点:由医院和科室安排
对象:肿瘤科、外科、放化疗科临床医生 内容:
1、 流式细胞仪在肿瘤诊断、病理分级及预后中的应用 2、 放化疗过程中免疫状态监测 3、 细胞凋亡检测 4、 多药耐药检测 5、 肿瘤体外药敏测定
免疫相关科室
根据医院要求安排 内容:
1、 细胞免疫功能测定与免疫性疾病诊断 2、 免疫细胞活化检测 3、 细胞内细胞因子检测 4、 CD4计数与爱滋病诊断 其它科室
根据医院要求安排时间与内容(如血小板活化等)
三.维修培训
维修培训的目的是让医院的维修工程师掌握一定的流式细胞仪维修技术。 时间:仪器安装调试时 地点:医院实验室
对象:医院内部负责仪器维修的工程师 内容:
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1、 仪器原理介绍
2、 易损件(过滤器)的更换(1-2年换一次) 3、 常见故障排除
四.其它
可以考虑的科研课题
为了让流式细胞仪更好地发挥科研带动临床的作用,我们抛砖引玉,提供下列可以于近期考虑的课题,供临床科室参考。
1、 放化疗过程中免疫细胞活化研究 2、 钙离子阻断剂预防多药耐药研究
3、 化疗药物诱导肿瘤细胞表达P-170比例及水平定量研究
BD公司推荐配置单:
1 激光器配置:
15mw 488nm氩离子激光器,寿命>5000小时 3mw 635nm 红色激光器,寿命>5000小时
双激光配置可以增加很多使用染料,仪器所受限制少,可以根据所用染 料来选取开关激光 2 散射光及荧光探头数:
前向角散射光及侧向角散射光探头各一个 荧光探头4个
3 荧光检测灵敏度
5 脉冲检测器: 能同时检测每个脉冲信号的高度、面积和宽度,有效区分粘连的正常细胞和DNA含量改变的细胞 6 全套软件,软件能够免费升级 7 专用数据处理器,以市场最新型号为准
8 仪器有硬件升级空间,如:一体化分选装置, 药物筛选系统,CBA检测系统等
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BD公司与其他仪器比较表
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