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分子杂交
分子杂交
分子杂交(molecularhybridization )确定单链核酸碱基序列的技术。其基本原理是待测单链核酸与已知序列的单链核酸(叫做探针)间通过碱基配对形成可检出的双螺旋片段。这种技术可在DNA 与DNA ,RNA 与RNA ,或DNA 与RNA 之间进行,形成DNA-DNA ,RNA-RNA 或RNA-DNA 等不同类型的杂交分子。作为探针的已知DNA 或RNA 片段一般为30~50核苷酸长,可用化学方法合成或者直接利用从特定细胞中提取的mRNA 。探针必须预先标记以便检出杂交分子。标记方法有多种,常用的为同位素标记法和生物素标记法。杂交方法又可分为液相杂交和固相杂交。
使单链DNA 或 RNA 分子与具有互补碱基的另一DNA 或RNA 片断结合成双链的技术。即核酸分子间的杂交。相互杂交的两种核酸分子间有时并非完全一致,但必有一定的相关性。早在1961年有人创建了DNA 与RNA 间的分子杂交,但至70年代才发展成基因分析中一种重要的分析技术,可鉴定基因的特异性。例如可将具有一定已知顺序的某基因的 DNA 片段,标上放射性核素,构成核酸探针,将它通过分子杂交与缺陷的基因结合,产生杂交信号,从而把缺陷的基因显示出来,借此可对许多遗传性疾病进行产前诊断。现又用核酸分子杂交技术诊断乙型肝炎,以及研究其他病毒性疾病和癌瘤的基因结构(癌基因)等。 核酸分子杂交的方法并不复杂。在杂交前先把待分析的DNA 加热或加碱使之变性, 分开成单链;然后加入放射性核素标记的核酸探针, 降温退火, 即获带有放射性核素标记的双链杂交分子。1979年又发展成转膜杂交,即将电泳分开的核酸片段,经过转移电泳转移到硝酸纤维素膜上,进行固相杂交反应,用放射自显影检出之。此即著名的萨瑟恩氏印迹法。 无庸置疑,分子杂交的基础是两个核酸分子间的完全一致,或有一定的相似性或相关性。若所用的核酸探针的片段较长(几百个核苷酸以上) ,可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短(如20~30个核苷酸),则难免会出现准确性差的假阳性现象。现又有非放射性核素标记核酸探针,如以碱性磷酸酶标记的酶标核酸探针,以及以生物素标记的核酸探针等,这必将有助于推动分子杂交在临床医学中的广泛应用。
杂交技术
分子杂交目前使用较多的是固相杂交法。此法是先将待测单链核酸样品(如为双链,则须先变性成为单链)结合到硝酸纤维素膜上,然后与溶液中的标记探针进行杂交。通过与电泳法和放射自显影法结合,获得杂交图谱,再进行定性或定量分析。分子杂交方法广泛用于生物化学、分子生物学中作为核酸片段碱基序列的检测与鉴定手段。在医学领域中已用于某些病毒或细菌引起的感染性疾病的诊断。它也可用于基因工程。不同来源蛋白质的亚基结合过程也可称为杂交。
分子杂交(molecularhybridization )不同来源的核酸单链之间或蛋白质亚基之间由于结构互补而发生的非共价键的结合。根据这一原理发展起来的各种技术统称为分子杂交技术,核酸分子杂交技术是分子遗传学中的重要研究方法。
核酸分子杂交具有互补的碱基顺序的单链核酸分子,可以通过碱基对之间非共价键(主要是氢键)的形成即能出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂种分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂种双链。分子杂交可在DNA 与DNA 、RNA 与RNA 或RNA 与DNA 的二条单链之间进行。由于DNA 一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA 分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH 值来实现。使单链聚合为双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分
子杂交。由于同位素被检出的灵敏度高,所以在两种核酸分子之间即使只有百万分之一的同源顺序也可以彼检出。
核酸分子杂交按杂交中单链核酸所处的状态可分为液相、固相和原位3类。前二类方法都要求预先从细胞中分离并纯化杂交用的核酸。在液相分子杂交中,两种来源的核酸分子都处于溶液中,可以自由运动,其中有一种常是用同位素标记的。从复性动力学数据的分析可探知真核生物基因组结构的大致情况,如各类重复顺序的含量及分布情况等。在固相分子杂交中,一种核酸分子被固定在不溶性的介质上,另一种核酸分子则处在溶液中,两种介质中的核酸分子可以自由接触。常用的介质有硝酸纤维素滤膜、羟基磷灰石柱、琼脂和聚丙烯酰胺凝胶等。早期用琼脂作为固定介质的分子杂交方法曾被用来测定从细菌到人多种生物的DNA 的同源程度。
1975年由E .萨瑟恩首创的萨瑟恩吸印法是一种方便易行的固相杂交方法。先将待测的DNA 用限制性内切酶切成片段,然后通过凝胶电泳把大小不同的片段分开,再把这些DNA 片段吸印到硝酸纤维膜上,并使吸附在滤膜上的DNA 分子变性,然后和预先制备的DNA 或RNA 探针进行分子杂交,最后通过放射自显影就可以鉴别待测的哪个DNA 片段和探针具有同源顺序。精确控制杂交及洗涤条件(如温度及盐浓度),在同源顺序中即使有一对碱基错配也可检出。这技术已应用于遗传病(基因病)的临床诊断。另一种相似的方法是将待测的RNA 片段吸印在重氮苄氧甲基(DBM )纤维素膜或滤纸上,然后和预先制备的DNA 探针进行分子杂交,这种方法称为诺森吸印法。这些技术大大地推进了分子遗传学研究和重组DNA 技术的应用。
原位(分子)杂交实际上是固相杂交的另一种形式,杂交中的一种DNA 处在未经抽提的染色体上,并在原来位置上被变性成单链,再和探针进行分子杂交。在原位杂交中所使用的探针必须用比活性高的同位素标记。杂交的结果可用放射自显影来显示,出现银粒的地方就是与探针互补的顺序所在的位置。
基因定位
分子杂交理论和技术在基因定位的工作中,对固定在细胞学制片上的染色体DNA 进行原位杂交,可以将与探针互补的顺序精确地定位到染色体的一定位置上。
在基因定位工作中,还可以应用一种在电镜下直接观察杂种分子的原位杂交方法,即所谓的R-环法。R-环是在双链DNA 分子部分变性的情况下,单链的RNA 分子和相应的DNA 序列中的一条互补的单链形成RNA-DNA 的杂合双链,同时DNA 的另一条单链向外突出而形成的环状图象。由于每种mRNA 由特定的基因所转录,和这一基因的一个DNA 单链具有互补结构,因此通过观察标记mRNA 参与构成的R 环的位置就可以对产生这种mRNA 的基因进行定位,这一方法还可以用来研究断裂基因的结构。
在重组DNA 技术中,有些专门的原位杂交方法可以用来筛选有探针顺序的重组质粒或噬菌体。此外,分子杂交方法还可以用来分离具有特定顺序的核酸分子。例如使探针与细胞的总DNA 进行分子杂交,利用羟基磷灰石柱只吸附双链分子的特性,可以分离与探针互补的DNA 片段或RNA 分子。
蛋白质分子杂交来自不同的蛋白质的亚基间也可以形成非共价键的结合,这是蛋白质分子杂交的基础。蛋白质分子杂交技术可以用来研究蛋白质的结构和功能以及相似的蛋白质(如同工酶、血红蛋白等)的亲缘关系。例如通过人、狗、兔、驴、小鼠和蛙等动物的血红蛋白的蛋白质分子杂交测验,根据能否形成杂种分子和杂种分子的量,可以判断它们的蛋白质分子的相似程度。
实验原理
分子杂交是通过配对碱基对之间的非共价键(主要是氢键)结合,从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA 与DNA 、RNA 与RNA 或RNA 与DNA 的二条单链之间进行。由于DNA 一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA 分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH 值来实现。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。
杂交类型
随着基因工程研究技术的迅猛发展,新的核酸分子杂交类型和方法在不断涌现和完善。核酸分子杂交可按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型:
分子杂交(1)固相杂交
将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上,一条反应核酸游离在溶液中。固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。由于固相杂交后,未杂交的游离片段可容易地漂洗除去,膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA 自我复性等优点,所以最为常用。常用的固相杂交类型有:菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern 印迹杂交、Northern 印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。
(2)液相杂交
所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中,一种研究最早且操作复合的杂交类型,在过去的30年里虽有时被应用,但总不如固相杂交那样普遍。主要缺点是杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较为困难和误差较高。近几年由于杂交检测技术的不断改进,商业性基因探针诊断盒的实际应用,推动了液相杂交技术的迅速发展。
固相膜核酸分子杂交
(1)菌落原位杂交(Colonyinsituhybridization )
将细菌从培养平板转移到硝酸纤维素滤膜上,然后将滤膜上的菌落裂菌以释出DNA ,再烘干固定DNA 于膜上,与32P 标记的探针杂交,放射自显影检测菌落杂交信号,并与平板上的菌落对位。
(2)斑点杂交(Dotblotting )
该方法是将被检标本点到膜上,烘烤固定。这种方法耗时短,可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品。为使点样准确方便,市售有多种多管吸印仪(manifolds ),如MinifoldI 和II 、Bio-Dot (Bio-Rad )和Hybri-Dot ,它们有许多孔,样品加到孔中,在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状,反复冲洗进样孔,取出膜烤干或紫外线照射以固定标本,这时的膜就可以进行杂交。
(3)Southern 印迹杂交(Southernblotting )
是研究DNA 图谱的基本技术,在遗传诊断DNA 图谱分析及PCR 产物分析等方面有重要价值。基本方法是将DNA 标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段,然后经碱变性,Tris 缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将DNA 从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜(尼龙膜也较长用)上,烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA 片段的相对位置转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的DNA 与32P 标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA 带的位置,从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA 片段的位置和大小。
(4)Northern 印迹杂交(Northernblotting )
DNA 印迹技术由Southern 于1975年创建,称为Southern 印迹技术。RNA 印迹技术正
好与DNA 相对应,故被称为Northern 印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为westernblotting 。Northern 印迹杂交的RNA 吸印与Southern 印迹杂交的DNA 吸印方法类似,只是在进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA 变性,而不用NaOH ,因为它会水解RNA 的2’-羟基基团。RNA 变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜,否则RNA 会被洗脱。在胶中不能加EB ,因它为影响RNA 与硝酸纤维素膜的结合,为测定片段大小,可在同一块胶上加标记物一同电泳,之后将标记物胶切下,上色、照像。样品胶则进行Northern 转印,标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L醋酸铵中10min ,在水中就可脱色。在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA 胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或白炽灯下暴露过久,会使RNA 信号降低。从琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA 时,甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase 的污染。
(5)组织原位杂交(Tissueinsituhybridization )
简称原位杂交,指组织或细胞的原位杂交,它与菌落的原位杂交不同,菌落原位杂交需裂解细菌释出DNA ,然后进行杂交。而原位杂交是经适当处理后,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA 或RNA 杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。例如,对致密染色体DNA 的原位杂交可用于显示特定的序列的位置;对分裂期间核DNA 的杂交可研究特定序列在染色质内的功能排布;与细胞RNA 的杂交可精确分析任何一种RNA 在细胞中和组织中的分布。此外,原位杂交还是显示细胞亚群分布和动向及病原微生物存在方式和部位的一种重要技术。
用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA ,也可以是RNA 探针,探针的长度通常以100~400nt 为宜,过长则杂交效率减低。最近研究结果表明,寡核苷酸探针(16~30nt )能自由出入细菌和组织细胞壁,杂交效率明显高于长探针。因此,寡核苷酸探针和不对称PCR 标记的小DNA 探针或体外转录标记的RNA 探针是组织原位杂交的优选探针。
试验方法
杂交
通过碱基对之间非共价键的形成即出现稳定的双链区,这是核酸分子杂交的基础。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补,所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序(即某种程度的同源性)就可以形成杂交双链。分子杂交可在DNA 与DNA 、RNA 与RNA 或RNA 与DNA 的二条单链之间进行。由于DNA 一般都以双链形式存在,因此在进行分子杂交时,应先将双链DNA 分子解聚成为单链,这一过程称为变性,一般通过加热或提高pH 值来实现。使单链聚合双链的过程称为退火或复性。用分子杂交进行定性或定量分析的最有效方法是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针,再与另一种核酸单链进行分子杂交。核酸杂交技术基本上是Hall 等1961年的工作开始的,探针与靶序列在溶液中杂交,通过平衡密度梯度离心分离杂交体。该法很慢、费力且不精确,但它开拓了核酸杂交技术的研究。Bolton 等1962年设计了第一种简单的固相杂交方法,称为DNA-琼脂技术。变性DNA 固定在琼脂中,DNA 不能复性,但能与其它互补核酸序列杂交。典型的反应是用放射性标记的短DAN 或RNA 分子与胶中DNA 杂交过夜,然后将胶置于柱中进行漂洗,去除游离探针,在高温、低盐条件下将结合的探针洗脱,洗脱液的放射性与结合的探针量呈正比。该法尤其适用于过量探针的饱和杂交实验。60年代末,Britten 等设计了另一种分析细胞基因组的方法。该法是研究液相中DNA 的复性以比较不同来源核酸的复杂度,典型的方法是:从不同生物体(细菌、酵母、鱼和哺乳动物等)内分离DNA ,用水压器剪切成长约450核苷酸(nt )的片段。剪切的DNA 液(含0.12mol/L磷酸盐缓冲液或
0.18mol/LNa+),经煮沸使dsDNA 热变性成ssDNA 。然后冷至约60℃,在此温度孵育过程中,测定溶液一定时间内的UV260nm 的吸光度(减色效应)来监测互补链的复性程度。通常该实验可比较不同来源生物DNA 的复性速率,并可建立序列复杂度与动力学复杂度间的关系。
60年代中期Nygaard 等的研究为应用标记DNA 或RNA 探针检测固定在硝酸纤维素(NC )膜上的DNA 序列奠定了基础。如Brown 等应用这一技术评估了爪蟾rRNA 基因的拷贝数。RNA 在代谢过程中被3H 尿嘧啶标记,并在过量的情况下与膜上固定的基因组DNA 杂交,继而用RNase 处理,消化非特异性结合的RNA 。漂洗后计数以测定杂交探针的量。通过计算与已知量DNA 杂交的RNA 量即可评估rRNA 基因数。由于当时缺乏特异探针,这种方法不能用于研究其它特异基因的表达,这些早期过量探针膜杂交试验实际上是现代膜杂交实验的基础。进入70年代早期,许多重要的发展促进了核酸杂交技术的进展。例如,对特异基因转录产物的分析和对动力学杂交实验又有兴趣。固相化的PolyU –Sepharose 和寡(dT )-纤维素使人们能从总RNA 中分离PolyA+RNA。用mRNA 的经纯化技术可从网织红细胞总RNA 中制备α-和β-珠蛋白mRNA 混合物。这些珠蛋白mRNA 首次被用于合成特异的探针以分析珠蛋白基因的表达。由于制备cDNA 探针很繁琐,所获得cDNA 的长度和纯度也不稳定。所以寻求新的探针来源是使分子杂交技术进一步推广的基础。
70年代末期到80年代早期,分子生物学技术有了突破性进展,限制性内切酶的发展和应用使分子克隆成为可能。各种载体系统的诞生,尤其是质粒和噬菌体DAN 载体的构建,使特异性DNA 探针的来源变得十分丰富。人们可以从基因组DNA 文库和cDNA 文库中获得特定基因克隆,只需培养细菌,便可提取大量的探针DNA 。迄今为止,已克隆和定性了许多特异DNA 探针。
由于固相化学技术和核酸自动合成仪的诞生,现在可常规制备18~100个碱基的寡核苷酸探针。应用限制酶和Southern 印迹技术,用数微克DNA 就可分析特异基因。特异DNA 或RNA 序列的量和大小均可用Southern 印迹和Northern 印迹来测定,与以前的技术相比,大大提高了杂交水平和可信度。
尽管取得了上述重大进展,但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题,必须提高检测单拷贝基因的敏感性,用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间,这样,就需要在以下三方面着手研究:第一,完善非放射性标记探针;第二,靶序列和探针的扩增以及信号的放大;第三,发展简单的杂交方式,只有这样,才能使DNA 探针实验做到简便、快速、低廉和安全。
分子杂交实验探针-靶反应
从化学和生物学意义上理解,探针是一种分子,它带有供反应后检测的合适标记物,并仅与特异靶分子反应。抗原-抗体、外源凝集素-碳水化合物、亲和素-生物素、受体-配基(ligand )以及互补核酸间的杂交均属于探针-靶分子反应。蛋白质探针(如抗体)与特异靶分子是通过混合力(疏水、离子和氢键)的作用在少数特异位点上的结合,而核酸探针与互补链的反应则是根据杂交体的长短不同,通过氢键在几十、几百甚至上千个位点上的结合。因为有机溶液可降低杂交体的稳定性,所以,疏水反应对互补核酸链的结合也有一定的作用,但对其特异性影响甚微。
核苷酸经某一原子、功能基团或长侧链修饰后仍可能进行碱基配对,这取决于修饰的部位和修饰的性质。这一特性有助于理解非放射性核酸探针标记物的设计和125I 与DNA 探针的化学结合。能与核酸结合的单一原子有银、溴和碘等,这些元素可与嘧啶(胸腺嘧啶除外)环的C-5位或嘌呤环的C-8位反应而不影响氢键的形成。溴亦可与胸腺嘧啶的C-6位结合。而胞嘧啶的C-4和腺嘌呤的N-6就不能被修饰,否则会影响碱基配对,尽管C 的N-4位和A 的N-6位参与了氢键形成,但它们也是标记位点。这是因为标记的探针每1kb 只掺入10~
30个修饰碱基,即仅4%~12%的单个碱基被修饰的类似物取代了。尽管掺入位点处的碱基配对较弱或不存在,但对整个杂交分子的稳定性影响很小。防止氢键破坏的一种方法就是修饰探针,即探针克隆入M13载体中,只修饰载体区而不修饰插入片段。当用放射性同位素32P 和35S 标记核酸时,由于同位素是掺入核酸骨架的磷酸二脂键中,因此碱基未发生任何修饰。在5’端的磷酸基团上可进行化学修饰,这是标记寡核苷酸探针的有效方法。因为这种方法是在一个探针分子上标记一个检测的基团,所以,对长的克隆探针不适用。
此外,还可利用修饰的碱基来增加杂交的稳定性和特异性。2-氢基腺嘌呤可替代寡核苷酸探针中的腺嘌呤通过形成3个氢键以增加杂交体的稳定性。另外,在G-C 丰富的RNA 探针中,可用次黄嘌呤代替鸟嘌呤以获得特异的杂交。因为次黄嘌呤和鸟嘌呤间只形成2个氢键,有效地降低了杂交体的Tm 值,这样,Tm 值与杂交温度更接近,杂交的严格性就增加了,因此,也就增加了特异性。
很显然,结合位点的不同和可检测基团与检测系统的不同,可派生出很多核酸探针标记方法。这是由核酸的化学结构和性质所决定的。只有在对核酸分子的探针-靶反应的化学本质有了深入了解之后,才能更好地理解后面内容。
探针种类
分子杂交基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类,根据探针的核酸性质不同又可分为DNA 探针,RNA 探针,cDNA 探针,cRNA 探针及寡核苷酸探针等几类,DNA 探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。
(一)DNA 探针
DNA 探针DNA 探针是最常用的核酸探针,指长度在几百碱基对以上的双链DNA 或单链DNA 探针。现已获得DNA 探针数量很多,有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA 探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。这些DNA 片段须是特异的,如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu 探针。这些DNA 探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例,目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多,是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性,分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp ,约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA 是相同的,要获得某细菌特异的核酸探针,通常要采取建立细菌基因组DNA 文库的办法,即将细菌DNA 切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。
然后用多种其它菌种的DNA 作探针来筛选,产生杂交信号的克隆被剔除,最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA 片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定,亦可经DNA 序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA 探针,常常是比较繁琐的。探针DNA 克隆的筛选也可采用血清学方法,所不同的是所建DNA 文库为可表达性,克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原,然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆,所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选,最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段,它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
对于基因探针的克隆尚有更快捷的途径。这也是许多重要蛋白质的编码基因的克隆方法。该方法的第一步是分离纯化蛋白质,然后测定该蛋白的氨基或羟基末端的部分氨基酸序列,然后根据这一序列合成一套寡核苷酸探针。用此探针在DNA 文库中筛选,阳性克隆即是目标蛋白的编码基因。值得一提的是真核细胞和原核细胞DNA 组织有所不同。真核基因中含有非编码的内含子序列,而原核则没有。因此,真核基因组DNA 探针用于检测基因表达时杂交效率要明显低于cDNA 探针。DNA 探针(包括cDNA 探针)的主要优点有下面三
点:①这类探针多克隆在质粒载体中,可以无限繁殖,取之不尽,制备方法简便。②DNA 探针不易降解(相对RNA 而言),一般能有效抑制DNA 酶活性。③DNA 探针的标记方法较成熟,有多种方法可供选择,如缺口平移,随机引物法,PCR 标记法等,能用于同位素和非同位素标记。
(二)cDNA 探针
cDNA 探针cDNA (complementaryDNA )是指互补于mRNA 的DNA 分子。cDNA 是由RNA 经一种称为逆转录酶(reversetranscriptase )的DNA 聚合酶催化产生的,这种逆录酶是Temin 等在70年代初研究致癌RNA 病毒时发现的。该酶以RNA 为模板,根据碱基配对原则,按照RNA 的核苷酸顺序合成DNA (其中U 与A 配对)。这一途径与一般遗传信息流的方向相反,故称反向转录或逆转录。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后,病毒RNA 在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA ,并进而整合人宿主细胞染色体DNA 分子,随宿主细胞DNA 复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下,可被复制多代,但不被表达,故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化,则该病毒大量复制,如其带有癌基因,还可能诱发细胞癌变,后来发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA 病毒中,而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以dNTP 为底物,RNA 为模板,tRNA (主要是色氨酸tRNA )为引物,在Trna3’-OH 末端上,5’-3’方向,合成与RNA 互补的DNA 单链,称为互补DNA (cDNA ),单链cDNA 与模板RNA 形成RNA-DNA 杂交体。随后在逆转录酶的RNaseH 活性作用下,将RNA 链水解成小片段。cDNA 单链的3’末端回折形成一个小引物末端,逆转录酶又以第一条cDNA 链为模板再合成第二第cDNA 链,至此,完成逆转录全过程,合成双链cDNA 。
逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术,广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化,最常用的有AMV 逆转录酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸(oligo(dT))用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于mRNA 的cRNA 链,然后再用RNaseH 将mRNA 消化掉,再加入大肠杆菌的DNA 聚合酶I 催化合成另一条DNA 链,即完成了从mRNA 到双链DNA 的逆转录过程。所得到的双链cDNA 分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(linker ),再经特定的限制酶消化产生粘性末端,即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA ,如λgt ,EMBL 和Charon 系列等。用这类载体可以得到包含104以上的转化子的文库,再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA 探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。
(三)RNA 探针
RNA 探针RNA 探针是一类很有前途的核酸探针,由于RNA 是单链分子,所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA 探针是细胞mRNA 探针和病毒RNA 探针,这些RNA 是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的,标记效率往往不高,且受到多种因素的制约。这类RNA 探针主要用于研究目的,而不是用于检测。例如,在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒(HIV )的基因组DNA 克隆时,因无DNA 探针可利用,就利用HIV 的全套标记mRNA 作为探针,成功地筛选到多株HIV 基因组DNA 克隆。又如进行中的转录分析(nuclearrunontranscrip -tionassay )时,在体外将细胞核分离出来,然后在α-32P-A TP 的存在下进行转录,所合成mR -NA 均掺入同位素而得到标记,此混合mRNA 与固定于硝酸纤维素滤膜上的某一特定的基因的DNA 进行杂交,便可反映出该基因的转录状态,这是一种反向探针实验技术。
近几年体外转录技术不断完善,已相继建立了单向和双向体外转录系统。该系统主要基于一类新型载体pSP 和pGEM ,这类载体在多克隆位点两侧分别带有SP6启动子和T7启动
子,在SP6RNA 聚合酶或T7RNA 聚合酶作用下可以进行RNA 转录,如果在多克隆位点接头中插入了外源DNA 片段,则可以此DNA 两条链中的一条为模板转录生成RNA 。这种体外转录反应效率很高,在1h 内可合成近10μg 的RNA 产生,只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记的NTP ,则所合成的RNA 可得到高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并可提高标记物的利用率。
值得一提的是,通过改变外源基因的插入方向或选用不同的RNA 聚合酶,可以控制RNA 的转录方向,即以哪条DNA 链以模板转录RNA 。这种可以得到同义RNA 探针(与mRNA 同序列)和反义RNA 探针(与mRNA 互补),反义RNA 又称cRNA ,除可用于反义核酸研究外,还可用于检测mRNA 的表达水平。在这种情况下,因为探针和靶序列均为单链,所以杂交的效率要比DNA-DNA 杂交高几个数量级。RNA 探针除可用于检测DNA 和mRNA 外,还有一个重要用途,在研究基因表达时,常常需要观察该基因的转录状况。在原核表达系统中外源基因不仅进行正向转录,有时还存在反向转录(即生成反义RNA ),这种现象往往是外源基因表达不高的重要原因。另外,在真核系统,某些基因也存在反向转录,产生反义RNA ,参与自身表达的调控。在这些情况下,要准确测定正向和反向转录水平就不能用双链DNA 探针,而只能用RNA 探针或单链DNA 探针。
综上所述,RNA 探针和cRNA 探针具有DNA 探针所不能比拟的高杂交效率,但RNA 探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。
(四)寡核酸探针
寡核酸探针前述三种探针均是可克隆的,一般情况下,只要有克隆的探针,就不用寡核苷酸探针。在DNA 序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时,也常应用克隆。克隆探针一般较寡核苷酸探针特异性强,复杂度也高,从统计学角度而言,较长的序列随机碰撞互补序列的机会较短序列少,克隆探针的另一优点是,可获得较强的杂交信号,因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基因更多。但是,较长的探针对于靶序列变异的识别能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不同的两序列,克隆探针不能区分,往往杂交信号相当。这既是其优点,又是其缺点。优点是当用于检测病原微生物时,不会因病毒或细菌DNA 的少许变异而漏诊,缺点则是不能用于点突变的检测。这种情况下,通常要采用化学合成的寡核苷酸探针。
合成的寡核苷酸探针具有一些独特的优点:①由于链短,其序列复杂度低,分子量小,所以和等量靶位点完全杂交的时间比克隆探针短,如20nt 的寡核苷酸探针在浓度为100ng/ml,靶序列为1~100pg 、1kb 片段或3×10-18~3×10-16mol/L时,达到最大程度的杂交只需10min ,而用2kb 的克隆探针在同样条件下达到完全杂交则需16h 。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化,因为短探针中碱基的错配能大幅度地降低杂交体的Tm 值。③一次可大量合成寡核苷酸探针(1~10mg ),使得这种探针价格低廉,与克隆探针一样,寡核苷酸探针能够用酶学或化学方法修饰以进行非放射性标记物的标记。尽管克隆探针较特异,但通过细心筛选序列和/或选择相对长的序列(>30nt )亦可设计出非常特异的寡核苷酸探针。最常用的寡核苷酸探针有18~40个碱基,目前的合成仪可有效地合成至少50个碱基的探针。下面是筛选寡核苷酸针的一些原则。
①长18~50nt ,较长探针杂交时间较长,合成量低;较短探针特异性会差些。②碱基成分:G+C含量为40%~60%,超出此范围则会增加非特异杂交。③探针分子内不应存在互补区,否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。④避免单一碱基的重复出现(不能多于4个),如-CCCCC-。⑤一旦选定某一序更符合上述标准,最好将序列与核酸库中核酸序列比较,探针序列应与含靶序列的核酸杂交,而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源,否则,该探针不能用。
按上述原则选出的探针会增加成功的机会,选定后进行合成与标记,并摸索合适的杂交
条件。方法是制备几张点有特异靶DNA 和不相关DNA 的膜,各膜分别在不同温度下与探针杂交,特异靶DNA 杂交信号强而非特异DNA 不产生任何杂交反应的就是最适杂交温度。在进行点突变检测杂交的反应时,洗膜条件和温度物选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶DNA 与探针产生强的杂交信号而突变型靶DNA 则不产生杂交信号,这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。
寡核酸探针寡核苷酸探针还有一个重要用途。在用于检测单个碱基差异时尚可采用一种称为寡核苷酸限制(oligonucleotiderestriction )的技术。该技术只有在突变点位于某一限制性内切酶识别位点时才有效。例如,镰刀状红细胞贫血是因β珠蛋白基因的第6个寡码子由GAG 变成GTG ,从而导致所编码氨基酸由酪氨酸变成缬氨酸。突变的β-珠蛋白功能异常,称作S 珠蛋白,而野生型称为A 珠蛋白,其基因型分别为βS 和βA 。恰好突变点A →T 位于DelI 的识别序列CT -NAG 之内,这就为设计寡核苷酸限制实验创造了条件。方法是合成一个长40个碱基的寡核苷酸探针,其5’末端距突变碱基有11个碱基,该探针与βA 基因的非编码链互补。将此探针的5’末端标记上32P 。杂交方法采用液相杂交法,即在液相中将靶DNA 变性解链,然后与探针退火,产生杂交体。如靶DNA 为βA 型,则两条链完全互补,并产生DdeI 的酶切位点;如待检DNA 为βS 型,则所形成的杂交体中两条链在突变碱基处不配对,从而不能被DelI 所识别。用DelI 消化杂交DNA ,显然βA 会被切开而βS 不被切开。
βADNA 杂交体被切开后,5’端探针序列因只有8个碱基,与杂交链结合不紧而解离,从而产生游离的5’端标记8核苷酸单链。不被切开的βS 杂交体尚可被另一个限制酶HinfI 消化,该酶的识别位点紧靠DelI 识别位点上游。βS 杂交DNA 经HinfI 消化后,将释出探针DNA 的5’末端3核苷酸小片段。βADNA 杂交体因已无HinfI 识别序列,故而不能被HinfI 消化。这样βA 和βSDNA 经此寡核苷酸探针杂交和DelI 及HinfI 消化后,分别产生游离的8核苷酸(8nt )和3核苷酸(3nt )片段,它们可以经电泳分离后进行放射自显影而获证实。藉此策略,可轻易将各种β珠蛋白突变型鉴别开,如纯合野生型AA 结果为仅有8nt 片段,纯合突变型SS 则仅可检出3nt 片段,而杂合子AS 型则两种片段均存在。
分子杂交技术-涉及DNA 杂交TM值-DMSO的降TM作用
分子杂交技术(四)
六、核酸分子杂交实验因素的优化
(一)探针的选择
根据不同的杂交实验要求, 应选择不同的核酸探针。 在大多数情况下, 可以 选择克隆的 DNA 或 cDNA 双链探针。但是在有些情况下,必须选用其它类型的 探针如寡核苷酸探针和 RNA 探针。例如,在检测靶序列上的单个碱基改变时应 选用寡核苷酸探针,在检测单链靶序列时应选用与其互补的 DNA 单链探针(通 过克隆人 M13噬菌体 DNA 获得)或 RNA 探针,寡核苷酸探针也可。长的双链 DNA 探针特异性较强,适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体,但不适宜于组 织原位杂交, 因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。 在这种情况下, 寡核苷酸 探针和短的 PCR 标记探针(80~150bp )具有较大的优越性。
在选用探针时经常会受到可利用探针种类的限制。如在建立 DNA 文库时, 手头没有筛选特定基因的克隆探针, 这时就可用寡核苷酸探针来代替。 但必须首 先纯化该基因的编码蛋白, 并测定 6个以上的末端氨基酸序列, 通过反推的核苷 酸序列合成一套寡核苷酸探针。 如果已有其它动物的同种基因克隆, 因为人类和 动物间在同一基因的核苷酸顺序上存在较高的同源性, 因此可利用已鉴定的动物 基因作探针来筛选人类基因克隆。 对于基因核苷酸序列背景清楚而无法获得克隆 探针时,可采用 PCR 方法扩增某段基因序列,并克隆人合适的质粒载体中,即 可得到自己的探针。这种方法十分简便,无论基因组 DNA 探针还是 cDNA 探针 都可以容易地获得,而且,可以建立 PCR 的基因检测方法,与探针杂交方法可 作对比,可谓一举两得。
(二)探针的标记方法
在选择探针类型的同时, 还需要选择标记方法。 探针的标记方法很多, 选择 什么标记方法主要视个人的习惯和可利用条件而定。 但在选择标记方法时, 还应 考虑实验的要求, 如灵敏度和显示方法等。 一般认为放射性探针比非放射性探针
的灵敏度高。 放射性探针的实际灵敏度不依赖于所采用的标记方法, 如随机引物 延伸法往往得到比缺口平移法更高的比活性。 在检测单拷贝基因序列时, 应选用 标记效率高、 显示灵敏的探针标记方法。 在对灵敏要求不高时, 可采用保存时间 长的生物素探针技术和比较稳定的碱性磷酸酶显示系统。
(三)探针的浓度
总的来说,随探针浓度增加,杂交率也增加。另外,在较窄的范围内,随探 针浓度增加,敏感性增加。依我们的经验,要获得较满意的敏感性,膜杂交中 32P 标记探针与非放射性标记探针的用量分别为 5~10ng/ml和 25~1000ng/ml, 而原位杂交中,无论应用何种标记探针,其用量均为 0.5~5.0μg/ml。探针的任 何内在物理特性均不影响其使用浓度, 但受不同类型标记物的固相支持物的非特 异结合特性的影响。
(四)杂交率
传统杂交率分析主要用于 DNA 复性研究,在这种情况下,探针和靶链在溶 液中的浓度相同。 现代杂交实验无论在液相杂交还是固相杂交均在探针过剩的条 件下进行,此外,固相杂交中靶序列不在液相,故其浓度不能精确计算。因此, 本文不讨论通常用于杂交反应的传统二级速率公式,而叙述一级动力学公式。
在探针过量的条件下,杂交率主要依赖于探针长度(复杂度)和探针浓度。 下面列出的公式适用于过剩单链探针对靶序列杂交的情形, 双链探针开始时 (1~ 4h ) ,杂交动力学相同,但长时间杂交后,由于探针本身的复性,可用于杂交的 探针浓度会逐渐降低。公式(1)可用于估计半数探针与固定靶序列杂交所需的 时间。
t1/2=ln2/kc
t=保温(杂交)时间(s ) ; k =形成杂交体的速率常数 [mol/(Lxntxs)]; c =溶 液中的探针浓度(mol/L) 。速率常数 K 决定于探针长度(L ) 、探针复杂度(N ) 、 温度、离子强度、粘度和 pH 。不含重复序列的探针, l =N。例如,对一个含两 个 20nt 序列的 40mer 探针而言, l =40, N=20。 K 与这些变量的关系为:
Kn= 3.5×105K=KnL0.5/N (2)
Kn 是缔结常数, Kn =3.5×105 。 Na+浓度为 0.4~1.0mol/L, Ph5~9和杂交 温度低于探针 -靶序列杂交体 Tm 值 2.5℃时,公式(1)和(2)可合并为(3) , 用于计算半数探针与靶序列的杂交率(以秒计) 。
对一个长 500个碱基的探针而言,此值为:
长 500个碱基的探针杂交时间很长 (20h ) , 应用短探针和使用杂交促进剂有 其优越性。由于实际应用的探针长度变化较大(对>1kb 的探针,因扩散与粘度 效应不可能使因素 L 得到合适的补偿) 。另外,固靶序列也不可能都用于杂交, 所以,由公式预计的随探针长度增加的杂交率不一定总是正确的。
(五)杂交最适温度
杂交技术最重要的因素之一是选择最适的杂交反应温度。若反应温度低于 Tm 10~15℃,碱基顺序高度同源的互补链可形成稳定的双链,错配对减少。若 反应温度再低(Tm-30℃) ,虽然互补链之间也可形成稳定的双链,但互补碱基 配对减少, 错配对增多、 氢键结合的更弱。 如两个同源性在 50%左右或更低些的 DNA ,调整杂交温度可使它们之间的杂交率变化 10倍,因此在实验前必须首先
确定杂交温度。 通常有三种温度可供试验, 即最适复性温度、 苛刻复性温度及非 苛刻复性温度。温度的选择及温度对杂交的影响见表 18-3。最适复性温度 (Optimunm renaturation temperature, TOR) :Tor =Tm – 25℃
苛刻复性温度:Ts = Tm – (10或 15℃ )
非苛刻复性温度:Tns =Tm – (30或 35℃ )
在 2×SSC 反应液中,可以根据下列公式计算最适复性温度:TOr =0.51 (G+C%)+47℃。
可以看出 DNA 复性和 DNa – RNA, DNA-DNA杂交通常要在高温反应条件下进 行 , 其反应的最大速度是在低于 Tm 值约 25℃。然而对于那些反应时间需要延长 , 或对生物活性必须保护的复杂生物的核酸研究 (如哺乳动物 ), 核酸长时间处于高 温下很显然是不利的。这会引起核酸链的断裂、胶嘌呤的作用,结合到膜上的 DNA 脱落也会增多。这个问题可以通过使用高浓度盐溶液(如 6.2mol/l NaCl) , 或使用某些有机溶剂的水溶液降低反应温度来解决。常使用的有机溶剂有两类, 甲酰胺和二甲亚砜 (DMSO ) 。 在杂交液中加入 30%二甲亚砜可使 T2噬菌体 DNA 的 Tm 值比原先降低 14℃,而使用酰胺甚至可使 DNA 在室温下变性和复性。 Mc-Conaughy 等发现,反应液中每增加 1%的甲酰胺浓度, Tm 值可降低 0.72℃。
现在认为,适当选择甲酰胺和盐水浓度及合适的反应温度,可使 DNA 复性 和 DNA-RNA 杂交获得高特异性和更快的反应速度。
(六)杂交的严格性
影响杂交体稳定性的因素决定着杂交条件的严格性。 一般认为在低于杂交体 Tm 值 25℃时杂交最佳,所以首先要根据公式(4)计算杂交体 Tm 值。由此式 可见,通过调节 盐浓度、甲酰胺浓度和杂交温度来控制所需的严格性。对用 20个碱基以上的探针做 DNA :DNA 杂交的 Tm 值计算如下:
n =杂交体中最短链的长度,因此, 对一个 G+C为 42%的 500个碱基探针于 5×SSC (0.75mol/l Na+)和 50%甲酰胺杂交的 Tm 值为:
T=81.5 +(-2.07)+ 17.22 – 1 – (30.5) =65℃
T 杂交 =65℃– 25℃ =40℃
影响 TM 值的其它因素:
(1) 对克隆或合成探针而言, 同源性每下降 1%, Tm 值就降低 1.5℃, 15~ 50个碱基的寡核苷酸探针的这种作用更明显。
(2) RNA :DNA 杂交体的 Tm 值较同样的 DNA :DNA 杂交体的高 10~15℃。
(3) RNA :RNA 杂交体的 Tm 值较同样的 DNA :DNA 杂交体的高 20~25℃。
显然,当用 RNA 为靶序列时,要使用甲酰胺来降低 Tm 值以保证合适的杂 交温度。 当以克隆的探针进行膜杂交时, 在最后的漂洗步骤中应达到最严格的条 件。对一个 500个碱基探针而言,典型最终漂洗条件点 0.1×SSC (0.015mol/l Na+) ,55℃。代入公式(4)可得:
Tm =81.5 (-30.3) +17.22 – 1-0 =67℃
67℃ -55℃ =12℃
因此,较 Tm 低 12℃的漂洗条件比 Tm 低 25℃的杂交相比条件更严格了。
对寡核苷核探针而言, 杂交温度往往低于 Tm5℃, 因此, 对一个 G+C为 50%的 30nt 寡核苷酸探针来说, Tm 值为:
T 杂交 =55℃ -5℃ =50℃
下面一个经典的公式适用于 14-20个碱基的寡核苷酸探针:
Tm = 4℃(g + C) +2℃(a + T)
在实际应用中, 寡核苷酸探针的最佳杂交温度必须精确确定。 最方便的一种 方法是制备一张含不同稀释度靶 DNA 和非特异靶 DNA (如鱼精或大肠杆菌 DNA )的膜。在不同温度下使膜与探针杂交,特异靶序列结合探针信号很强, 而非特异靶序列与探针无任何反应的温度就是最适温度, 在某些条件下, 可用二 甲亚砜(DMSO )代替甲酰胺来降低 Tm 值。
用一个以上的探针的(如夹心杂交)杂交系统中,估计 Tm 值更加复杂。可
用上述公式估计每一探针的 Tm 值。然后求其均值作为杂交温度。
(七)杂交反应时间
在条件都得到满足的情况下, 杂交的成败就取决于保温时间。 时间短了, 杂 交反应不完成; 时间长了也无益, 会引起非特异结合增多。 一般杂交反应要进行 20h 左右。 1966年 Britten 和 Kohne 推荐用 Cot =值来计算杂交反应时间。 Cot 值 实际上是杂交液中单链起始浓度 (Co ) 和反应时间 (t ) 的乘积。 实验表明 Cot =100时,杂交反应基本完成。 Cot=0,基本上没有 杂交。例如在液相杂交中未标记的 DNa 400μg/ml(按单股 DNA 每微克 紫外吸收值为 0.024计算,总的吸收值为 9.6) , 如果反应时间为 21h , 那么对于未标记的 DNA 来说, Cot =9.6/21 =100.8, 杂 交完成了。对标记 Dn A(浓度为 0.1μg/ml)来说 Cot 值为 0.05,这就充分排除 了标记 DNA 的自我复性。
(八)杂交促进剂
惰性多聚体可用来促进 250个碱基以上的探针的杂交率。 对单链探针可增加 3倍,而对双链探针、随机剪切或随机引物标记的探针可增加高达 100倍。而短 探针不需用促进剂,因其复杂度低和分子量小,短探针本身的杂交率就高 。
硫酸葡聚糖是一种广泛用于较长双链探针杂交的促进剂。这是一种多聚胺, 平均分子量为 500000。另一种常见的促进剂是聚乙二醇(PEG ) , PEG 分子量小 (6000~8000) 、粘度低、价格低廉,但它不能完成取代硫酸葡聚糖。在某些条 件下 5%~10%硫酸葡聚糖效果较好,若用 5%~10%PEG则可产生很高的本底。 因此, 使用促进剂时有必要优化条件。 另一种多聚体促进剂是聚丙烯酸, 用其钠 盐,浓度为 2%~4%。与硫酸葡聚糖相比,其优点是价格低廉,粘度低 (MW=90000) 。
小分子化学试剂酚和硫氰酸胍也能促进杂交, 它们可能是通过增加水的疏水
性和降低双链和单链 DNA 间的能量差异而发挥作用。酚作为杂交促进剂,只能 在低 DNA 浓度的液相杂交中观察到,该方法曾被称为酚乳化复性技术,该法不 能用于固相杂交, 因酚可引起核酸与膜的非特异吸附作用, 即使在液相杂交中的 应用也是有限的。而硫氰酸胍可通过降低双链 DNA 的 Tm 值而起作用。此外, 该分子还可以促进 RNA 的杂交,有裂解细胞而抑制 RNase 的作用。总之,硫酸 葡聚糖和聚乙二醇因能用于固相杂交是目前最常用的杂交促进剂。
分子杂交的基本原理
一、分子杂交的概念:
分子杂交(molecular hybridization)指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA 或RNA ),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理,形成异质双链的过程。
利用这一原理,就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针,去查找各种不同来源的基因组DNA 分子中的同源基因或同源序列。
二、分子杂交基本原理:
(一)DNA 变性:
DNA 变性是指双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成单链无规则线团,因而发生性质改变(如粘度下降,沉降速度增加,浮力上升,紫外吸收增加等)。
1、DNA 变性的方法:
1)加热;
2)改变DNA 溶液的pH ;
3)有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。
2、增色效应:
DNA 在260nm 处有最大吸收值,这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA 双螺旋结构模型中碱基藏于内侧,变性时由于双螺旋解开,于是碱基外露,260nm 紫外吸收值因而增加,这一现象称为增色效应(hyperchromic effect)。利用DNA 变性后波长260nm 处紫外吸收的变化可追踪变性过程。
3、溶解曲线:
如果升高温度使DNA 变性,以温度对紫外吸收作图,可得到一条曲线,称为溶解曲线。
4、融解温度:
通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度),由于这一现象和结晶的融解相类似,故又称融点或融解温度(melting temperature, Tm)。因此Tm 是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。
5、影响Tm 值的因素:
Tm 不是一个固定的数值,它与很多因素有关:
1) 部因素:pH 、离子强度。随着溶剂内离子强度上升,Tm 值也随着增大。
2) 部因素:DNA 的碱基比例、DNA 的均一性;在相同条件下,DNA 内G-C 配对含量高,其Tm 值也高。
6、DNA 中的GC 含量与Tm 值关系:
Tm = 69.3+0.41 × % (G+C)
对于小于20bp 的寡核苷酸,Tm=4(G+C)+2(A+T)
实验表明DNA 分子中(G+C)克分子含量百分比的大小与Tm 值的高低呈直线关系。
(二)复性:
变性DNA 只要消除变性条件,二条互补链还可以重新结合,恢复原来的双螺旋结构,这一过程称为复性(renaturation )。
(三)退火:
通常DNA 热变性后,将温度缓慢冷却,并维持在比Tm 低25~30℃左右时,变性后的单链DNA 即可恢复双螺旋结构,因此,这一过程又叫做退火。
复性后的DNA ,理化性质都能得到恢复。倘若DNA 热变后快速冷却,则不能复性。 影响复性速度的因素:
1、DNA 浓度:愈高,复性速度也愈快。
2、DNA 片段的大小:DNA 片段愈大,扩散速度愈低,使DNA 片段线状单链互相发现互补的机会减少。因此,在复性实验中,有时将DNA 切成小片段,再进行复性。 3、温度:过
高不利于复性。
4、溶液的离子强度:通常盐浓度较高时,复性速度较快。
5、DNA 顺序的复杂性;简单的分子复性很快,如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互补识别很快,故能迅速复性。但顺序较复杂的DNA 分子复性则较慢。因此通过变性速率的研究,可以了解DNA 顺序的复杂性。
原文地址:http://www.seekbio.com/biotech/exp/molbio/DNA/2009/r8211315102.html
原位分子杂交技术的基本方法
原位分子杂交技术的基本方法 原位杂交技术的基本方法包括:①杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;②杂交;③杂交后处理;④显示(visualization):包括放射自显影和非放射性标记的组织化学或免疫组织化学显色。
(一)固定
原位杂交固定的目的是为了保持细胞形态结构,最大限度地保存细胞内的DNA或RNA的水平;使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的,mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解,在RNA的定位上,如果要使RNA的降解减少到最低限度,取材后应尽快予以冷冻或固定。在解释结果时应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响,因组织中mRNA的降解是很快的。
1.最常用多聚甲醛固定组织,因其不会与蛋白质产生广泛的交叉连接,不会影响探针穿透入细胞或组织。
2.醋酸?酒精的混合液和Bouin′s固定剂也能获得较满意的效果。
3.mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中1~2 h,在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中,置4℃冰箱过夜,次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。
4.组织也可在取材后直接置入液氮冷冻,切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min,空气干燥后保存在-70℃。如冰箱温度恒定,在-70℃切片可保存数月之久不会影响杂交结果。在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋,这种标本对检测DNA和mRNA有时也可获得杂交信号,但石蜡包埋切片由于与蛋白质交联的增加,影响核酸探针的穿透,因而杂交信号常低于冰冻切片。同时,在包埋的过程中可减低mRNA的含量。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点,如沉淀性(Precipitating)固定剂:酒精/醋酸混合液、Bouin′s液、Carnoy′s液等能为增加核 酸探针的穿透性提供最佳条件,但它们不能最大限度地保存RNA,而且对组织结构有损伤。 戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构,但由于和蛋白质产生广泛的交联,从而大大地 影响了核酸探针的穿透性。
(二)玻片和组织切片的处理
1.玻片的处理
玻片包括盖片和载玻片应用热肥皂水刷洗,自来水清洗干净后,置于清洁液中浸泡24 h,清水洗净烘干,95%酒精中浸泡24 h后蒸馏水冲洗、烘干、烘箱温度最好在150℃或以上过夜以去除任何RNA酶。盖玻片在有条件时最好用硅化处理,锡箔纸包裹无尘存放。 要应用粘附剂预先涂抹在玻片上,干燥后待切片时应用,以保证在整个实验过程中切片不致脱落。常用的粘附剂有铬矾?明胶液,其优点是价廉易得,粘附效果较差。多聚赖氨酸液具有较好的粘附效果,但价格昂贵。一种新的粘附剂APES粘附效果好,价格较多聚赖氨酸便宜,制片后可长期保存应用。
2.增强组织的通透性和核酸探针的穿透性
增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂Triton X100、酒精或某些消化酶如蛋白酶K,胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用无凝可增强组织的通透性和核酸探针的穿透性,提高杂交信号,但同时也会减低RNA的保存量和影响组织结构的形态,因此,在用量及孵育时间上应填为掌握。?蛋白酶K(Proteinase K)的消化作用的浓度及孵育时间视组织种类、应用固定剂种类、切片的厚薄而定。一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0?1 mol/L Tris/50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中),37℃孵育15~20 min,以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用,从而提
高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂,常用0?1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用,Burns等(1987)报道应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(用0?1 N HCl配)37℃、30 min进行消化,所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构,通常用4%多聚甲醛再固定。
3.减低背景染色
背景染色的形成是诸多因素构成的。杂交后(Posthybridization)的酶处理和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。在多聚甲醛固定后,浸入乙酸酐(acetic anhydride)和三乙醇胺(triethanolamine)中以减低静电效应,减少探针对组织的非特异性背景染色。
预杂交(Prehybridizaiton)是减低背景染色的一种有效手段。预杂交液和杂交液的区别在于前者不含探针和硫酸葡聚糖(Dextran sulphate)。将组织切片浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的,从而减低背景染色。?
在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20 μg/ml)洗涤一次,以减低残留的内源性的RNA酶,减低背景染色。
4.防止RNA酶的污染
由于在手指皮肤及实验用玻璃皿上均可能有RNA酶,为防止其污染影响实验结果,在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温(240℃)烘烤以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶,其最低温度必需在150℃左右。?
(三)杂交(Hybridsation)
杂交是将杂交液滴于切片组织上,加盖硅化的盖玻片,或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片,加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。硅化的盖玻片的优点是清洁无杂质,光滑不会产生气泡和影响组织切片与杂交液的接触,盖玻片自身有一定重量能使有限的杂交液均匀覆盖。可将复有硅化盖玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5×SSC或2×SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。
(四)杂交后处理(Post hybridisation treatment)
杂交后处理包括系列不同浓度,不同温度的盐溶液的漂洗。特别因为大多数的原位杂交实验是在低严格度条件下进行的,非特异性的探针片段粘附在组织切片上,从而增强了背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高,但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色,获得较好的反差效果。在杂交后漂洗中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基配对RNA除去。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。必须注意的是漂洗的过程中,切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的溶液漂洗也很难减少非特异性结合,从而增强了背景染色。
(五)显示(Visualization)
显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。
细胞或组织的原位杂交切片在显示后均可进行半定量的测定,如放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪(computer?assisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色,然后利用显微分光光度计或图象分析仪对不同类型数量的核酸显色强度进行检测。但做半定量测定必须注意严格控制实验的同一条件,切片的厚度和核酸的保存量如取材至固定的间隔时间等。如为放射自显影,核乳胶膜的厚度与稀释度等必须保持一致。
(六)对照实验和结果的判断
对照试验的设置须根据核酸探针和靶核苷酸的种类和现有的可能条件去选定,常用的对照试验有下列几种。
1.将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。
2.与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。
3.将切片应用RNA酶或DNA酶进行预处理后杂交。应用同义RNA探针(Sense probe)进行杂交。
4.以不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。
5.组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。
6.应用未标记探针做杂交进行对照。