一、实验目的
学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE) 测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质,在一定的pH 条件下解离而带电荷。当溶液的pH 大于蛋白质的等电点(pI)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液的pH 小于蛋白质的等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量的多少,可制成不同孔径的两层凝胶;这样,当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大,不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时,受到的阻滞基本相同,因此以相同的速率移动;当进入小孔胶时,分子量大的蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶的界面处,样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时,在制备上层胶(浓缩胶) 和下层胶(分离胶) 时,采用两种缓冲体系;上层胶pH=6.7—6.8,下层胶pH =8.9;Tris —HCI 缓冲液中的Tris 用于维持溶液的电中性及pH ,是缓冲配对离子;CI -是前导离子。在pH6.8时,缓冲液中的Gly -为尾随离子,而在pH =8.9时,Gly 的解离度增加;这样浓缩胶和分离胶之间pH 的不连续性,控制了慢离子的解离度,进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带的静电荷不同,而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDS 带有大量的负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内的二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS 充分结合,形成带负电性的蛋白质—SDS 复合物;此时,蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是:
M r =K(10-b ·m ) logMr =LogK—b ·R m ,
式中 M r ——蛋白质的分子量; logK ——截距; b ——斜率;
R m ——相对迁移率。
实验证明,蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内,电泳迁移率与分子量
的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率R m =蛋白质样品的迁移距离/染料(溴酚蓝) 迁移距离。这样,在同一电场中进行电泳,把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图,由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重 复性好的优点,是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。
三、试剂及主要器材 1.主要试剂 1) 标准蛋白混合液
内含:兔磷酸化酶B(Mw 97,400),牛血清蛋白(Mw 66,200),兔肌动蛋白(Mw 43,000),牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和鸡蛋清溶菌酶(Mw 14,400)
2)30%凝胶贮备液:丙烯酰胺(Acr ) 29.2g ,亚甲基双丙烯酰胺(Bis ) 0.8g, 加双蒸水至100mL 。外包锡纸,4℃冰箱保存,30天内使用。
3) 分离胶缓冲液(1.5mol/L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8, 定容100mL 。4℃冰箱保存
4) 浓缩胶缓冲液(0.5mol/L): Tris 6.06g,加水溶解,6mol/L HCl调pH6.8,并定容到100mL 。4℃冰箱保存
5) 电极缓冲液(pH8.3):SDS lg ,Tris 3g ,Gly 14.4g ,加双蒸水溶解并定容到1000mL 。4℃冰箱保存。 6)10%SDS ,室温保存
7) 质量浓度10%过硫酸铵(新鲜配制)
8) 上样缓冲液:0.5mol /L Tris-HCl pH6.8 1.25mL ,甘油2mL ,10%SDS 2mL,β-巯基乙醇1mL ,0.1%溴酚蓝0.5mL ,加蒸馏水定溶至10mL 。
9)0.25%考马斯亮蓝R-250染色液:0.25g 考马斯亮蓝R250,加入91ml50%甲醇,9ml 冰醋酸
10) 脱色液:50ml 甲醇,75ml 冰醋酸与875ml 双蒸水混合 11) 未知分子量的蛋白质样品(1mg/mL )
2.实验器材 1) 2) 3) 4) 5)
四、实验操作 1. 装板
将密封用硅胶框放在平玻璃上,然后将凹型玻璃与平玻璃重叠,将两块玻璃立起来使底端接触桌面,用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内,然后插入斜插板到适中程度, 即可灌胶。
DYCZ-24D 垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 电泳仪
长滴管及微量加样器
烧杯(250mL、500m1) 、量筒(500mL、 250m1) 、培养皿(15cm l5cm) 注射器等
2. 凝胶的聚合
分离胶和浓缩胶的制备:按下表中溶液的顺序及比例,配置10%的分离胶和4.8%的浓缩胶。
按上表各液加入混匀后配制成分离胶后,将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入,小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm 处为止, 约5mL 。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水, 约0.5-1mL 。室温放置聚合30-40min 。
待分离胶聚合后,用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分,按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面,插入样品模子(梳子) ;待浓缩胶聚合后,小心拔出样品模子。
3.蛋白质样品的处理
若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体,称取lmg 的样品溶解于lmL 0.5mol /L pH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中;若样品是液体,要测定蛋白质浓度,按1.0~1.5mg /mL 溶液比例,取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为15~20μg 的标准蛋白样品溶液,放置在0.5mL 的离心管中,加入15—20μl 的样品处理液。在100℃水浴中处理2min ,冷却至室温后备用。
吸取未知分子量的蛋白质样品20μl ,按照标准蛋白的处理方法进行处理。 4. 加样
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法
用手夹住两块玻璃板, 上提斜插板使其松开, 然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框, 注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力, 再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽, 插入斜板, 将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上, 外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm 处即可, 注意避免在电泳槽内出现气泡。
加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内,以准确定位加样位置,或用微量注射器依次在各样品槽内加样,各加10~15μl(含蛋白质10~15μg) ,稀溶液可加20~30μl (还要根据胶的厚度灵活掌握) 。 5.电泳
加样完毕,盖好上盖,连接电泳仪,打开电泳仪开关后,样品进胶前电流控制在15~20mA ,大约15~20min ;样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后,电流升到30~45mA ,电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿1~2cm 处即停止电泳,约1-2小时。如室温高,打开电泳槽循环水,降低电泳温度。 6.染色、脱色
电泳结束后,关掉电源,取出玻璃板,在长短两块玻璃板下角空隙内,用刀轻
轻撬动,即将胶面与一块玻璃板分开,然后轻轻将胶片托起,指示剂区带中心插入铜丝作为标志,放入大培养皿中染色,使用0.25%的考马斯亮蓝染液,染色2~4h ,必要时可过夜。
弃去染色液,用蒸馏水把胶面漂洗几次,然后加入脱色液,进行扩散脱色,经常换脱色液,直至蛋白质带清晰为止。 7.结果处理
1) 测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离) ,测量指示染料迁移的距离。
2) 按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)
相对迁移率=样品迁移距离(cm)/染料迁移距离(cm)
3) 标准曲线的制作:以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标,蛋白质分子量的对数为 纵坐标在半对数坐标纸上做图,得到一条标准曲线。
4) 测定蛋白质样品的分子量:根据待测蛋白质样品的相对迁移率,从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。
五、思考题
1. 聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么? 2. 电泳时的三个物理效应是什么?是怎样造成的? 3. 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用?为什么? 4. 上样缓冲液中加入甘油的作用是什么? 5. 贮液配制及贮存应注意什么?
6.过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用?
附:不同分离胶的配制方法 分离胶的浓度 双蒸水/ml 1.5mol/L Tris-Hcl(pH8.8)/ml 10%SDS/ml 凝胶储备液(Acr/Bis)/ml 10%过硫酸铵/ul TEMED/ul 总体积/ml
20% 0.75 2.5 0.1 6.6 50 5 10
15% 2.35 2.5 0.1 5.0 50 5 10
12% 3.35 2.5 0.1 4.0 50 5 10
10% 4.05 2.5 0.1 3.3 50 5 10
7.5% 4.85 2.5 0.1 2.5 50 5 10
PCR电泳实验步骤
(二)PCR产物电泳鉴定
1(目的:学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。
2(原理
DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到
凝胶介质的阻力不同,表现为不同的迁移率而被分开。
3(试剂
PCR产物,TAE电泳缓冲液,1000,溴化乙锭储存液,电泳级琼脂糖,
DNA分子量标准
4(实验准备
配制TAE电泳缓冲液(50,储存液,pH约8.5:Tris碱 242g,57.1ml冰乙酸,37.2g NaEDTA.2HO,dd water 定容至1L),6,加样缓22
冲液(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液);1.5ml离心管装入铝制饭
盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。
5(操作步骤
(1) 称取0.4g琼脂糖粉,放入三角瓶,加入50ml TAE电泳缓
冲液(1,),放入微波炉中烧开(1min)。注意观察烧瓶中的琼
脂糖粉末,待完全熔化后停止微波炉(切不可让胶溶液溢出到
微波炉中~)。
(2) 戴上线手套,从微波炉中取出三角瓶,置桌面上冷却致不
烫手(约50-60:C)。
(3) 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。
胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可,不要把胶溶液溢到外
面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。(剩下的胶溶液
封口后留待以后再熔化使用)。 (4) 在水平电泳槽中加满1,TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长
度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm),注意正负电极的位置连
接正确。
(5) 待胶完全凝固后(15-20分钟),小心拔出梳子。用手指捏
住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台
上,凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳
槽的负极。
(6) 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10,l的吸液头分别将管中
的样品加入凝胶的加样孔中(如果需要时,在相邻的加样孔中
加入1.5-3,l DNA分子量标准物)。加样时持移液器的手以肘
部固定在桌上,用另一只手扶住这只手的手腕,以减少移液器
的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后(不能伸得太
深,以免穿破凝胶的底部)缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。
切不可使蓝色样品流到孔外。
(7) 打开电源开关,样品将形成一条蓝色的横带向前移动(如
果发现蓝色向后移动,立即关闭电源,调换电极)。电泳将进
行约30min。
(8) 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时,关闭电源。取出
模具和凝胶。放入凝胶成像系统中拍照。
电泳实验步骤
电泳实验细节
实验步骤操作要点:
? 每组将2只50 mL、2只100 mL容量瓶,3只200ml烧杯洗净待用。
? 用100ml的容量瓶准确配制0.10 mol/L的KI、AgNO各100 mL待用,并配置0.010 mol/L3
两种溶液各50 mL备用。
? 用0.010 mol/L的KI和AgNO分别配制0.005mol/L的KI和AgNO新鲜溶液100 mL待33
用。
? 在洗净的200 mL烧杯中准确移入0.005 mol/L的KI 26.0 mL,在搅拌条件缓缓滴入22.0 ml左右的0.005 mol/L的AgNO,直至形成透明晶莹的AgI溶胶。 3
? 将制备好的溶胶沿洗净的电泳管中央细管缓缓加入,使溶胶高度与电极管口插入的电极头部同高(图二中刻度6)。
? 沿电泳管的管壁(图中2)滴入0.005mol/L的KNO辅助液,并且使辅助液要高出铂片3
约2 cm(图中刻度5),将滴加完KNO的溶液静置8-10分钟,观察辅助液与胶体间有无界3
面,无界面则重做。
? 打开电源之前,检查电源粗调旋钮是否在零位,若不在:一定要调至零点,然后再打开电源;再分别调节粗调 、细调两个旋钮,使电压稳定在160伏,电泳一段时间,使负极一端界面下降2.0 cm(即图中刻度5到刻度6),记下移动所用时间(s).注意:关闭电源时, 电压粗调旋钮也必须调至零点,方可关掉电泳电源开关。
? 用导线测量两电极铂片间溶胶的长度。
2相关公式: ,,300,4,,(h/t)/[E(V/L)]
,h:2cm ,E=81 ,V=160V , :在试验温度下水的黏度80,L:胶体的长度 ,t:上升所用时间。
(2)
1:中央细管 2:电泳管管壁 3:活塞 4:电极
PCR电泳实验步骤
水稻DNA提取,扩增与电泳实验
一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤
二、实验原理:1、提取DNA一般用水稻幼叶,先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎,然后加TPS抽提液水浴提取DNA,最后用无水乙醇沉淀DNA即可。(DNA提取原理)
2、DNA在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。(PCR原理)3、琼脂糖凝胶电泳:借助琼脂糖凝胶的分子筛作用,核酸片段因其分子量或分子形状不同,电泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品
液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP溶液、引物、TPS抽提液、无水乙醇、电泳槽、GoldView、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker
四、实验步骤
1、DNA提取
(1)取水稻叶子少量置于2ML离心管内,加入液氮研磨,带磨成粉状后,加1MLTPS抽提液,然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻
(2)水域结束后,取出离心管放入离心仪中,13600r/min离心12min,然后小心的取出离心管,将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml,加入600ul冷冻的无水乙醇,放入-80℃下冻10min,拿出放入离心仪13600r/min离心5min
(3)到处上清液,倒置,晾干约3h
(4)加入双灭菌水60ml,放入摇床中振荡一夜。
2、PCR
(1)按所需配料表,向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物,后引物,然后加入提取的DNA,混匀
(2)将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序
3、电泳
(1)称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。混匀倒入锥形瓶中,加热溶解混匀。待冷却至不烫手时加入GoldView,混匀,倒入已经插好梳子的配胶槽中,冷却30min至1h
(2)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中(将有点样孔的一端靠近负极)然后按照顺序点样,每个样的用来那个为4ul,在中间的空上点Marker溶液3ul
(3)打开电泳开关,电泳32min左右
(4)电泳结束后,将胶取出,放入透视镜下照射,拍照,读带
五注意事项
1、 提取dna的时候用乙醇是沉淀时,必须将乙醇冰冻
2、 在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下
双向电泳实验步骤
双向电泳实验流程
一、溶液配制
1(水化上样缓冲液(II)
尿素 7M 4.2g
硫脲 2M 1.52g
CHAPS 4% 0.4g MilliQ水定容至10ml,分装成10支EP管,每小管1ml,-20?冰箱保存。 临用时再现加以下物质:(1支量)
DTT 65mM 0.01g
40%Bio-Lyte 0.2%(w/v) 5,l 1%溴酚蓝 0.001% 痕量(裂解蛋白时不加)
2(胶条平衡缓冲液母液
尿素 6M 36g
SDS 2% 2g
Tris-HCl 0.375M pH8.8 25ml(1.5M pH8.8 Tris-HCl)
纯甘油 20% 20ml
MilliQ水 定容至100ml 分装成10管,每管10ml,-20?冰箱保存。
3(胶条平衡缓冲液I
胶条平衡缓冲液母液 5ml
DTT 0.1g
充分混匀,用时现配。
4(胶条平衡缓冲液II
胶条平衡缓冲液母液 5ml
碘乙酰胺 0.125g
充分混匀,用时现配。
5(低熔点琼脂糖封胶液
低熔点琼脂糖 0.5% 0.5g
Tris 25mM 0.303g
甘氨酸 192mM 1.44g
10% SDS 0.1% 1ml
1%溴酚蓝 0.001% 100,l MilliQ水定容至100ml
加热溶解至澄清,室温保存。
6(40% 聚丙烯酰胺贮液(购买)
7(1.5mol/L Tris碱 pH8.8
Tris碱 90.75g
MilliQ水 400ml
用1mol/L HCl调pH至8.8(大约加12-14 mlHCl就可以),加MilliQ水定容至500ml。
4?冰箱保存。
8(10% SDS
SDS 10g
MilliQ水 100ml
混匀后,室温保存。
9(10% Ap(过硫酸氨)
Ap 0.1g
MilliQ水 1ml
用时临时加水溶解,溶解后,冰盒中放置。
10(10×电泳缓冲液
(1×= 25mM Tris,192mM glycine,0.1% SDS,pH8.3)
Tris碱 30g
甘氨酸 144g
SDS 10g
MilliQ水 1L
混匀后,室温保存。
二、细胞样品的一般处理步骤
1. 800rpm,5min,离心去上清,收集细胞。
2. 加入Tris-蔗糖洗细胞,800rpm,10min,弃上清,共3次。
3. 液氮中反复冻融3次。
4. 加入5倍体积裂解液(即水化上样缓冲液2),混匀,20度左右放置1小时裂解。
5. 15000转,4?,离心1小时。
6. 收集上清于干净EP管中,测定蛋白含量浓度。
7. 按照每根胶条蛋白上样量为150ug来计算,总的上样体积为350ul,分装蛋白,冻存
于,80?。
三:第一向等电聚焦:
1. 从-20?冰箱中取出水II,置室温溶解,加入0.01g DTT、5,l Bio-Lyte和痕量溴芬兰,充分混匀,蛋白样品为淡蓝色。
2. 取出蛋白样品 ,l,加入 ,l水II, 20度左右放置40min,15000rpm,30min,取上清备用。
3. 从冰箱取-20?冷冻保存的IPG胶条(17cm pH 3-10 NL),室温放置10分钟让胶条充分融化。
4. 准备聚焦盘,一定要干净无水,最好头天晚上用去离子水冲洗干净晾干,本实验室聚焦盘中第3号和11号聚焦槽聚焦效果较好,所以在进行重泡涨时尽量用其他槽,沿着聚焦盘至左而右线性加入样品,样品液一定要连贯,不要产生气泡,有气泡的话会影响到胶条中蛋白质的分布。
5. 重泡涨:用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层,以下弯弧度将胶面朝下置于聚焦盘样品溶液上,并用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。确定没有气泡后,用保鲜膜封面,放到20度左右的房间,放置1h。
6.将胶条胶面朝下放入聚焦槽,正极在左。同样要排气泡,并且保证正负电极丝被胶条盖到。
7. 在每根胶条上覆盖3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。
8. 将聚焦槽对好正、负极,盖上盖子,设置等电聚焦程序:
水化 50V (17?) 14小时 被动水化
S1 100V 慢速 1小时 除盐
S2 250V 慢速 1小时 除盐
S3 500V 线性 1小时 除盐
线性 1小时 除盐 S4 1000V
S5 10000V 线性 5小时 升压
S6 10000V 快速 70000伏小时 聚焦
S7 500V 快速 任意时间 保持
, 选择所放置的胶条数。
, 设置每根胶条的极限电流。(50,A/根)
, 设置等电聚焦时的温度。(17?)
9.聚焦结束的胶条应立即进行第二向电泳,否则将胶条胶面朝上置于水化盘中,封口后-80?保存。
四、第二向SDS-PAGE电泳
1.胶板应事先洗干净并用去离子水冲干净,晾干,装胶板前用无水乙醇擦拭玻板,减少漏胶的机率,装板,倒入MillQ水检查是否漏水,不漏水的话将玻璃板倾斜,垫较多的干净滤纸,让其自然晾干。
2.配制10%的丙烯酰胺凝胶,每块凝胶40ml。配胶时注意顺序:
MilliQ水 19.2 ml 30%丙烯酰胺溶液 10 ml
1.5 mol/L Tris (pH8.8) 10 ml 10%SDS 400μl
10%AP 400μl TEMED 16μl 迅速搅拌均匀后迅速将胶注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用无水乙醇封面,保
持胶面平整,聚合30分钟。一般凝胶与乙醇明显分层就表明凝胶已基本聚合。倒去乙醇,用MilliQ水冲洗3次,多余的水用滤纸小心吸干。
3. 配制胶I。
4. 从-20?冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解。
5(胶面朝上放在干净的滤纸上,轻轻沾干胶条上的矿物油及多余样品,这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。
6. 将胶条转移至水化盘中,每根胶条加5ml胶条平衡缓冲液I,缓慢摇15分钟。
7. 配制胶II。
8. 彻底倒掉胶I,将胶条竖在滤纸上吸干水分,每根胶条加5ml胶II,继续在摇床上缓慢摇晃15分钟。
9. 将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解。
10.将10×电泳缓冲液稀释成1×电泳缓冲液。
11.将胶板平放在桌上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。
12.第二次平衡结束后,彻底倒掉水化盘中的胶II。将胶条竖在滤纸上吸干多余水分。将胶条放到板内,并加入低熔点琼脂糖封胶液。
13.在电泳外槽中加入1/3高度的1×电泳缓冲液,将胶板从胶架上取下,卡到电泳架上,放入电泳槽,在内槽中倒满1×电泳缓冲液,对好盖子上的正负极,接通电源,设定聚焦程序:
Sept 1:V=100v;I=5mA; T=01:00
Sept 2:V=300v;I=25mA;T=08:00
14. 电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶。
五、银染
1.固定
甲醇 125ml
冰醋酸 25ml
40%福尔马林 0.32ml
MilliQ水 100ml
轻摇2h或者轻摇过夜。
2.洗脱
无水乙醇 262ml
MilliQ水 488ml
一次用250ml,10min/次,3次.
3.敏化
NaSO(硫代硫酸钠) 0.7845g 223
40%福尔马林 10μl
MilliQ水 250ml
轻摇2min
4.洗脱
MilliQ水轻摇,5min/次,4次
5.染色
AgNO 0.5g 3
MilliQ水 250ml
40%福尔马林 0.5 ml
轻摇40min。(在这40分钟内配好显色和终止液)
6.洗脱
MilliQ水轻摇,1min/次,2次
7.显色
无水NaCO 15g 23
MilliQ水 250ml
40%福尔马林 0.32ml
NaSO(取第3步剩余液体) 5ml 223
约30秒,看到颜色合适时就倒入终止液。
8.终止
甲醇 125ml
冰醋酸 25ml
MilliQ水 100ml
轻摇,没有气泡了就可以倒掉终止液,进行第9步。
9.洗脱
MilliQ水轻摇,5min/次,2次
10.保存
MilliQ水250ml+冰醋酸2.5ml,浸泡,4?保存
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