高聚物的分子量及分子量分布,是研究聚合物及高分子材料性能的最基本数据之一。它涉及到高分子材料及其制品的力学性能,高聚物的流变性质,聚合物加工性能和加工条件的选择。也是在高分子化学、高分子物理领域对具体聚合反应,具体聚合物的结构研究所需的基本数据之一。
根据不同材质,选用不同体系的测试方法来做分子量检测,测试材质包括塑料、橡胶、及相关的其他高分子材料,尤其超高分子量聚乙烯的分子量检测。检测体系要水相体系、四氢呋喃(THF)体系、(DMF体系)。
【具体检测项目】
1、数均分子量的测定
在一个高聚物体系中,各种分子量的摩尔分数与其相应的分子量的乘积所得的总和。
2、光散射法测定重均相对分子量
当一束光通过圆柱形样品管时,光的大部分在透射后继续前进,而此时其它方向也因为溶液中介质的折光而发出散射光。由于介质的折光取决于介质的介电常数,是介质密度和浓度变化的结果(与渗透压有关),所以可根据Van-Hoff方程及维利展开式知道溶液光散色和聚合物分子量之间的关系。
3、粘度法测定聚合物相对分子量
粘度法:由于高分子溶液的粘度与高分子物分子量间有一定的关系,利用粘度来测定出高分子物分子量的方法。用粘度法所测出的分子量为粘均分子量。
4、凝胶渗透色谱(GPC)
利用高分子溶液通过填充有特种凝胶的柱,在柱上按其分子体积(流体力学体积)的大小进行分离的一种方法,是新型的液相色谱。
【表征方法及原理】
1.粘度法测相对分子量(粘均分子量Mη)
用乌式粘度计,测高分子稀释溶液的特性粘数[η],根据Mark-Houwink公式[η]=kMα,从文献或有关手册查出k、α值,计算出高分子的分子量。其中,k、α值因所用溶剂的不同及实验温度的不同而具有不同数值。
2.小角激光光散射法测重均分子量(Mw)
当入射光电磁波通过介质时,使介质中的小粒子(如高分子)中的电子产生强迫振动,从而产生二次波源向各方向发射与振荡电场(入射光电磁波)同样频率的散射光波。这种散射波的强弱和小粒子(高分子)中的偶极子数量相关,即和该高分子的质量或摩尔质量有关。根据上述原理,使用激光光散射仪对高分子稀溶液测定和入射光呈小角度(2℃-7℃)时的散射光强度,从而计算出稀溶液中高分子的绝对重均分子量(MW)值。采用动态光散射的测定可以测定粒子(高分子)的流体力学半径的分布,进而计算得到高分子分子量的分布曲线。
3.体积排除色谱法(SES)(也称凝胶渗透色谱法(GPC))
当高分子溶液通过填充有特种多孔性填料的柱子时,溶液中高分子因其分子量的不同,而呈现不同大小的流体力学体积。柱子的填充料表面和内部存在着各种大小不同的孔洞和通道,当被检测的高分子溶液随着淋洗液引入柱子后,高分子溶质即向填料内部孔洞渗透,渗透的程度和高分子体积的大小有关。大于填料孔洞直径的高分子只能穿行于填料的颗粒之间,因此将首先被淋洗液带出柱子,而其他分子体积小于填料孔洞的高分子,则可以在填料孔洞内滞留,分子体积越小,则在填料内可滞留的孔洞越多,因此被淋洗出来的时间越长。按此原理,用相关凝胶渗透色谱仪,可以得到聚合物中分子量分布曲线。配合不同组分高分子的质谱分析,可得到不同组分高分子的绝对分子量。用已知分子量的高分子对上述分子量分布曲线进行分子量标定,可得到各组分的相对分子量。由于不同高分子在溶剂中的溶解温度不同,有时需在较高温度下才能制成高分子溶液,这时GPC柱子需在较高温度下工作。
4.质谱法
质谱法是精确测定物质分子量的一种方法,质谱测定的分子量给出的是分子质量m对电荷数Z之比,即质荷比(m/Z)过去的质谱难于测定高分子的分子量,但近20余年由于我的离子化技术的发展,使得质谱可用于测定分子量高达百万的高分子化合物。这些新的离子化技术包括场解吸技术(FD),快离子或原子轰击技术(FIB或FAB),基质辅助激光解吸技术(MALDI-TOFMS)和电喷雾离子化技术(ESI-MS)。由激光解吸电离技术和离子化飞行时间质谱相结合而构成的仪器称为“基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱”(MALDI-TOFMS激光质谱)可测量分子量分布比较窄的高分子的重均分子量(Mw)。由电喷雾电离技术和离子阱质谱相结合而构成的仪器称为“电喷雾离子阱质谱”(ESI-ITMS电喷雾质谱)。可测量高分子的重均分子量(Mw)。
5.其他方法
测定高分子分子量的其他方法还有:端基测定法,沸点升高法,冰点降低法,膜渗透压法,蒸汽压渗透法,小角X-光散射法,小角中子散射法,超速离心沉降法等。
【具体测试仪器】
乌式粘度计
激光光散射仪
凝胶渗透色谱仪
质谱仪
分子量与分子量分布2
第4章 分子量与分子量分布
Molecular Weight Molecular Weight Distribution
4.2.4 粘度法
相对粘度ηr 增比粘度ηsp
η ηr = 纯溶剂的粘度 η0 η - η0 ηsp = = ηr - 1 η0
ηsp c 与 lnηr c
溶液的粘度
比浓粘度与比浓对数粘度 特性粘数[η]
lnηr [η] = lim = lim c →0 c c →0 c
ηsp
(1)特性粘数与分子量的关系
Mark-Houwink方程:
[η] = KM
α η
K值与体系性质有关, 随聚合物分子量的增加而略减小, 随温 度增加而略下降. α 值与高分子在溶液中的形态有关, 取决于 温度、高分子和溶剂的性质。α 一般在0.5~1之间 对于一定的高分子-溶剂体系, 在一定温度和分子量范围内, K 和α 值为常数
lg [ η] = lgK + αlgM
(2) 粘度的浓度依赖性
ηsp = [ η] + k [ η] c
2
c lnηr 2 = [ η] - β [ η] c c
ηsp c
η t ηr = = η0 t0
[ η]
lnηr c
c
一点法求特性粘数
ηsp c
= [ η] + k [ η] c
2
lnηr 2 = [ η] - β [ η] c c
1 当k+ β = 时 2
1 [η] = 2 ( ηsp - lnηr ) c
1 k' 当 k' + β ≠ 时,令 = γ 2 β
[ η] =
ηsp + γlnηr
(1 + γ ) c
(3) Flory特性粘数理论
一个高分子线团被想像成一个体积为Vh的流体力 学等效球, 由于线团的高度不规则的几何形状及 其同溶剂的相互作用, 其流体力学体积必然要大 于分子的实际体积 Einstein粘度公式:
? Vh ? [η] = lim = 2.5N A ? ? c →0 c ?M? ηsp
流体力学 体积
具体形式:
(h ) [ η] = Φ
2
3
2
M
Φ 称为Flory常数, 与高分子、溶剂和温度无关 Φ = 2.0 ~ 2.8 × 10 23 无扰尺寸A
在θ 条件下, 有:
[η]θ
[η]θ = K θ M
1 2
(h ) =Φ
2 0
3
2
M
? h02 = Φ? ?M ?
? ? ? ?
3 2
? ? ? ?
3
2
M
1
2
? h02 Kθ = Φ ? ?M ?
= ΦA
3
Kθ的计算
测定高分子在良溶剂中的特性粘数, 由下式作图:
[ η]
M
M
1
1
2
= K θ + 0.51BM
1
1
2
[ η]
2
~M
2
作图, 截距为Kθ
4.3 聚合物分子量分布的测定方法
利用聚合物溶解度的分子量依赖性, 将试样分成分 子量不同的级分, 从而得到试样的分子量分布, 如 沉淀分级, 溶解分级 利用聚合物在溶液中的分子运动性质, 得到分子量 分布, 如超速离心沉降速度法 利用高分子尺寸的不同, 得到分子量分布, 如凝胶 渗透色谱法, 电子显微镜法
重量积分分布曲线
第i个级分的累积重量为:
i ?1 1 Ii = Wi + ∑Wi 2 i =1
Ii : 分子量小于等于Mi的聚合 物分子所占的重量分数
“十点法”求分子量
从分子量积分重量分布曲线上,读取I=0.05、 0.15 …… 0.95共十点的分子量(其物理意义是将 试样分成假想的十个等重量级分),按下式可以 计算数均和重均分子量:
M w = 0.1∑ M i
i =1
10
10 M n = 10 1 ∑M i =1 i
凝胶渗透色谱(GPC) Gel Permeation Chromatography
一种新型的液体色谱,1964年,J. C. Moore 首先研究成功。 不仅可用于小分子物质的分离
与鉴定,而且 可作为用来分析化学性质相同但分子体积不 同的高分子同系物。 现阶段,已经成为最为重要的测定聚合物的 分子量与分子量分布的方法。
solution
solvent
体积大的分子先 被淋洗出来 体积小的分子后 被淋洗出来
浓度检测器
(1) 测定原理
淋出体积:自试样进入色谱柱到淋洗出来,所接收到的 淋出液的体积,称为该试样的淋出体积Ve。 当仪器与实验条件确定后,溶质的淋出体积与其分子量 有关,分子量越大,其淋出体积越小。
分子量越小,分子的体积越小,在流动过程中,不仅 会从载体间较大空隙通过,还会从载体内部的小孔通 过,经过的路程长;而体积大的大分子量的分子只能 从载体间的空隙通过,经过的路程短,所以最大的分 子会最先被淋洗出来。
(2) 体积排除机理
溶质分子的体积越小, 其淋出体积越大. 这种 解释不考虑溶质与载体间的吸附效应以及溶 质在流动相和固定相中的分配效应, 其淋出体 积仅仅由溶质分子的尺寸和载体的孔径尺寸 决定, 分离完全是由于体积排除效应所致, 所 以GPC又被称为体积排除色谱(SEC, Size Exclusion Chromatography)
GPC曲线
浓度响应
W(M)
淋出体积或淋出时间
大
小
M
淋出体积代表了分子量的大小--M; 浓度响应代表了含量--W(M) GPC曲线就是聚合物的分子量分布曲线
(3) 级分分子量的确定
直接法:在测定淋出液浓度的同时测定其粘度 或光散射。 间接法:采用一组分子量不等、单分散的样品 (标样),分别测定其淋出体积与分子量,从 而标定色谱柱分离的分子量与其淋出体积间的 关系----分子量-淋出体积标定曲线。
分子量-淋出体积标定曲线
一般而言,分子量与淋出 体积间具有如下关系:
log M = A ? BVe
logM logMa logMb V0
C A B D M1 M2 M3 M4 M5
V1 V2 V3 V4 V5
Ve
当分子量大于Ma时, 曲线如何? 当分子量小于Mb时, 曲线如何?
色谱柱的分离范围: Mb~Ma
Ve
实例:等规聚苯乙烯样品(高温GPC)
b
a
b d e c a
c
f
4
5 logMw
6
7
4
5 logMw
6
7
Mw: MDW:
3,400,000 2.8
1,800,000 12.8
普适校正曲线
分离机理 分子尺寸
大 小 Ve 小 Ve 大
分子量大 分子量小
不同的高分子, 分子量相同, 其分子尺寸是否一定相同?
GPC实验确定分子量及其分布时, 必须采用结构相同的、已知分子量 的、单分散的试样作为标样,从而 得到其校正曲线 线性PE 支化PE 能否用一种标样得到的校正曲线来 确定所有聚合物试样的分子量?
Flory 特性粘数理论
(h ) [ η] = Φ
2
3
2
M
[ η] M = Φ ( h
2
)
3
2
? Vh ? [ η] = 2.5N A ? ? ?M?
Ve 小 Ve 大
分子量大 分子量小
流体力学体积
Ve ~ Vh ~ [η]M log([η]M ) ~ Ve 作图,对所有聚合物都适用
在相同的测试条
件下, 淋出体积相等的高分子, 其流体力学体积相等
log ([η1 ]M 1 ) = log ([η2 ]M 2 )
Mark-Houwink方程
[η]1 = K 1 M , [η]2 = K 2 M
α1 1
α2 2
logK 1 + α1logM 1 + logM 1 = logK 2 + α2 logM 2 + logM 2
1 + α1 K1 1 logM 2 = logM 1 + log 1 + α2 1 + α2 K2
如果K1, K2, α1, α2已知, 即可由标样(M1)的分子量-淋出体积 曲线求出待测试样的分子量-淋出体积标定曲线
本章总结
分子量的统计意义 分子量的测定方法
端基分析法, 沸点上升法, 冰点下降法, 气相 渗透法, 膜渗透压法, 光散射法, 粘度法
分子量分布的测定方法
凝胶色谱法
分子量及分布
分子量及分布
一、DLS(Dynamic Light Scattering )
动态光散射
1. 测试适用于:测量粒径,Zeta 电位、大分子的分子量等
2. 测试原理:
光通过胶体时,粒子会将光散射,在一定角度下可以检测到光信号,所检测到的信号是多个散射光子叠加后的结果,具有统计意义. 瞬间光强不是固定值,在某一平均值下波动,但波动振幅与粒子粒径有关。某一时间的光强与另一时间的光强相比,在极短时间内,可以认识是相同的,我们可以认为相关度为1, 在稍长时间后,光强相似度下降,时间无穷长时,光强完全与之前的不同,认为相关度为0。根据光学理论可得出光强相关议程。正在做布朗运动的粒子速度,与粒径(粒子大小)相关(Stokes - Einstein方程)。 大颗粒运动缓慢,小粒子运动快速。如果测量大颗粒,那么由于它们运动缓慢,散射光斑的强度也将缓慢波动。类似地,如果测量小粒子,那么由于它们运动快速,散射光斑的密度也将快速波动。附件五显示了大颗粒和小粒子的相关关系函数。 可以看到,相关关系函数衰减的速度与粒径相关,小粒子的衰减速度大大快于大颗粒的。最后通过光强波动变化和光强相关函数计算出粒径及其分布。
二、GPC (Gel Permeation Chromatography )
凝胶渗透色谱
1. 测试适用于:分离相对分子质量较小的物质,并且还可以分析
分子体积不同、具有相同化学性质的高分子同系物。
2. 测试原理:
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱,柱中可供分子通行的路径有粒子间的间隙(较大)和粒子内的通孔(较小)。当聚合物溶液流经色谱柱时,较大的分子被排除在粒子的小孔之外,只能从粒子间的间隙通过,速率较快;而较小的分子可以进入粒子中的小孔,通过的速率要慢得多。经过一定长度的色谱柱,分子根据相对分子质量被分开,相对分子质量大的在前面(即淋洗时间短),相对分子质量小的在后面(即淋洗时间长)。自试样进柱到被淋洗出来,所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。 当仪器和实验条件确定后,溶质的淋出体积与其分子量有关,分子量愈大,其淋出体积愈小。
3. 测试步骤:
直接法: 在测定淋出液浓度的同时测定其粘度或光散射,从而求出其分子量。 间接法: 用一组分子量不等的、单分散的试样为标准样品,分别测定它们的淋出体积和分子量,则可确定二者之间的关系.
1). 溶剂的选择: 能溶解多种聚合物;不能腐蚀仪器部件;与检测器相匹配。
2). 把激光光散射与凝胶色谱仪联用,在得到浓度谱图的同时,还可得到散射光强对淋出体积的谱图,从而计算出分子量分布曲线和整个试样的各种平均分子量
3). 激光光散射实验中必须对样品严格除尘,溶液中的灰尘会产生强烈的光散射,严重干扰聚合物溶液光散射的测量。溶液除尘是光散射成败的关键。首先是溶剂除尘,配置测试样品的溶剂应进行精馏,并经过0.2μm 超滤膜过滤后方可使用。配好的溶液也要用0.2μm 的超滤膜过滤。另外,测试中所用的器械,如:注射器等,使用前要用洗液浸泡,清水强力冲洗。
三、色谱法 chromatography
气相色谱仪 gas chromatograph
液相色谱仪 liquid chromatograph
1. 测试适用于:多组份混合物的分离、分析
2. 测试原理:
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配,以固定相对流动相中的混合物进行洗脱,混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动,最终达到分离的效果。
3. 测试步骤:
气相色谱仪
由载气带入,通过对欲检测混合物中组分有不同保留性能的 气相色谱仪
色谱柱,使各组分分离,依次导入检测器,以得到各组分的检测信号。按照导入检测器的先后次序,经过对比,可以区别出是什么组分,根据峰高度或峰面积可以计算出各组分含量。
液相色谱仪
储液器中的流动相被高压泵打入系统, 样品溶液经进样器进入流动相, 被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附-解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪, 数据以图谱形式打印出来高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统
GFC分子量分布计算
质量风险评估报告
质量风险评估报告
1. 项目概述
根据物流部生产任务,生物药原料二车间需增加生产设备以适应增加的生产任务,新增加的生物反应器除通气方式外均与之前的生物反应器相同。为保证能产出合格的中间产品,现根据《药品生产质量管理规范》(2010年修订)第二章第十四条规定:应当根据科学知识及经验对质量风险进行评估,以保证产品质量。针对通气方式的变更可能对产品质量产生的影响进行一系列评估并对可能影响产品质量变化的风险进行分析。 2. 范围
本风险评估适用于生物药原料二车间新增反应器(4号~12号)及原有反应器(1号~3号)相关变更及影响的相关项目进行风险识别与分析,并采取适当控制措施保证生产过程产品质量风险可控。 3. 风险识别及分析 3.1通气方式变更前后对比
3.2 风险说明
接种前溶氧不同,质量流量计的操作方法及操作参数与目前流量计的操作方法及操作参数不同,均会影响细胞生长状态,可能出现如下风险:
(1)接种前不通入氮气调节溶氧,导致溶氧下降缓慢,超出SOP 规定范围。 (2)流量计的更换,通气方式从根本上改变,导致溶氧控制不稳,波动超出SOP 规定范围。
(3)流量计的更换,导致中间产品质量与更换前存在差异。 3.3 风险分析
针对“3.2”中风险进行实验室与车间正常生产同时进行反应器流量计及接种前溶氧变更可行性实验,通过过程控制参数、中间产品质量检测进行对比分析。
3.3.1 “接种前不通入氮气调节溶氧,导致溶氧下降缓慢,超出SOP 规定范围。”项风险分析。
通过实验对比,在接种前不通入氮气调节溶氧的前提下,溶氧未出现异常波动,均符合SOP 规定范围,具体参见《Applikon-7L 反应器流量计及接种前溶氧变更可行性实验报告》。
3.3.2 “流量计的更换,通气方式从根本上改变,导致溶氧控制不稳,波动超出SOP 规定范围。”
通过实验对比,更换流量计后,溶氧未出现异常波动,均符合SOP 规定范围,具体参见《Applikon-7L 反应器流量计及接种前溶氧变更可行性实验报告》。 3.3.3 “流量计的更换,导致中间产品质量与更换前存在差异。”
通过实验对比,更换流量计后,产出的中间产品经过质量分析,符合《重组人促卵泡激素中间产品质量标准》[STP02-537/X],具体参见《Applikon-7L 反应器流量计及接种前溶氧变更可行性实验报告》。 4. 结论
质量流量计比目前使用的转子流量计对气体控制更加精确,在生产开始前进行质量流量计参数摸索实验,确定操作参数并升级在相关文件中并与新增反应器共同进行相关验证(安装运行性能确认),确保不会影响最终产品质量。经分析将生产车间新增生产设
备变更中新增反应器通气方式相关变更判断为低风险。
分子量分布方法
GPC测相对分子质量(分子量分布)
实验仪器: 凝胶色谱仪(型号ELEOS System 制造商Wyatt)
基本配置:Waters515泵 激光检测器(LS) 示差检测器(DRI)
实验步骤:
流动相:NaNO3
色谱柱:OHpak系列 SB-802.5HQ
Flow rate: 0.500 mL/min
柱温:25度
进样量:20微升
前处理:称取一定量的硝酸钠溶于水并稀释至1L,配制成0.2mol/L的硝酸钠溶液,过0.22微米孔径滤膜,超声波脱气15min。称取一定量的样品溶于流动相中,定容至100mL。移取此溶液10mL,用流动相稀释并定容至50mL,过膜,上机。 没有标准曲线
1. 打开仪器电源,待仪器各部分自检完成,设定流速,柱温等参数,平衡系统;
2. 打开计算机,运行ARTRAV软件,设定流速,时间等参数;
3. 取基线,待基线平稳,开始进样;
4. 数据处理 定基线,定峰。
重均相对分子质量Mw 多分散系数Mw/Mn
数均分子量(Mn)、重均分子量(Mw )、分布系数(Mw /Mn)等, 但GPC 需要相同物质作为标样, 如用不同的标准品将有不同的结论, 因此该法所给出的是分子量的相对值
S色谱柱长宽
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