范文一:基因工程载体
基因工程的载体
1102021026 11生物技术 吴含含 引 言
基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达,而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持,所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。
作为基因克隆的载体必须具备以下特性:
⑴载体必须是复制子。
⑵具有合适的筛选标记,便于重组子的筛选。
⑶具备多克隆位点(MCS),便于外源基因插入。
⑷自身分子量较小,拷贝数高。
⑸在宿主细胞内稳定性高。
一、质粒载体
(一)质粒的生物学特性
(1)质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA) DNA分子。
广泛从在于细菌细胞中,比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒,目前对细菌的质粒研究得比较深入,特别是大肠杆菌的质粒。大肠杆菌的质粒主要有F质粒(F因子)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(大肠杆菌素因子)三种。
(2)质粒的大小差异很大,最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子,最大的达到200kb。
(3)质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”,离开了寄主它本身无法复制;同时质粒往往有宿主专一性,如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。
(4)质粒的复制类型一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型:“严紧型”质粒(stigent plasmid),拷贝数为1-3;“松弛型”质粒(relaxed plasmid),拷贝数为10-60。不过即使是同一质粒,其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。
(5)质粒的不亲和性 两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。载体质粒与受体的质粒应是不同的不亲和群。
⑹ 质粒的转移
转移性质粒,含有tra基因;能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。 非转移性质粒,不含tra基因;可以为转移性质粒所带动转移。
(7)质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种,
(二)质粒DNA的制备
有多种分离质粒的方法,如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体,裂解细胞,将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。
1.碱变性法质粒提取的原理:
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间,在拓扑学上的差异而发展出来的。
在pH值12.0~12.5范围内时,线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会被变性。
通过冷却或恢复中性pH值使之复性,线性染色体形成网状结构,而cccDNA可以准确迅速复性,通过离心去除线性染色体,获得含有cccDNA的上清液,最后用乙醇沉淀,获得质粒DNA。
2.碱变性法提取质粒的步骤:
(1)取1.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物,加在微量离心管中,离心收集细胞沉淀;
(2)加入100微升冰冷的溶液I,(50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA)涡旋震荡悬浮菌液。
(3)加入200微升新配制的溶液II,(0.2M NaOH,1.0%SDS)缓缓混匀置室温5分钟。
(4)加入150毫升冰冷的溶液III,(醋酸钾29.4克,冰乙酸11.5毫升,加蒸馏水至100毫升)颠倒离心管10次后,冰浴5分钟。
(5)离心的上清液用苯酚抽提数次,用乙醇沉淀收集质粒DNA。
(三)质粒载体的改造
⑴去掉不必要的DNA区段。
⑵减少限制酶的识别位点,一种酶只保留一个。(单一的限制性酶切位点)。
⑶加入易于捡出的选择性标记基因。
⑷对质粒进行安全性改造,要求质粒不能随便 转移。
⑸改造或增加基因表达的调控序列。
1、质粒pBR322
结构:
(1)氨苄青霉素抗性基因(ampr或Apr)
内部有3种限制酶单一识别位点 。
(2)四环素抗性基因(tetr或Tcr)
内部有7种,启动区内有2种限制酶单一识别位点 。
(3)DNA复制起点(ori)
pBR322质粒的优点:
(1)具有较小的分子量。
4363bp,2.6×106Da,
(2)具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
(3)具较高的拷贝数,而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积1000~3000个拷贝。
(4)对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。
2、pUC质粒载体
1987年,J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的。
结构:
(1)来自于pBR322的Ori
(2)氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化
(3) LacZ′基因
编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端。
(4)MCS区段
是一段用于插入外源DNA片段的特定区域,由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成,而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。
与pBR322相比, pUC质粒载体优点:
(1)具有更小的分子量和更高的拷贝数
如pUC8为2 750bp,pUCl8为2 686bp,控制质粒复制rop基因的缺失,平均每个细
胞即可达500~700个拷贝
(2)适用于组织化学法检测重组体
通过?-互补作用,利用菌落颜色筛选重组子。
(3)具有多克隆位点区段(MCS)
可以定向克隆防止载体自我连接。
二、噬菌体载体
(一)?噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
烈性噬菌体:只具有溶菌生长周期
温和噬菌体:具有溶源生长周期和溶菌生长周期
溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化,然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装,最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。
溶源周期中,注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。
整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。
2. ?噬菌体的生物学特性
⑴组成:蛋白质外壳和线状双链DNA分子组成。
?DNA长度为48502bp,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端。当其注入到寄主细胞中后,可以迅速通过这两个粘性末端的互补作用形成双链的环形DNA分子。上述通过粘性末端互补形成的双链区被称为cos位点(cohesive end site).
⑵是一个温和噬菌体
一般以溶源生长进行增殖,胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。
⑶复制
溶源周期随溶源细菌染色体一起复制
溶菌周期的早期是“θ”复制,晚期进行滚环复制
⑷基因组成
?DNA至少包括61个基因,大多基因按功能相似性成簇排列,其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因,另一部分约1/3为非必须区段。
3. ?噬菌体载体的类型
插入型 (Insertion vectors )
这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。
如:λgt10 、 λgt11
克隆能力小,不到10kb
置换型 (Replacement vectors)
这种载体具有两个对应的酶切克隆位点,在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列,可以被外源插入的DNA取代。
如Charon 4 载体
克隆能力大,20~25kb
(二)M13噬菌体
1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性
⑴是单链闭合环状噬菌体
只能感染雄性细菌,外形成丝状,基因组DNA长约6.4kb,可分为10个区和507 bp基因间隔区(IS区),该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体
能用于单链DNA载体的重要前提。
⑵复制与增殖(图)
2. M13噬菌体载体的构建
⑴ 在IS区内插入LacZ基因 ⑵在标记基因区内组装MCS区段
所以能通过?互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等
这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA,也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定,在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内,克隆300-400bp的片段十分稳定。
(三)柯斯质粒载体
1.柯斯质粒载体的特点
柯斯质粒是一类人工构建的含有?DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体,cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。
柯斯质粒的大小为4-6kb,
由3部分组成:
A.多克隆位点区
B. 含有cos位点的?DNA区
C. 复制起始位点和抗性标记区
2.柯斯质粒载体的特性
1、具有?噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒,并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制,但是不会形成新的噬菌体颗粒,也不能发生溶菌现象。
2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制,且带有抗性选择标记基因,有些还带有插入失活型的多克隆位点,为重组体的筛选提供了方便。
3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小,只有复制起点、选择标记和cos位点等构成,所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制,其克隆片段至少要达到30kb。
范文二:基因工程载体
基因工程载体
n 基因工程的目的和基本手段:
选用合适的载体把供体 DNA(外源基因 ) 运 载到相应的受体细胞内,从而复制、扩增出 大量的目的 DNA 分子或者转录、表达为相应 产物,所有这些都必须选择合适的载体。 n 载体(Vector ) :
能够通过基因重组技术携带、运载外源基 因或者 DNA 片段到达受体细胞,完成克隆、 复制、表达的具有特定结构和功能的 DNA 分 子运载工具。
一、载体概论
基因工程中所使用的载体可分类: n 克隆载体 (cloning vector):
克隆载体是指可以携带外源基因或 DNA 片段进入受体 细胞并使外源 DNA 大量扩增的复制单元,适用于复制扩 增外源 DNA 。
n 转录载体 (transcription vector):
转录载体是以 DNA 为模板、用 RNA 聚合酶Ⅱ合成 RNA 的 过程,多 采 用体外转录体 系 。
n 表达载体 (expression vector):
表达载体是用于表达 原核 或 真核 细胞 中某个 特定基 因所 编码 的 蛋白质 产物的载体, 其 克隆 位点 的 上游含 有 强启动 子、 下游含 有转录 终止序列 ,适用于表达 某 特定 蛋白质 。
n 克隆、表达的基本流程是:
克隆载体 转录载体
载体 vector
原核 载体 :质粒 (pBR322,pUC)噬菌 体 (λ, M13
)
真核 载体:酵母 、 病毒 载体 等
二、克隆载体
目前使用的载体,按其特性可分为六类:① 质粒 (plasmid);
② 噬菌 体 (bacterphage);
③ 黏性质粒 (cosmid);
④ M13噬菌 体 (phage Ml3);
⑤ 酵母 (yeast)载体 ;
⑥ 真核 细胞 病毒 载体 (eukaryotic virus vector)。 前四类 克隆载体用于 原核 细胞 中; 酵母 和 病毒 载体 则属 于 真核 细胞克隆或 表达载体。
(一)基因工程中的克隆载体应具有特性 ① 具有复制子, 在宿主 细胞内 可 自主地 复制 , 并携带重组 DNA 分子 一同 扩增 ; 可转 移性 。 ② 有单 一限 制 性 内 切 酶的酶 切位点 或多克隆 位点 (multiple cloning site, MCS) , MCS 是 人 工合成 的 一 段 含 有多 个不同 的单 一限 制 性 内 切 酶 切点 的 DNA 序列 , 它 有 利 于外源基因 插 入 该区域; ③ 有 选择 性 遗传标记 , 如抗药 基因、酶基因、 营养缺陷 体 及噬菌斑形 成能 力等 , 便 于 筛 选 出 阳性 重组体 ;
④ 拷贝数高 (10— 200个/每个 细胞 ) , 易 于分 离; ⑤ 生 物 安全 性 好 。
(二)常用的克隆载体
1. 质粒 (plasmid)
存 在 于细 菌 染色 体外,具有 自主 复制功能的 小环状双链 DNA 分子。
Plasmid chromosome 质粒 DNA 分子可以 持续稳 定 地 处 于 染色 体外 地游离 状态 , 但 在一 定 地 条件 下 又会 可 逆 地 整 合到 寄 主 染色 体 上 , 随着染 色 体 地 复制而复制。
n (1) 基因载体应具备的必要条件: 1) 有多 种 限 制 性 内 切 酶 切点 ,多克隆
位点 MCS , 但 每 种 切 口最好只 有 1个; 2) 有 筛 选 选择 标记 , 如抗药性标记 ,
β-半乳糖苷 酶基因 (lac Z) 蓝 白斑 试验 ;
3) 有 一 定 容 量 ;
4) 拷贝数 多 , 每个宿主菌 能 容纳 的 最 多 数 。
(2)普通型载体 pBR322的结构图
pBR322 BamHI SalI
PstI
ScaI Amp r
ori (4.36 kb)
Pst
Sal Ⅰ Ⅰ Ⅰ (ampr )
(terr ) 2008-1-28 15:20:55 PM
抗药性标志的选择 pBR322Am Tet
插入片段
Amp 平板
Tet 平板
标记基因按用途分为
1. 选择标记基因:
用于 鉴别 目 标 载体 DNA, 把成功转入载体 /重 组体的受体 菌 选出 来 , 如抗 生素 抗性 基因 (氨苄 、 四 环 、 卡那 、 氯霉 等)
2. 筛选标记基因:
用于 区 别 重组 质粒 和载体 质粒(非 重组 质 粒) ,把重组体的特 殊 表 型挑 选出 来 。 如 α-互补 、 插 入 失活 。
pUC 质粒系列 也 是
在 pBR322基 础 上 改建 成
的。
它含 有 pBR322的大
部 分, 包括 完 整 的 ampr
基因和复制 起始 点 。 去
除了 pBR322的 tetr 区
段, 换 用 了 M13噬菌 体
的 476bp 片段, 含 LacZ
不得 基因 及其启动 子的 操纵 基因、 M13的多聚
接头 polylinker . (3) pUC 质粒 系列 Eco Sac Kpn Sma Bam Xba Sal Pst Sph Hin RI I I I HI I I I I dIII pUC18
pUC19Hin Sph Pst SalXba Bam Sma Kpn Sac Eco dIII I I I I HI I I I RI Ap Ori LacZ (2.68kb)r
三个显著特点 :
(1) 分子量 更小 , 仅 2.7KB , 容纳 外源 DNA 量增 大 ; 有 高 的 拷贝数 (每个 细胞 含 500-700个拷贝) 。 (2)含易 于 检测 是 否 有外源 DNA 插 入的 标记 基因 LacZ α, 可 利 用 α-互补 原 理 进 行 蓝 白筛 选。 (3) 多克隆 位点区(MCS ) 由 人 工合成的多 个 单 一 酶 切位点 构成。 其 MCS 区 与 M13mp 噬菌 体载体的相 同 ,可使 pUC 上 克隆的目的基因 直接 转 移 到 M13mp 载 体,进 行 DNA 测 序 和 体外 突变 等 研究 。
*476bp 片段 含 有 E.coli 的 lacZ 基因的 5’ -序列 ,表达 半乳 糖苷 酶的 α片段。
* Lac Z 上游 包括乳糖操纵 子 上 的 启动 子 Plac 和 操纵 基因 O 。 * lac Z 之 内是 M13的多功能 连接器 。
(4)多功能质粒载体
综 合以 上 特 点 , 质粒 载体结构 +单 链 噬菌 体复制 和 包装 信号 。 如 pBluescriptIIKS (+/-)
(5)穿梭质粒
质粒 DNA 在 添加 真核 复制 信号 和 启动 子 后 ,可以 构 建 出能 在原核 和 真核 细胞 中 均 可复制的 穿梭 质 粒 , 并 在真核 细胞 中 表达,因 此 这 类 载体 在 基因工 程 中 应用 广泛 。
噬菌 体是 比 细 菌 还
小 得 多的 微 生 物,和 病
毒 侵犯 真核 细胞 一 样 ,
噬菌 体 侵犯 细 菌 , 也 可
以 认 为 它 是 细 菌 里 的
“ 寄生 虫 ” 。 它 本身 是 一
种 核蛋白 , 核 心 是 一 段
DNA , 结构 上 有 一个蛋
白质 外 壳 和 尾巴 , 尾巴
上 的 微丝 可以把 噬菌 体
的 DNA 注 入细 菌
内。
2. 噬菌体 (Phage)
* λ噬菌体 (λphage)
基因组分 三 个区域 :左侧 区 、 中 间 区(非 必 需 区) 、 右侧 区 DNA , 替 换型 载体,外源 DNA9-23kb 常 用:EMBL 系列 、 λgt 系列 、 charon 系列
* 粘性质粒 (cosmid):
λDNA 的 cos 区 +质粒 , 双链环状 DNA ,克隆 容 量:40-50kb
* M13噬菌体
最 大 优 点 :产 生 单 链 DNA
λ噬菌 体从 溶 原 转为 裂解 是 一 种 可诱导过程 。 诱导 的因 素 可能 很 多, 实 验 室常 用的是 热诱导 :分 离 得 到 某 些 λ噬菌 体, 在 低温时 (30℃ ) 建 立 溶 原 ,用 高 温 (420C ) 则 出 现裂解 。
λ噬菌 体的 cl 基因是 温度敏感 突变型 的, 称 为 c1ts 。 λcl ts1857, 可 作 为组 件 插 入 质粒 DNA 内。目的 基因 插在 λcl ts857下游 ,重组体的目的基因 在 42℃ 表达, 30℃ 不 表达。这 种 方法称 为 热诱导表 达 , 使用的是 温敏开关。
λCI ts857
ori 目的基因 P L 阻遏
蛋白
30℃ 下培养:
2008-1-28 15:21:02 PM
阻遏 蛋白 42℃ 下培养:失活
2008-1-28 15:21:02 PM
目的基因
2008-1-28 15:21:03 PM
3.
酵母是单细胞真核生物,可接受质粒转化。 酵母质粒有 Yip (integrate ) 整合型, Yep (epi -some ) 附加体型, Yrp (replication ) 复制 型。
酵母人工染色体载体
(Yeast artificial chromosome vector, YAC ) 把 酵母 染色 体 与 基因复制和表达有 关 的 主 要 组 件 都组 装 在质粒上 , 令 质粒 行 使 酵母 的转录功能和复制功能。
pYAC 只 以单 抄本方式繁殖 ,所以 不 适 用于以 生 产为目的的基因工程。 主 要 用 于 人类基因组研究 和 巨大基因 如人类 DMD 基因达 Mbp (106bp ) 数 量 级 基因的克隆。
4. 其他大容量克隆载体
n 噬菌 体 人 工 染色 体 P AC 载体
( Phage P1artificial chromosom vector)
n 细 菌人 工 染色 体 BAC 载体
(Bacterial artificial chromosom vector )
n 哺 乳 动 物 人 工 染色 体 MAC 载体
(Mammal artificial chromosom vector )
n 人类人 工 染色 体 HAC 载体
(Human artificial chromosom vector )
主要 用 于人 类基因 组计划 和 模式 生物基因 组测序
三、表达载体
(expressing vector)
定义 :
能 在 受体细胞 中 表达 (转录和 翻译 ) 外源基因 的载体。
这 类 载体 除 具有克隆载体所具 备 的 性质 以 外, 还 带有 表达构 件 —— 转录和 翻译 所必 需 的 DNA 序列 。 一 般要求 一个强 的 启动 子 、 两侧 的 调 控 序列 和 转录 终止 信号 rrnB 。
表达载体多 种 多 样 ,
受体细胞 不同 表达载体 不同 , 如 大 肠 杆 菌 、分 枝杆 菌 、 放线 菌 、 酵母 、 哺 乳 动 物细胞 等 , 各 有相应的表达载体。
大肠杆菌质粒表达载体 和 哺乳动物细 胞的质粒表达载体 最 为 常 用,以 其 为 例 , 理 解 原核 、 真核 表达载体的 各 自 特 点 。
1. 原核 基因工程表达载体
2. 真核 基因工程表达载体
组成 特点 :
* 强启动 子 ,
* 保证正确阅读 AUG 的 序列 ATGNATGNATG , * rrnB 强终止序列 ,
* 多克隆 位点 MCS 。
高效 表达质粒
(一) 大肠杆菌 表达载体
1. 大肠杆菌 表达载体的 构成
*大 肠杆 菌 表达载体 中含 有 :
复制 位点 、 抗性 基因、克隆 位点 ,可以 导 人 大 肠杆 菌 ,这些特 点 与 克隆载体 一 样 。
* 表达载体 中含 有表达 系 统 元 件 即 :启动 子 一 核 糖 体结合 位点 一 克隆 位 点 一 转录 终止 信号 。
多克隆位点
复制起始点 遗传标记 基因载体
(1)启动 子 (promoter)
大 肠杆 菌 表达载体 中 常 用的 启动
子有:trp-lac 启动 子、 λ噬菌 体 P L 启动 子和 T 7噬菌 体 启动 子。
2. 大肠杆菌 表达载体的 重要元件
trp-lac 启动 子, 亦称 tac 启动 子。 是 一个 双 启动 子,或 称杂 合 启动 子。
tac 启动 子是 一 组 由 lac 和 trp 启动 子 人 工构 建 的 杂 合 启动 子。 由 trp 启动 子 加 上 lac 操纵 子 中 的 操纵 基因、 SD 顺 序 融 合而成。 整 个 tac 启动 子受 lac 阻抑 物 调控 , 在 lac 阻抑 物 高 水平 表达的 lacl 大 肠杆 菌菌 株 中 , 其 转录可 被抑 制, 加 入 异丙 基 硫代 半乳 糖苷 (1PTG)可 诱导 其 表达。
常 用的受体 菌 株 有 RB791、 XL-I-blue 、 SB221、 JM109等 。
λ噬菌体 P L 启动子 :
启动 子受 控 于 温度敏感 的 阻抑 物 (clts857) 。 clts 857在 低温 下 (37℃ ) 可以 阻抑 P
L
启动 子的转录, 但 在高 温 下 (42℃ ) 则 失去 阻抑 作
用。因 此 , P
L
是 一 种 温度诱导 的 启动 子。
大 肠杆 菌 M5219株 含 有 λ噬菌 体的 缺陷 型 原
噬菌 体,可以 编码 clts 857。 含 P
L
启动 子的表达 载体 需 转 化 到 M5219菌 株 中 才 能 调控 表达。 常 采 用 30℃ 扩增, 40℃诱导 以 减少 热 休 克 蛋白 的产 生 。有些 热 休 克基因可 编码蛋白 酶, 降 解 产物。
T 7 噬菌体启动子:
是 一个 表达 效率 很 高 的 启动 子, 但 需要 特 殊 的受体 菌 。 现 在 已 有 JM109(DE3)等 ,是 溶 原菌 ,带有 lac UV5启动 子 控 制 下 的 T
7
噬菌 体 RNA 聚 合酶基因,可用 IPTG 诱导 。
(2)核 糖 体 结 合 位 点
mRNA 在 细 菌中 的 翻译 效率严格依赖 于是 否 有 核 糖 体结合 位点 (ribosome-binding site , RBS ) 的 存 在 ,因 此 , RBS 是大 肠杆 菌 表达载体 中 必 不 可 少 的元 件 。
核 糖 体结合 位点 包括起始 密 码 子 (ATG)和 SD 序列 。
但也 有 人 将 所构 建 的载体 中 的 SD 序列 称 为 RBS 位点 ,或 RBS 序列 。
(3)转录 终止序 列
目 前 常 用的 各 种 表达载体 中 ,有些 虽 不 含 有转录 终止序列 , 在 表达 某 些外源 蛋白 时 , 也 可 获 得 较满意 的 效果 , 但 对 多 数 外 源 蛋白 的表达是 不 合适的,因而多 数 表达 载体 中 都带有 转录 终止序列 。 常 用的转录 终止序列中 , 短 的可以是 几十 bp , 长 的可 达 700~800bp 。
3. 常 用的大 肠杆 菌 表达载体有 pKK 序列(tac 启动 子 );
pGEx (tac 启动 子并 含 GST 融 合 蛋白 表达 系 统 , 易 表达产物, 要求后加 工 时 去除非 目 的 蛋白);
pBV 系 统 (PLPR 启动 子, 温度诱导 表达 ); 6Xhis 表达系统;
pGEM-T 系统 (PCR 克隆 ) 。
2008-1-28 15:21:13 PM
4. 常用表达载体
举例
⑴ pBV220系 统
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本 系 统 宿主菌 可以是大 肠杆 菌 HB101、 JM103、 C600, 质粒拷贝数 较 多,因 此 小 量 简 便 快速提取 即 可 满足 需要 。
本 系 统 为 温度诱导 ,外源基因表达量 可达细胞 总 蛋白 的 20%~30%;
产物以 包 含 体 形 式 存 在不易 降 解 均 一性 好 ;
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pBV220系 统国内 使用 最 多的载体 ,
其 组成 :
① 来源于 pUC8多克隆 位 点
② 核 糖 体 rrnB 基因 终止信号
③ pBR322第 4225~3735位
④ pUC18第 2066~680位
⑤ λ噬菌 体 cIts857抑制子 基因 及 PR 启动子 ⑥ pRC23的 PL 启动子及 SD 序 列
pBV220系 统优 点:
① cIts857抑 制子基因 P L 启动 子 同在一个 载体 上 ,可以转 化任何 菌 株 ,以 便 选用 蛋 白 酶 活 性 较 低 的 宿主 细胞,使表达产物 不 易 降 解 。
② SD 序列 紧跟 多克隆 位点 , 便 于 插 入带 起 始 ATG 的外源基因,可表达 非 融 合 蛋白;
③ 强 的转录 终止 信号 可 防 止 出 现 “ 通 读 ” 现 象 ,有 利 于 质粒 -宿主系 统 的 稳 定 ;
④ 整 个质粒 仅 为 3.66kb ,有 利 于增 加 其拷贝数及 容 量,可以 插 入大片段外 源基因 ;
⑤ PR 和 PL 启动 子 串联 ,可以增 强启动 作 用 ;
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( 2)融 合表达质粒 pBG-2的 结构
pBG-2是 由 pBV220系 统 衍 生 的 便 于 产物 纯化 的 融 合表达载体。
该质粒在 P R P L 启动 子 下游插 入 protein G的 IgG Fc 结合 区 基因片 段 180个 碱 基 对 , 下游 是多克隆 位 点 , 引 入 剪 切 融 合 蛋白 具有 与 IgG 结合的 活 性 ,可用 亲 和 层析简化 下游 工 艺 。
(3)表达 GST 融 合 蛋白 的表达载体
n 谷胱甘肽 转 移 酶基因 插在 tac 启动 子和 MCS 之 间 ,外源基因 插 入 后 ,表达出 融 合 蛋白 ,具有酶 活 性 。
(二 ) 哺乳动 物表达载体
克隆基因 要 在 哺 乳 动 物细胞 中 进 行 表 达,必须 先将 基因重组到适 当 的 真核 表达 载体 中 。
1. 真核表达载体构成
哺 乳 动 物细胞表达载体是从克隆载体 上 发展 起来 的, 如 穿梭质粒 , 要 在 细 菌中 增 殖 , 含 有必 不 可 少 的 原核序列 :在 大 肠杆 菌中 能 起 作 用的 复制 起始 位点 、 便 于 筛 选 重组 质粒 的 抗 生素 抗性 基因 。
但 在质粒中 还 包括 在 真核 细胞 中 的 药 物 抗 性 基因和 真核 表达组 件 , 有的 还 带有 在真核 细胞复制的元 件 (真核 复制 起始 位点 ) 。 真核 表达载体 中含 有 一 套 真核 表达元 件 :启动 子 /增 强 子 — 克隆 位点 — 终止 信号 和 加 poly(A) 信号 。
2. 真核 表达载体表达元 件
n 原核启动 子 在 哺 乳 动 物细胞 中 是 不 起 作 用的。
n 真核 表达载体必须有 真核启动 子 和 增 强 子。
n 各 种 启动 子和增 强 子 在不同类 型 的 细胞 中 活 性 相 差 很 大,有 个 选择过程 。 n 细胞源的 启动 子 , 增 强 子元 件 , 如 热 休 克 蛋白 , 肌 动蛋白启动 子。
n 病毒 来 源 的 启动 子 和增 强 子,
宿主 范围较 广 , 在 多 种 细胞 中 都可有 一 定的 活 性 。
如 SV40病毒 早期 基因 启动 子 (SV40)、 Rouse 肉瘤 病毒 基因组 长末端 重复 顺 序 (RSV)、 人类 巨 细胞 病毒 (CMV)等 。这些增 强 子 /启动 子组合可 在 广泛 的 宿主 细胞 中 作 用,是目 前真核 表达载体 中 常 用的。
范文三:基因工程作业之基因工程载体
基因工程载体
---乳酸菌表达载体pMG36e 及其应用现状
目前,多数外源基因的克隆与表达,主要采用大肠杆菌。然而,由于大肠杆菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻,导致机体损伤,所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比,乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一,已被证明具有诸多益生功能,而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe,GRAS) 。因此,采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺;同时,乳酸菌可以在肠道中存活定植,其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生,成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”,从而起到相应的保护和治疗性作用。
乳酸菌(Lacticacidbacteria ,LAB )是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌[1],具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用,应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展,以乳酸菌作为宿主,利用质粒表达外源基因,对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体,pNZ 系列载体[2]等。质粒pMG36e 来源于pWV01载体,于1989年由VanDeGuchte [3]以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成,质粒大小约为3.6Kb ,便于宿主携带,可表达被克隆的各种基因。目前已在乳球菌属 (Lactotoccus ),链球菌属(Streptococcus ),乳杆菌属(Lactobacillus )等中成功表达如溶菌酶、苯丙氨酸氨酶[4]、枯草杆菌中性蛋白酶[5],以及超氧化物歧化酶[6]等以及其他蛋白基因,近年来也有学者[7]对其进行改造,成功构建了食品级载体。是目前应用较多的一个组成型表达载体。本文主要从载体构成,表达外源基因与构建食品级载体等三方面进行综述。
一、 载体的构成
载体 pMG36e 由强启动子p32及其下游的部分开放阅读框、多克隆位点和来自乳酸乳菌乳脂亚种(Lactococcuslactissubsp.cremorisWg2)蛋 白 酶 基 因
[8](prtP )的转录终止子以及 pWV01复制子和来自于质粒pE194[9]的红毒素抗性基因Emr 构成,质粒大小为3.6Kb 。质粒pMG36e 的构成使其有利于表达外源基因。其中强启动子P32于1987年由VanderVossen 等[10]利用鸟枪法从乳脂链球菌(S.cremoriswg2)克隆得到,p32包括开放阅读框架和一个能够被大肠杆菌(E.coli )、枯草芽孢杆菌(B.subtilis )、乳链球菌(S.lactis )识别的核糖体结合位点。pWV01复制子来源于广宿主乳球菌质粒 pWV01[11],能在一系列细菌中行使功能,这其中包括大肠杆菌(E.coli ),枯草杆菌 (B.subtilis )、乳球菌、乳杆菌、化脓性链球菌(S.pyogenes )和血链球菌(S. sanguis )等[3]。位于翻译启始信号下游的多克隆位点可使外源基因在合适的阅读框架内插入。由于大肠杆菌与枯草杆菌可作为构建重组质粒的中间宿主,这极大地提高了该质粒的表达效果和扩展了宿主应用范围。
二、利用pMG36e 载体的基因表达
自 20世纪 80年代 VanDeGuchte 成功构建该质粒以来,已利用该载体表达动植物和细菌的外源基因达十几种,并成功构建了多种具有特定功能的基因工程 乳酸菌。
2.1 细菌素基因的研究
与抗生素相比,大部分细菌素只对近缘关系的细菌有损害作用,安全性比较高,因此对细菌素作用机制的研究有很重要的意义。1996年,Franke 等[12]用 pMG36e 表达与β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase )融合的细菌素转运与成熟相关的lcnD 基因,以研究乳球菌素运输机制。Diep 等[13]将载体 pMG36e 和其衍生载体pMG37e 用于戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus )细菌素诱导基因中的penIR 和penIF 的表达和免疫基因结构基因诱导基因簇peiA penA penI RKR 的表达研究。2007年该研究小组,又将pMG36e 用于乳球菌素A (lactococcinA )研究,证明其利用甘露糖磷酸转移酶系统作为受体。除此以外,pMG36e 也用于植物乳杆菌素(plantaricin )423免疫蛋白的表达研究,和作为中间载体探讨乳链菌素(nisin )抗性机制以及用于表达肠道菌素(enterocin )AS48的as48ABCRNA 片段。
2.2酶类的研究
2.2.1溶菌酶 VanDeGuchte 等[14]在成功构建质粒pMG36e 后,插入一段母鸡溶菌酶(HEL )蛋白编码序列,构建质粒pMG36eHEL ,通过使用兔抗HEL 抗血清 (蛋白印记法)在 乳球菌中检测到符合预期大小(17KDa )的融合蛋白。
2.2.2几丁质酶1994年,Brurberg 等[15]将革兰氏阴性菌粘质沙雷氏菌(SerratiamarcescensBJL2000)的几丁质酶基因克隆到乳酸乳球菌乳亚种MG1363和用于青储饲料的植物乳杆菌E19b (L.plantarum E19b )中,并得到表达,且具有抗真菌活性。
2.2.3其它酶类 除此以外,先后有学者成功利用该载体在旧金山乳杆菌(L.sanfrancisco )、乳杆菌、乳酸乳球菌进行诸如α-淀粉酶、黑曲霉F246(Aspergillusniger ,F246)、植酸酶phyA 、人类谷胱甘肽S转移酶(glutathione S transferase )、木聚糖酶以及GFP 等蛋白的表达[19~23]。1990年,VanDeGuchte 等[5]将枯草杆菌中性金属蛋白酶基因插入pMG36e ,并将其转入到乳酸乳球菌乳亚种MG1363菌株,成功进行了表达并检测到活性。
2.3用于发酵乳制品
功能性乳制品是指除具有一般乳制品固有的化学成分和营养作用外,还含有某些特殊营养物质或功能性成分,兼有一种或多种特定生理保健功能的乳制品[24]。采用基因工程技术改良菌种的性状,是研发功能性乳制品的一个重要手段。
2.3.1 SOD 发酵酸奶 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD )是生物体防御氧自由基损伤的重要酶类,广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。SOD 主要分为三类,即Fe SOD、Mn SOD和Cu/Zn SOD。其中Fe SOD主要存在于原核生物,Cu/Zn SOD主要存在于包括人类在内的所有高等真核生物中,而Mn SOD则在高等生物的线粒体及细菌中[6]。SOD 具有有延缓机体衰老、抗电离辐射作用、增强耐缺氧和抗疲劳能力、促进婴幼儿生长发育、调节机体免疫功能、提高对炎症和肿瘤等疾病抵抗力等保健作用[16],生产SOD 乳制品具有重要意义。1993年,Roy 等[17]率先将大肠杆菌Mn SOD 克隆到表达载体pMG36e ,转化到携带SOD 的乳酸乳球菌和缺乏SOD 的加氏乳杆菌(L.gasseri )中。我国学者[6,18]分别将在乳酸乳球菌与保加利亚乳杆菌(L.bulgaricusL6032)中实现人铜锌超氧化物歧化酶Cu/Zn SOD基因和大肠杆菌锰超氧化物歧化酶基因的表达,增强保加利亚乳杆菌对氧的耐受性,为下一步SOD 发酵奶的研制奠定了基础。
2.3.2 低乳糖乳制品 发酵酸奶的过程中,在β-半乳糖苷酶的作用下,牛奶中只有25%~50%的乳糖被乳酸菌分解,还有较多的乳糖存在。Wang 等[19]利用质粒pMG36e 将来自于保加利亚乳杆菌wch9901的 β-半乳糖苷酶基因在乳 酸乳球菌乳脂亚种MG1363中表达,其后又将来自于德氏乳杆菌保加利亚亚种的β-半乳糖苷酶在大肠杆菌中进行非融合表达。使用具有半乳糖苷酶活性的乳酸菌生产乳制品,可为解决乳糖不耐症提供了方法。
2.3.3 防癌保健乳制品 谷胱甘肽硫转移酶(GST )家族是真核生物重要的解毒酶类。人谷胱甘肽硫转移酶(hGST )对于多种来源的致癌物、诱变剂、具有重要的解毒作用。向华等将人谷胱甘肽硫转移酶A1基因的cDNA 序列亚克隆于表达载体pMG36e ,获得hGST A1乳酸乳球菌表达株,可望应用于研制防癌保健乳制品。
2.4 科学研究与基因治疗
2.4.1 研究益生作用机制 由于很难检测体内吸附在肠上皮细胞的益生菌,因此,到目前为止都没有很好的方法来衡量其在肠道内的吸附能力,蒋爱民等利用pMG36e 构建携带lux 基因的重组质粒pMG36eluxAB 和pMG36eluxCDABE ,经电转化获得带lux 基因的发光乳球菌。这为研究体内益生菌的分布和存活率以及有利于人体健康的机制提供了思路。
2.4.2 外源基因表达的报告系统 Raha 等将凝结芽孢杆菌ST 6(Bacilluscoagulans ST 6)中的聚糖酶基因亚克隆到载体pMG36e ,构建了重组载体可作为大肠杆菌和乳球菌含报告基因的载体。Duplessis 等[20]利用pMG36e 作为中间载体,通过构建pMG36eSapS 研究了金黄色葡萄球菌非特异性酸性磷酸蛋白酶(nonspecificacid phosphatase)在革兰氏阳性与阴性菌中表达的报告基因。
2.4.3 疾病治疗 自1999年以来,有学者利用pMG36e 构建携带有苯丙氨酸脱氨酶(PAL )的重组质粒,并得到具有一定酶活性的基因工程菌株,将其制成不同剂型灌喂高苯丙氨酸血症模型大鼠,发现其外周血苯丙氨酸脱氨酶水平显著降低,为基因疗法治疗苯丙酮尿症开辟了一条新途径[4]。另外,pMG36e 还应用于口服疫苗的研制,用于避免幽门螺杆菌的感染等。
三、食品级载体应用
食品级载体(food-gradevector )是安全、稳定的,可在食品加工中使用的质粒载体。它应具备以下基本条件:(1)选择标志必须是食品级的;(2)表达载体中的启动子、核糖体结合位点、终止子和分泌信号等DNA 片段必须来自食品级微生物;(3)启动子的诱导物也必须是食品级的。
pMG36e 参与构建食品级载体主要分为以下两种途径:
一是表达外源基因作为食品级细菌素。Mccormick 等在表达载体 pMG36e 中插入食肉乳杆菌素Carnobacteriocin B2的结构基因,转化到广布肉杆 菌LV13菌中并获得表达。Carnobacteriocin B2是一类小分子热稳定肽(SHSP ),此类乳酸菌素杀菌机理主要是细菌素能吸附在细胞膜上并形成孔道,使得细胞膜的通透性增加从而引起细胞内各种离子的渗漏和能量物质的消耗,导致细胞解体死亡[21]。
二是用食品级基因代替pMG36e 的抗性基因构建食品级载体。Jenog 以载体pMG36e 为基础,使用来自于植物乳杆菌的α-半乳糖苷酶(aga )基因替换红霉素抗性基因作为选择标记,成功在乳酸乳球菌中构建食品级表达/分泌载体,该载体可用来生产食品或药品。孙强正将质粒pMG36e 的p32启动子片段及乳酸乳球菌MG1363未知分泌蛋白(Usp45)基因的核糖体结合位点、分泌信号肽和成熟肽前11个氨基酸的编码序列(SPusp45)克隆到食品级载体pSH91中,构建分泌型食品级表达载体pSQ ,为目的蛋白的的分泌性表达及食品级疫苗的研制奠定了基础。
四、小结与展望
载体pMG36e 已用来表达多种基因,这为乳酸菌基因工程及分子生物学的研
究提供了一种技术平台,应用涉及到食品、保健、医药,为相关学科的深入研究提供重要的分子克隆的工具。
今后的研究重点应着眼错误!未找到引用源。于拓展“食品级”载体的宿主谱、提高表达产物的生物活性等。构建出的“食品级”乳酸菌高效表达载体系统有望在发酵工程和口服功能性生物制剂方面得到长足的发展。
错误!未找到引用源。
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范文四:基因工程载体及工具酶
基因工程载体及其工具酶
前言
随着基因工程在生物医药等领域的快速发展, 基因工程载体和工具酶的研究 显得越发重要,下面将对基因工程载体和工具酶进行概述
关键字:基因工程 载体 工具酶
一:基因工程载体
载体是指运载外源 DNA 有效的进入受体细胞内的工具。 载体同外源 DNA 在体 外重组成 DNA 重组分子, 在进入受体后形成一个复制子, 即形成在细胞内能独立 进行自我复制的遗传因子。
作为载体必须满足的条件:①有多种限制性内切酶的切点, 但每一种酶最好 只有一个切点; ②外源 DNA 插入以后载体在受体细胞中自我复制; ③有便于选择 的标记基因;④具有促进外源 DNA 表达的调控区。
质粒载体
质粒是在许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子。 它是闭合环状双链 DNA 分子,大小 1kb 到 200kb 不等。能自主复制,但要利用寄主细胞复制染色体的同 一组酶系。有某些基因,如抗药性基因,对寄主的生长是有利的。
质粒的复制分松弛型和严谨型两种。 松弛型质粒是指质粒的复制跟细菌染色 体的复制不同步, 一般在一个菌体内能复制 10-200拷贝; 严谨型质粒是指质粒复 制跟细菌染色体同步,一般含有 1-10拷贝。
一、质粒的基本特性
1.质粒的复制
通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始 区 (整个遗传单位定义为复制子) 。 在不同的质粒中, 复制起始区的组成方式是 不同的,有的可决定复制的方式,如滚环复制和 θ复制。在大肠杆菌中使用的 大多数载体都带有一个来源于 pMB1质粒或 ColE1质粒的复制起始位点。
2.质粒的拷贝数
质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。 严谨型质粒每个细胞中拷贝数有限, 大约 1~几个;松驰型质粒拷贝数较多,可达几百。
3.质粒的不相容性
两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性, 它是指在第二个 质粒导入后,在不涉及 DNA限制系统时出现的现象。不相容的质粒一般都利用 同一复制系统, 从而导致不能共存于同一宿主中。 两个不相容性质粒在同一个细 胞中复制时, 在分配到子细胞的过程中会竞争, 随机挑选, 微小的差异最终被放 大,从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
4.转移性
质粒具转移性。 它是指在自然条件下, 很多质粒可以通过称为细菌接合的作 用转移到新宿主内。它需要移动基因 mob ,转移基因 tra ,顺式因子 bom 及其 内部的转移缺口位点 nic。
二、标记基因
1. 选择标记
抗生素抗性基因是目前使用最广泛的选择标记。
①.氨苄青霉素抗性基因
氨苄青霉素抗性基因是基因操作中使用最广泛的选择标记, 绝大多数在大肠 杆菌中克隆的质粒载体带有该基因。 青霉素可抑制细胞壁肽聚糖的合成, 与有关 的酶结合并抑制其活性, 抑制转肽反应。 氨苄青霉素抗性基因编码一个酶, 该酶 可分泌进入细菌的周质区, 抑制转肽反应并催化 β-内酰胺环水解, 从而解除了 氨苄青霉素的毒性。
②.四环素抗性基因
四环素可与核糖体 30S亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。 四环素抗性基因编码一个由 399个氨基酸组成的膜结合蛋白, 可阻止四环素进入 细胞。 pBR322质粒除了带有氨苄青霉素抗性基因外,还带有四环素抗性基因。 ③.氯霉素抗性基因
氯霉素可与核糖体 50S亚基结合并抑制蛋白质合成。 cat 基因编码氯霉素乙 酰转移酶,一个四聚体细胞质蛋白(每个亚基 23kDa)。在乙酰辅酶 A存在的 条件下, 该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物, 使之不能与核糖体结 合。
④.卡那霉素和新霉素抗性基因
卡那霉素和新霉素是一种脱氧链霉胺氮基糖苷, 都可与核糖体结合并抑制蛋 白质合成。 卡那霉素和新霉素抗性基因实际就是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶 (APH (3' ) -Ⅱ, 25kDa)的基因,氨基糖苷磷酸转移酶可使这两种抗生素磷酸 化, 从而干扰了它们向细胞内的主动转移。 在细胞中合成的这种酶可以分泌至外 周质腔,保护宿主不受这些抗生素的影响。
2. 筛选标记
筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒, 当一个外源 DNA片段插入到 一个质粒载体上时,可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒,即重组质粒。 ①. α-互补(α-complementation )
α-互补是基于在两个不同的缺陷 β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建 立的。大肠杆菌的乳糖 lac 操纵子中的 lacZ 基因编码 β-半乳糖苷酶,如果 lacZ 基因发生突变,则不能合成有活性的 β-半乳糖苷酶。例如, lacZ △M15基因是缺失了编码 β-半乳糖苷酶中第 11-41个氨基酸的 lacZ 基因, 无酶学活 性。对于只编码 N-端 140个氨基酸的 lacZ 基因 (称为 lacZ' ) ,其产物也 没有酶学活性。 但这两个无酶学活性的产物混合在一起时, 可恢复 β-半乳糖苷 酶的活性,实现基因内互补。
在 lacZ' 编码区上游插入一小段 DNA片段 (如 51个碱基对的多克隆位点) , 不影响 β-半乳糖苷酶的功能内互补。但是,若在该 DNA小片段中再插入一个 片段,将几乎不可避免地导致产生无 α-互补能力的 β-半乳糖苷酶片段。利用 这一互补性质, 可用于筛选在载体上插入了外源片段的重组质粒。 在相应的载体 系统中, lacZ △M15放在 F质粒上 , 随宿主传代; lacZ ' 放在载体上 , 作为筛选标 记。
②.插入失活
通过插入失活进行筛选的质粒主要有 pBR322,该质粒具有四环素抗性基因 (tet r )和氨苄青霉素抗性基因(amp r )两种抗性标记。当外源 DNA片段插入
tet r 基因后, 导致 tet r 基因失活, 变成只对氨苄青霉素有抗性。 这样就可通过 对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源片段插入到载体中。
三、 质粒载体的种类
1. 克隆载体
克隆载体主要用于扩增或保存 DNA片段,是最简单的载体。
①. pBR322
pBR322质粒的大小为 4361bp, 含有 30多个单一位点, 具有四环素抗性基因 (tet r )和氨苄青霉素抗性基因(amp r ),其质粒复制区来自 pMB1。目前使用 广泛的多 质粒载 体几 乎都是 由此发 展而来 的。利 用四 环素抗 性基因 内部的 Bam HⅠ位点来插入外源 DNA片段,可通过插入失活进行筛选。
②. pUC18和 pUC19
pUC18和 pUC19大小只有 2686bp, 是最常用的质粒载体, 其结构组成紧凑, 几乎不含多余的 DNA片段, GenBank 注册号为 L08752(pUC18)和 X02514 (pUC19)。由 pBR322改造而来,其中 lacZ (MSC )来自 M13mp18/19。
这两个质粒的结构几乎是完全一样 的,只是多克隆位点的排列方向相反。 这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因,因此其拷贝数达 500-700。 pUC系列载 体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列,在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后,可通过 α-互补作用形 成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
2. 噬菌体载体与其他类型载体
λ噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体,在感染宿主后可进入溶源状态, 也可进入裂解循环。 λ噬菌体基因组为长度约为 50kb的双链 DNA分子, 实际大 小为 48502bp, 在噬菌体颗粒内, 基因组 DNA呈线性, 其两端的 5'末端带有 12个 碱 基 的 互 补 单 链 粘 性 末 端 , 叫 COS 位 点 。 12个 碱 基 的 序 列 为 5'-GGGCGGCGACCT-3' 。 当 λ噬菌体 DNA进入宿主细胞后, COS 位点两端互补单链 通过碱基配对形成环状 DNA分子,而后在宿主细胞的 DNA连接酶和旋促酶 (gyrase )作用下,形成封闭的环状 DNA分子,充当转录的模板。同时 COS 位 点也是噬菌体包装蛋白的识别位点,包装范围在 35kb -51kb 。
λ噬菌体的基因组可分为 3个区域:右侧的 DNA 复制与调控及裂解相关区域, 左侧是头部蛋白和尾部蛋白基因区域, 中间为非必需区, 可被外源基因取代。 野 生型 λ噬菌体基因组 DNA为 48kb,若用外源 DNA片段完全替换可取代区,外 源 DNA片段的大小将在 9-23kb范围内。
噬菌体载体
一、 λ噬菌体的选择标记:lacZ 基因
lacZ 基因也可用于 λ噬菌体载体, 通过插入或替换载体中的 β-半乳糖苷 酶基因片段,在 IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色,筛选重组噬菌体。 λ噬菌体载体的类型:
噬菌体 λ载体有两种类型:插入型和置换型。插入型 λ噬菌体是由于改建 后的噬菌体 λ较野生型短,所以可插入外源 DNA 。而且缺失的片段越长,插入 的片段越大。 置换型 λ噬菌体基因组分三个区域:左侧区域包括外壳蛋白基因, 约 20kb ; 中间区域 18kb , 为不重要的替换区, 可被外源基因替换; 右侧区域含有 复制及裂解基因, 约 12kb 。 λDNA 与外源 DNA 之和必须在 39-53kb 之间, 所以可 插入 7-21kb 的外源 DNA 片段。
二、单链 M13噬菌体:
M13丝状噬菌体是大肠杆菌的噬菌体,其基因组为单链环状 DNA 分子,全长 6.5 kb。 M13感染宿主菌以后,单链 DNA 转变成双链复制形式的 DNA ,当复制 200-300拷贝以后,又只合成单链 DNA ,最后包装成单链噬菌体粒子。
M13噬菌体的基因组为单链 DNA, 由 6407的碱基组成。 基因组 90%以上的序 列可编码蛋白质,共有 11个编码基因,基因之间的间隔区多为几个碱基。较大 的间隔位于基因 Ⅷ和基因 Ⅲ以及基因 Ⅱ和基因 Ⅳ之间, 其间有调节基因表达 和 DNA合成的元件。
M13单链噬菌体主要用于需要单链 DNA 做模板时, 如 DNA 测序。 M13噬菌体基 因组中主要含有与复制有关的遗传信息,只有一段由 507个核苷酸组成的序列可 被替换,因此 M13噬菌体载体只能插入约 300-400bp 的外源片段。
三、柯斯质粒载体:
1978年由 Collins 和 Hohn改建的一种新型的大肠杆菌克隆载体, 用正常的 质粒与噬菌体 λ的 cos 位点构成。一般长为 4-6kb 。含有 Amp r 和 Tet r 抗性基因。 其上的 cos 位点可识别噬菌体的外壳蛋白。 凡具有 cos 位点的任何 DNA 分子只要 在长度上相当于噬菌体基因组,就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体 λ的颗粒。因此,插入柯斯质粒的外源 DNA 片段的长度可大于 40 kb ,从而大大 增加了载体的携带能力。
工具酶
在基因工程的操作中, 通常要对目的基因或外源 DNA 片段以及载体 DNA 进行 剪切,修饰加工与连接等操作,这些处理是通过工具酶来完成的。
限制性内切核酸酶
一、限制性核酸内切酶的概念:
限制性核酸内切酶是一类能识别双链 DNA 分子中特异性核苷酸序列并由此特异 切割 DNA 双链结构的水解酶。 是在 DNA 分子内部切割, 水解磷酸二酯键的核酸内 切酶。能够识别特异的 DNA 碱基序列, DNA碱基序列往往呈回文对称结构;并 具有特异切割位点。
二、限制性核酸内切酶的分类:
根据酶的亚单位组成、 识别序列的种类和是否需要辅助因子, 限制与修饰系 统至少可分为三类。
I 类:识别特异顺序,序列外随机切割。基因工程中不用。
II 类:识别特异顺序,序列内特异切割,回文结构。基因工程中常用。
III 类:识别特异顺序,序列外特异切割,非回文结构。基因工程中特殊时候使 用。
Ⅱ型(type Ⅱ)限制与修饰系统所占的比例最大,达 93%。 Ⅱ型酶相对来 说最简单, 它们识别回文对称序列, 在回文序列内部或附近切割 DNA, 产生带 3'-
羟基和 5'-磷酸基团的 DNA产物,需 Mg2+的存在才能发挥活性,相应的修饰酶 只需 SAM。 识别序列主要为 4-6bp, 或更长且呈二重对称的特殊序列, 但有少数 酶识别更长的序列或简并序列,切割位置因酶而异,有些是隔开的。
Ⅱ型限制酶一般是同源二聚体(homodimer ),由两个彼此按相反方向结合 在一起的相同亚单位组成,每个亚单位作用在 DNA链的两个互补位点上。修饰 酶是单体, 修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成, 分别作用于其中一条链, 但 甲基化的碱基在两条链上是不同的。
在Ⅱ型限制酶中还有一类特殊的类型, 该酶只切割双链 DNA中的一条链, 造 成一个切口,这类限制酶也称切口酶,如 N.Bst NBI 。
在基因操作中, 一般所说的限制酶或修饰酶, 除非特指, 均指 Ⅱ 型系统中 的种类。 II 类限制性核酸酶特点:
1. 内切酶活性与甲基化酶活性分开;
2. 需要 Mg2+激活,但无需 ATP 辅助因子;
3. 特异识别,识别序列一般 4-6bp 长,偶尔 7bp ;
4. 识别顺序往往有回文结构;
5. 特异切割:切口有平切和错切两种类型。
三、限制酶产生的末端
1. 限制酶产生平头末端
2. 限制酶产生匹配粘端
3. 同裂酶
4. 同尾酶
四、影响限制性核酸内切酶切反应的因素
1.DNA 的纯度 (蛋白质、酚、氯仿、 EDTA 、 SDS 、高浓度的盐离子等
2. DNA 的甲基化程度
3. 酶切消化反应的温度
4. DNA 的分子结构
5. 限制性核酸内切酶的缓冲液
DNA 连接酶
DNA连接酶负责双链 DNA 中相邻 3`-OH与 5`-磷酸基团之间的磷酸二酯键的形 成。只能连接切口不能连接缺口。
最常用 T4连接酶。最适连接温度 37。 C 。
DNA连接酶既可以进行粘接(连接粘性末端) ,也可以进行端接(连接平头 末端) ,但粘接的效果比端接的效果要好许多倍。
从分子动力学的角度讲, 由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分 子内部的连接, 而平头末端的连接则属于分子间的连接, 因此后者反应速度要慢 得多 .
T4 DNA连接酶
T4 DNA连接酶的分子量为 68kDa,催化 DNA 5'磷酸基与 3'羟基之间形成 磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的 RNA(但效率低)或 DNA。低浓度 的聚乙二醇 PEG(一般为 10%)和单价阳离子(150-200mM NaCl )可以提高平端 连接速率。
连接反应条件需要 ATP, 若在 16℃ 反应, 大约需 4小时; 若在 4℃ 反应, 则需反应过夜。
DNA 聚合酶和 Klenow 大片段
真核细胞有 4种 DNA聚合酶 , DNA聚合酶 α位于细胞核内,也许是复合物, 有催化细胞增生的作用; DNA聚合酶 β是小分子蛋白质(4.4kDa ),曾从小牛 胸腺中提出, 与细胞增生无关; DNA聚合酶 γ为 100kDa, 利用 RNA为模板的效 率比利用 DNA为模板的效率高;其它的还有线粒体 DNA聚合酶,可以催化线粒 体 DNA的合成。
原核细胞有三种 DNA聚合酶,都与 DNA链的延长有关。聚合酶 Ⅰ是单链多 肽,可催化单链或双链 DNA的延长;聚合酶 Ⅱ则与低分子脱氧核苷酸链的延长 有关;聚合酶 Ⅲ在细胞中存在的数目不多,是促进 DNA链延长的主要酶。 逆转录酶
反转录酶的基本特性:以 RNA 为模板聚合 cDNA 链以及双向外切 DNA-RNA 杂 合链中的 RNA 链。
1. 以 mRNA 为模板合成 scDNA 。
2. 需要模板,引物,底物
3. 用于 cDNA 文库构建等
单链核酸酶 S1
1. 降解单链 DNA 或单链 RNA, 但对双链不起作用。
2. 用于降解双链 cDNA 发夹结构
3. 单链酶法获取目的基因
降解单链 DNA 的速度比降解双链 DNA 快 75000倍。
降解单链 DNA 的速度比降解单链 RNA 快 7倍。
碱性磷酸酯酶
分子克隆中使用的磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶简称 CIP或 CIAP, 也有来自细菌的碱性磷酸酶
它们均能催化除去 DNA或 RNA 5'磷酸的反应。通过去除 5'磷酸基团,可 用于防止 DNA片段自身连接,或标记(5' 端)前除 DNA或 RNA 5'磷酸。 CIAP可用蛋白酶 K消化灭活,或在 5mM EDTA 下, 65℃ 处理或 75℃ 处理 10分钟, 然后用酚氯仿抽提,纯化去磷酸化的 DNA,从而去除 CIAP的活性。与 CIAP不 同, SAP在 65℃ 处理 15分钟后完全并不可逆地失去活性,因此在去除残留活 性方面 SAP更有优势。 BAP抗性强、抗高温和去污剂。
碱性磷酸酯酶的作用是从 DNA 或 RNA 的三磷酸核苷酸上除去 5`磷酸根残基。 主要用于在 DNA 5`端进行 P 32标记以及用于防止酶切片段及载体酶切片段的粘性 末端的自连。
T4多核苷酸激酶
T4多核苷酸激酶是一种磷酸化酶,可将 ATP的 γ-磷酸基转移至 DNA或 RNA的 5'末端。在分子克隆应用中呈现两种反应,其一是正反应,指将 ATP的 γ-磷 酸基团转移到无磷酸的 DNA 5' 端,用于对缺乏 5'-磷酸的 DNA进行磷酸化。其 二是交换反应,在过量 ATP存在的情况下,该激酶可将磷酸化的 5'端磷酸转移 给 ADP,然后 DNA从 ATP中 γ-磷酸而重新磷酸化。
末端脱氧核苷酸转移酶
末端转移酶的作用是将脱氧核糖核苷酸通过磷酸二酯键加到 DNA 分子的
3`-OH末端。主要用于拼接人工接头或在 3`端进行引物标记的时候。
分子克隆中常用的末端转移酶来源于小牛胸腺, 是存在于前淋巴细胞及分化 早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的 DNA聚合酶,是一种不依赖于模板的 DNA 聚合酶。在二价阳离子存在下,末端转移酶催化 dNTP加于 DNA分子的 3'羟基端。若 dNTP为 T或 C,此二价阳离子首选 CO2+;若 dNTP为 A或 G此二 价阳离子首选 Mg2+。
作为该酶底物的 DNA可短至 3个核苷酸, 对 3'羟基突出末端的底物作用效 率最高。 在离子强度低时, 带 5'突出端或平端的 DNA也可作为底物, 但效率低。 因此,该酶可在 cDNA或载体 3'末端加同聚尾用于克隆;也可用标记的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP来标记 DNA片段的 3'末端。
参考文献:《 基因工程原理》第二版 马建岗 西安交通大学出版社
《基因工程》张惠展、贾林芝 高等教育出版社
范文五:植物基因工程载体系统
植物基因工程载体系统
摘要:基因载体是指将基因或其它核酸物质运载到细胞中的工具。本文主要介
绍了组成植物基因工程载体系统的几种常见的载体及其应用。
关键词:λ噬菌体 质粒 USER载体 植物基因工程
所谓基因工程就是用人工的方法,从不同生物中提取外源基因片段及载体DNA ,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法,把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞,并使其在植物细胞内进行复制和表达,以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的. 此种过程即称为植物基因工程. 在此项技术中,尤为重要的就是载体,不同目的基因需要采用不同的载体。随着生物科学不断地发展,组成植物基因工程载体系统的几种常见载体有质粒、噬菌体λ, 柯斯质粒(cosmid) 和噬菌体m 13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。[1 ] 1 载体系统概要
1.1载体系统
载体是指运载外源DNA 进入受体细胞内的运载工具。它同外源DNA 在体外重组成DNA 重组分子, 在进入受体后形成一个复制子, 即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。[2 ]因此, 作为载体应该具有以下几个要求: ①有某种限制酶的一个切点, 最好是有许多种限制酶的切点, 而且每种酶的切点只有一个; ②外源DNA 插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制, 载体应对受体细胞无害, 以及载体能接纳尽可能大的外源DNA 片段; ③有利于选择的标记基因, 可以很方便地知道外源DNA 已经插入, 以及把接受了载体的受体细胞选出; ④具有促进外源DNA 表达的调控区。
1.2克隆载体及表达载体
载体又可分成克隆载体和表达载体两大类。克隆载体一般是原核细菌将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接, 再导入原核细菌内, 质粒会在原核细
菌内大量复制, 形成大量的基因克隆。被克隆的基因不一定会表达, 但一定被大量复制。而表达载体是一些用于工程生产的细菌, 他们被导入目标基因, 这些目标基因会在此类细菌中得到表达。生产出我们需要的产物, 导入的基因是有克隆载体产出的。
2 植物基因工程载体的种类
2.1 Ti质粒载体
质粒是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子[3 ], 它是闭合环状的双链DNA 分子, 大小从1kb 直到200kb 以上。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。有些质粒处于“严紧控制”之下, 即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝, 或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。Ti 质粒侵染植物的农杆菌带有Ti 质粒,侵染植物后会产生冠瘿瘤。Ti 质粒上有一段transferDNA, 长为12-24kb ,能转移并整合到植物基因组中。但是Ti 质粒长约200-800kb ,过于庞大,并且不能在大肠杆菌中复制。[] 4
2.1.1 pBR322质粒载体
应用的最广泛的质粒载体是pBR322, 具有较小的相对分子质量,它属松弛型质粒, 有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因, 有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352 个核苷酸, 排列顺序已全部测定。具有较高的拷贝数。[] 5
2.1.2 pBR325质粒载体
对于Ti 质粒过大的问题,采用较小中间质粒的操作。通过努力,Zambryski 等以利用pBR322获得了一个T-DNA 同源区段构成的中间质粒pBR325,[]这种方法6
的缺点是必须通过中间质粒与Ti 质粒的共整合,才能将所需基因导入Ti 质粒,而共整合的频率极低
2.1.3 pUC质粒载体
pUC 质粒载体具更小的分子质量2.69kb 和更高的拷贝数500 - 700个,适于组织化学方法检测重组体,具多克隆位点MCS 区段。pUC 质粒含四个部分:①来自pBR322的质粒复制起点(ori );②ampr ; ③大肠杆菌β半乳糖苷酶基因(lacZ )的启动子及其编码α-肽链的DNA 序列;④多克隆位点(MCS )。
2.1.4 穿梭质粒载体
是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号,因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
2.2 λ噬菌体
λ噬菌体载体是主要用于cDNA 文库构建,也经常用于外源目的基因的克隆。λ噬菌体是温和噬菌体基因组是长约50kb 的双链DNA 分子。在λ噬菌体颗粒中,DNA 是线状双链分子带有单链的互补末端。末端长12 个核苷酸, 这称为粘性末端, 简写cos 。当噬菌体感染宿主细胞后, 双链DNA 分子通过cos 而成环状。在感染早期, 环状DNA 分子进行转录。在此期间, 噬菌体有两条复制途径可供选择: 一是裂解生长。环状DNA 分子在宿主细胞里复制若干次, 合成了大量的噬菌体基因产物, 形成子代噬菌体颗粒, 成熟后使细菌裂解, 释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体DNA 整合进宿主菌的基因组, 然后像细菌染色体上的基因一样进行复制, 并传递给下一代细菌。
2.3 单链噬菌体载体
最常用的单链噬菌体载体是m13和它的改建噬菌体。m13是丝状噬菌体, 有长约6500 个核苷酸的闭环DNA 基因组。m13附着在大肠杆菌的f 性菌毛上, 所以它们只能感染雄性细菌, 即f’或hfr 细菌。当噬菌体进入细菌细胞后, 单链的噬菌体DNA 转变成双链复制型( rf)。从细胞中分离的rf 可用作克隆双链DNA 的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份rf 型拷贝时,m 13 开始不对称的合成, 即只大量合成DNA 双链中的一条链。单链DNA 掺入成熟的噬菌体颗粒, 颗粒不断地从感染细胞上芽生。m13感染虽不杀死细胞, 但细胞的生长受到一定的抑制, 所以形成混浊的噬菌斑。
2.4 柯斯质粒[7]
1978 年collins 和hohn 构建一种新型的大肠杆菌克隆载体, 命名为cosmid (柯斯质粒) 。它是用正常的质粒同噬菌体λ的cos 位点构成。例如, 柯斯质粒phc79 系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos 位点的一段DNA 构成, 全长43kb 。在包装时, cos 位点打开而产生λ噬菌体的粘性末端。由于phc79有pBR322 DNA , 所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。广泛应用于基因组DNA 文库的构建。
2.5 噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列,称为噬菌粒。噬菌粒载体具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA ,可克隆高达10 kb 的外源DNA ;有ampr 等基因作为选择记号;拷贝数高;存在多克隆位点, 可克隆达10 kb 的外源DNA ;可用组织化学显色反应筛选重组子;具质粒复制起点,在无辅助噬菌体存在下,克隆外源基因可按质粒一样复制;有单链噬菌体复制起点,在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中,可合成出单链DNA 拷贝,并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。常见的噬菌粒载体有pEMBL8,pRSA101pUC118/pUC119和pBS 。
2.6 酵母人工染色体载体(YAC )
YAC 本身可小至8 kb,克隆能力可达1000 kb以上。可由Ycp 构建,主要使环状Ycp 切开线性化。[]YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如色氨酸、8
亮氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2 。
2.7 细菌人工染色体载体(BAC )
BAC 载体是建立在大肠杆菌的F 因子(大小约100kb )的基因础上;人工构建的BAC 较小(如pBeloBAC11仅有7.4 kb ,保留了与F 因子的自主复制、拷贝数控制及质粒分配等功能相关基因),但其克隆能力可达300 kb 以上,远大于柯斯质粒,但小于YAC 。
参考文献
[1]贾奈·米叠吾. 基因工程中的载体,高校理科研究,107-109.
[2]陈金中,薛京伦. 载体学与基因操作. 科学出版社.
[3]生命科学概论(第二版) 英文影印教材中国协和医科大学出版社.
[4]贾敬芬.Ti 质粒及其在植物遗传操作中的应用,遗传,7(6):41-45.
[5] 姚敦义,梁预. 质粒于载体. 济南教育学院学报,1999.1:(56-61)
[6]Chilton M.D.,1983,A vector for introducting new genes into plants,Sci.Amer.,246(6):51-59.
[7]中国生物工程杂志第24 卷.
[8]GanderE.J.,et al.,1991,Ggenetic engineering and the future,in “Principles of Genetics ”,8th Ed.,John Willey and Sons Inc.,pp.604-649.