范文一：细胞分裂中遗传物质的变化

细胞分裂中遗传物质的变化 第29卷第3期

Vo1.29No.3

济宁学院

JournalofJiningUniversity 2008年6月

Jun.2008

文章编号:1004—1877(2008)03—0038—03

细胞分裂中遗传物质的变化

张爱民

(济宁学院生物学系,山东曲阜273155) 摘要:生物遗传物质在细胞分裂过程中存在着复制,传递和变异,DNA的复制是细

胞分裂的重要步骤和

检查点,与核分裂之间存在着一种反馈,只有准确复制后,核分裂才能进行.在复制

和传递过程中,存在着遗传

物质的突变和重组.

关键词:细胞分裂;遗传物质;复制;传递;变异

中图分类号:Q343文献标识码:A

细胞分裂是细胞增殖的基本方式,对于单细胞生物而 言,细胞分裂意味着新个体的产生;对于多细胞生物,细胞 分裂则是个体生长发育及种族延续所必须的.细胞分裂 中最重要的变化在于遗传物质有规律的代谢过程,通过遗 传物质的复制,分离等将遗传物质承载的特定的生物遗传 信息得以合理的分配,传递,实现生物性状的准确,稳定的 延续.同时,这种机制通过染色体片段的互换,突变等形 式还能够最大可能的提高生物对环境的适应能力以应对 不断变化的环境.因此,无论单细胞生物,多细胞生物,深

入探讨细胞分裂过程中遗传物质代谢的机制对于理解生 物遗传与变异的多样性,统一性具有十分重要的意义. 1遗传物质的复制

DNA复制是细胞分裂的重要步骤和检查点,与分裂 之间存在着一种反馈,例如,核分1裂在DNA复制前不会 开始,只有当DNA复制后才能进行.所谓复制既包括遗 传物质的复制,还包括其他成分如细胞质的复制等,但遗 传物质的复制关系细胞分裂的成败及遗传性状的传递,复 制中出现的任何差错都有可能导致细胞分裂失败乃至对 生物带来可能是致命的危害.因此,遗传物质复制具有严 格的机制确保遗传物质复制的准确性.因此,遗传物质的 复制是一项复杂的系统工程,一方面需要消耗大量的物质 和能量,在细胞周期中持续的时间也最长.根据复制物质 种类的不同,将复制过程依次划分为G,S,G,.另一方 面,复制又是非常敏感的过程,复制阶段出现的差错更容 易对生物带来致命性的伤害.所以,生物往往选择在环境 比较稳定的条件下才会进行复制工作,而且还具备完善的 保护机制以确保复制的正常进行,如植物花粉形成过程中 胼胝质壁的形成.

在遗传物质复制中,DNA的复制最为关键.目前已 知道,DNA是严格按照半保留复制的方式进行.与原核 生物不同,真核生物复制完成的DNA立即与组蛋白结合. DNA复制开始与结束的时间既不在复制的开始,也不在 复制的结尾,而是在复制的中间,即S期,而且复制的整个 过程中都设有检查点以确保复制的准确性.只有DNA等 遗传物质准确复制,细胞分裂才会启动.

在细胞周期中,不同的细胞分裂方式复制开始,持续

,复制 的时间,复制的程度均不同.如有丝分裂,减数分裂是首先而且必须的环节,有丝分裂需要在间期全部完成遗

传物质的复制,减数分裂则需要在前间期完成大部分的复 制才会启动分裂的程序.但对于无丝分裂而言,则不尽 然.无丝分裂往往是在生物所面临不适环境时所必须选 择的快速完成分裂工作的一种形式,要实现快速的完成分 裂的过程,或者是先分裂后复制,或者是削弱是细胞周期 中持续时间最长的间期的复制.因此,无丝分裂的复制往 往比较简单,仓促,以确保有效,快速完成分裂,这种以牺 牲准确性为代价的复制可能导致遗传物质出现偏差,但许 多学者认为,这种偏差可能是生物可以接受的,而且多细 胞生物在一些不涉及遗传传递又要求快速生长的部位,这 种无丝分裂的方式可能是最好的一种选择.

2遗传物质的传递

每一种生物,每一个个体都希望在生物竞争中将自身 的遗传性状传递下去,要实现遗传性状的传递必须确保遗 收稿日期:2008—O3—11

作者简介:张爱民(1962一),男,山东曲阜人,济宁学院生物学系副教授,研究方向:遗

传学与生物发育学.

传信息载体——遗传物质的准确传递.在长期的演化过 程中,生物体形成了各种遗传物质的传递机制,在传递的 过程中遗传物质可能是均分的,如有丝分裂及减数分裂; 但也可能是有差异的,如无丝分裂.

2.1遗传物质的均分'

遗传物质的均分是确保生物性状稳定传递最起码的 要求,因此,无丝分裂,有丝分裂,减数分裂都能有效的以 各自特定的机制,特定的载体形式实现遗传物质的均分. 2.1.1二分裂.原核生物如细菌,不具核膜核仁,只 有一个大型的环状DNA分子,细胞分裂时,DNA分子附 着在细胞膜上并复制为二,然后随着细胞膜的延长,复制

的两个DNA分子彼此分开实现遗传物质的均分.由于原 核生物分裂的过程中无纺锤丝和染色体出现,一般称其为 无丝分裂,但与一般的无丝分裂不同,二分裂是原核生物 在正常条件下进行的一种具有准确遗传物质均分机制的 分裂方式,笔者以为将其与无丝分裂分离开来比较准确. 2.1.2有丝分裂.有丝分裂过程中,遗传物质以一种 特定的载体形式染色体,即染色质高度螺旋化形成了一种 特定结构,通过其排赤道面,着丝点的断开,在马达蛋白的 作用下分离实现遗传物质的均分.当然,在染色体有规律 的会聚行为中还出现了另一种重要结构纺锤丝,并构成纺 锤体协助染色体实现均分的过程.这种协助的意义,多数 学者认为主要是为染色体的分离提供运行的轨道,确保分 离后的子染色体准确到达极位置0J.关于减数分裂,实 际上也是一种有丝分裂过程,因为其分裂的过程中同样出 现了染色体和纺锤丝,并且遗传物质均分的机制也与有丝 分裂基本相同.如果比较二者在遗传物质均分过程中的 不同,减数分裂一次复制却连续进行了两次均分过程,使 子细胞仅具有母细胞一半的遗传物质量,并且第一次分离 的对象是同源染色体.染色体,纺锤丝作为有丝分裂的基 本特征,然而却不一定是有丝分裂过程所必须的.杨红燕 等研究认为似金隐藻有丝分裂的过程中并没有出现染色 体,染色质仅凝集成块状,并且染色质团块上没有着丝点, 中期时染色质团块排赤道板,并且染色体团块均分及分离 是伴随胞质分裂进行的,而且色素体内质网膜对染色质团 块的移动可能起了一定的作用J.

2,1,3核内有丝分裂.与普遍的有丝分裂不同,核内 有丝分裂没有出现核膜核仁消失的过程,即核分裂中核膜 始终保持完整.类似于二分裂,核内有丝分裂中一种特殊 的遗传物质均分机制是依靠核膜的生长得以实现的,如原

核生物曲沟藻,虽然细胞分裂中出现了纺锤丝和染色体, 但其遗传物质的均分是依靠将染色体固着在核膜上,通过 核膜的生长实现复制后的二条染色体分离.而其纺锤丝 如细菌的细胞壁一样坚硬,并不插入到核膜内,更不与染 色体的着丝点相连,而是成束分布在细胞质中,以起到支 撑作用利于核膜生长.

还有,无丝分裂.由于分裂的过程中没有出现纺锤丝 和染色体,不少学者认为无丝分裂不能保证遗传物质的均 分,然而近些年来研究表明无丝分裂也具有稳定的遗传机 制,能够确保形成的子核遗传物质均分.无丝分裂中 遗传物质均分的方式是多样的,如缢裂,劈裂等.陆文梁 推测小麦花粉生殖细胞在低温下劈裂是通过在核中部形 成一道很细的裂缝,将核比较均等地分裂为两部分.目 前,关于无丝分裂遗传物质均分的机制研究的还不多,有 待进一步探讨.

2.2遗传物质的不均分

遗传物质的均分往往是细胞分裂所必须的,然而在一 些特殊的条件下,遗传物质未必均分.这种未均分可能是 生物体正常的代谢所必须的,如花粉粒发育的过程中,单 核的花粉粒不断吸收绒毡层营养并长大,细胞核经一次遗 传物质不均分的有丝分裂过程形成有差异的两个核,营养 核和生殖核,其中营养核呈球形,较大;生殖核较小,通常 呈椭圆形或纺锤形.这种正常的不均分与两子核的功能 要求的差异有关J.再如稻麦胚乳发育中的无丝分裂也 会造成了游离核遗传物质的不均分,胚处的游离核通常比 正常核要小,且形状各异,反足处的游离核则较其他部位 的大等,也是植物体快速发育中出现的正常情况j. 然而,更多的遗传物质不均分发生是由于环境的不适 导致细胞分裂出现偏差所造成的.细胞分裂是非常敏感

的过程,无论有丝分裂,减数分裂,无丝分裂,残酷恶劣的 环境条导致细胞分裂中遗传物质的丢失,均分机制的失常 等,都会造成遗传物质均分的失败,而且更为严重的是这 种不均分往往对生物体是有害的.如段晓刚认为羊草小 孢子形成过程中无丝分裂可能是异常条件所致,其结果导 致核物质分配很不均匀,甚至出现了在新形成的子细胞中 一

个有核一个无核的现象.

3遗传物质的变异

变异是自然选择和生物进化前提,合理科学的变异机 制能够为后代创造更好的生存,繁衍的机会.遗传物质重 组和基因突变是生物长期演化中形成的两种最为常见和 有效的变异机制,其中遗传物质重组是一种生物自主并相 对稳定的变异机制,基因突变更多是发生在环境的作用下 的不确定性的变异,并常常会给生物带来不利的影响. 3.1遗传物质的重组

3.1.1减数分裂

减数分裂是在生殖细胞发育过程中一种特定的细胞 分裂方式,通过减数分裂形成的生殖细胞的遗传物质的状 况直接关系亲本双方遗传性状的继承,同时也涉及到后代 的生存适应力.因此,减数分裂第一次分裂的前期通过同 源染色体的联会配对,姊妹染色单体的交叉扭合等实现染 色体片段的互换,即遗传物质的重组,为双亲遗传性状的 传递提供一种最大程度的可能,同时也提供了一种稳定的 变异机制,极大的增强了后代的适应性和生存力. 3.1.2有丝分裂

一

39—

遗传物质重组不仅发生在减数分裂过程中,研究表明 有丝分裂也可发生遗传物质的重组现象.其过程类似于 减数分裂染色体片段互换的过程.不过,与减数分裂不 同,有丝分裂染色体片段的互换既可发生在同源染色体的 染色单体之间,也可发生在非姊妹染色单体间.但有丝分 裂发生遗传物质重组的频率要比减数分裂低得多,而且一 个细胞一旦发生了一次有丝分裂的染色体重组,则在同一 条染色体上或甚至不同的染色体上再次发生染色体重组 的机会非常小,减数分裂遗传物质的重组则几乎可以发生 在每一条染色体上川.与减数分裂一样,有丝分裂遗传 物质重组所产生的变异为增强后代适应力提供一种机制, 特别是对于那些有性生殖退化的真菌具有更特殊的适应 意义.不过,有的专家则认为有丝分裂过程中染色体间遗 传物质的重组及姊妹染色单体间交换与DNA的损伤和修 复有密切的关系.

3.2基因突变

基因突变是细胞分裂中遗传物质变异的一种常见方 式,其主要表现在DNA分子碱基顺序的改变.细胞分裂 的过程是一个非常敏感的过程,在分裂过程中一旦受到 内,外因素的干扰,不可避免的会发生基因突变现象,就突 变而言,其带来的生物性状的变异,可能对生物体是有适 应意义的,也可能是非常有害的.园艺生产中常常利用果 树的芽变等培育新的优良品种,实际上就是利用有丝分裂 过程中突变导致的变异.

参考文献:

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(责任编辑刘顺湖)

Changeofgeneticmaterialincelldivision

ZHANGAiming

(DepartmentofBiology,Jiningcollege,Qufu273100,China) Abstract:Duringcelldivision,geneticmaterialisexistingthereplication,transferandmutati

on.Asanimpor-

tantprocessofcelldivision,anucleusdivisionhasafeedbacktoDNAreplicationandalwayso

ccursafterthe

nucleusdivision.Thereexistmutationsandrecombinationduringtheprocessofhereditarym

aterialreplication

andtransfer.

Keywords:celldivision;geneticmaterial;replication;transfer;mutation ..-——

40...——

范文二：细胞分裂中遗传物质的变化

第 29卷第 3期 济宁学院学报 年 6月 2008Vo .l 29 No. 3 J un. 2008 Jou rna l of J in ing U n ive rsity

( ) 文章编号 : 1004 —1877 2008 03 —0038 —03

细胞分裂中遗传物质的变化

张爱民

()济宁学院生物学系 ,山东 曲阜 273155

摘 要 :生物遗传物质在细胞分裂过程中存在着复制 、传递和变异 , DNA 的复制是细胞分裂的重要步骤和

检查点 ,与核分裂之间存在着一种反馈 ,只有准确复制后 ,核分裂才能进行 。在复制和传递过程中 ,存在着遗传

物质的突变和重组 。

关键词 :细胞分裂 ;遗传物质 ;复制 ;传递 ;变异

中图分类号 : Q343 文献标识码 : A

细胞分裂是细胞增殖的基本方式 ,对于单细胞生物而 ,如植物花粉形成过程中 保护机制以确保复制的正常进行

言 ,细胞分裂意味着新个体的产生 ;对于多细胞生物 ,细胞 胼胝质壁的形成 。

分裂则是个体生长发育及种族延续所必须的 。细胞分裂 在遗传物质复制中 , DNA 的复 制 最 为 关 键 。目 前 已 中最重要的变化在于遗传物质有规律的代谢过程 ,通过遗 知道 , DNA 是严格按照半保留复制的方式进行 。与原核 传物质的复制 、分离等将遗传物质承载的特定的生物遗传 生物不同 ,真核生物复制完成的 DNA 立即与组蛋白结合 。 信息得以合理的分配 、传递 ,实现生物性状的准确 、稳定的 DNA 复制开始与结束的时间既不 在复制的开始 , 也不在 延续 。同时 ,这种机制通过染色体片段的互换 、突变等形 复制的结尾 ,而是在复制的中间 ,即 S期 ,而且复制的整个 式还能够最大可能的提高生物对环境的适应能力以应对 过程中都设有检查点以确保复制的准确性 。只有 DNA 等 不断变化的环境 。因此 ,无论单细胞生物 、多细胞生物 ,深 遗传物质准确复制 ,细胞分裂才会启动 。 入探讨细胞分裂过程中遗传物质代谢的机制对于理解生 在细胞周期中 ,不同的细胞分裂方式复制开始 、持续 物遗传与变异的多样性 、统一性具有十分重要的意义 。 的时间 、复制的程度均不同 。如有丝分裂 、减数分裂 ,复制

是首先而且必须的环节 ,有丝分裂需要在间期全部完成遗

传物质的复制 ,减数分裂则需要在前间期完成大部分的复制才会启动分裂 的 程 序 。但 对 于 无 丝 分 裂 而 言 , 则 不 尽

然 。无丝分裂往往是在生物所面临不适环境时所必须选 1 遗传物质的复制

择的快速完成分裂工作的一种形式 ,要实现快速的完成分

裂的过程 ,或者是先分裂后复制 ,或者是削弱是细胞周期 DNA 复制是细胞分裂的 重要步骤和检查点 , 与 分 裂 中持续时间最长的间期的复制 。因此 ,无丝分裂的复制往 之间存在着一种反馈 ,例如 ,核分 1裂在 DNA 复制前不会 往比较简单 、仓促 ,以确保有效 、快速完成分裂 ,这种以牺 开始 ,只有当 DNA 复制后才能进行 。所谓复制既包括遗 牲准确性为代价的复制可能导致遗传物质出现偏差 ,但许 传物质的复制 ,还包括其他成分如细胞质的复制等 ,但遗 多学者认为 ,这种偏差可能是生物可以接受的 ,而且多细 传物质的复制关系细胞分裂的成败及遗传性状的传递 ,复 胞生物在一些不涉及遗传传递又要求快速生长的部位 ,这 制中出现的任何差错都有可能导致细胞分裂失败乃至对 种无丝分裂的方式可能是最好的一种选择 。 生物带来可能是致命的危害 。因此 ,遗传物质复制具有严

格的机制确保遗传物质复制的准确性 。因此 ,遗传物质的

复制是一项复杂的系统工程 ,一方面需要消耗大量的物质

和能量 ,在细胞周期中持续的时间也最长 。根据复制物质

种类的不同 , 将 复 制 过 程 依 次 划 分 为 G、S、G。另 一 方 1 2

面 ,复制又是非常敏感的过程 ,复制阶段出现的差错更容

易对生物带来致命性的伤害 。所以 ,生物往往选择在环境 2 遗传物质的传递 比较稳定的条件下才会进行复制工作 ,而且还具备完善的

每一种生物 、每一个个体都希望在生物竞争中将自身

的遗传性状传递下去 ,要实现遗传性状的传递必须确保遗

收稿日期 : 2008 —03 —11

( ) 作者简介 :张爱民 1962 - ,男 ,山东曲阜人 ,济宁学院生物学系副教授 ,研究方向 : 遗传学与生物发育学 。

染色体 ,不少学者认为无丝分裂不能保证遗传物质的均 3. 1. 2有丝分裂

— 39

14 - 16. 遗传物质重组不仅发生在减数分裂过程中 ,研究表明 [ 5 ]刘金香. 大蒜幼小鳞茎细胞分裂方式的研究 [ J ]. 江西教 有丝分裂也可发生遗传物质的重组现象 。其过程类似于 () ( ) 育学院学报 自然科学 , 1996 , 17 6 : 37 ,39. 减数分裂染色体 片 段 互 换 的 过 程 。不 过 , 与 减 数 分 裂 不 [ 6 ]王琦 ,张丕方. 斑叶海棠薄层培养中细胞无丝分裂及 2 , 4 同 ,有丝分裂染色体片段的互换既可发生在同源染色体的 ( ) - D 的特殊效应的研究 [ J ]. 西北植物学报 , 1988 , 9 1 : 染色单体之间 ,也可发生在非姊妹染色单体间 。但有丝分

1 - 5. 裂发生遗传物质重组的频率要比减数分裂低得多 ,而且一 [ 7 ]陆文梁. 低温中小麦花粉生殖细胞的无丝分裂 [ J ]. 科学 个细胞一旦发生了一次有丝分裂的染色体重组 ,则在同一 通报 , 1981 , 26: 753 - 755. 条染色体上或甚至不同的染色体上再次发生染色体重组 [ 8 ]北京林学院主编. 植物学 [ M ]. 北京 : 中国林业出版 社 , 的机会非常小 ,减数分裂遗传物质的重组则几乎可以发生 [ 2、11 ] 1989. 在每一条染色体上 。与减数分裂一样 ,有丝分裂遗传 [ 9 ]王忠 ,陈刚 ,李克武等. 稻麦胚乳游离核的分裂 [ J ]. 江苏 物质重组所产生的变异为增强后代适应力提供一种机制 , ( ) 农学院学报 , 1996 , 17 1 : 11 - 20. 特别是对于那些有性生殖退化的真菌具有更特殊的适应 ( ) [ 10 ]段晓刚. 羊草小孢子的无丝分裂 [ J ]. 遗传 , 1983 2 , 48. 意义 。不过 ,有的专家则认为有丝分裂过程中染色体间遗 [ 11 ]李雅轩. 有丝分裂过程中染色体的交换 [ J ]. 生物学通 传物质的重组及姊妹染色单体间交换与 DNA 的损伤和修 ( ) 报 , 1999 , 34 8 : 17 - 18. 复有密切的关系 。 [ 12 ]B aum ann A , L ange C, Sopp a J. Tran sc rip tom e changes and 3. 2基因突变 基因突变是细胞分裂中遗传物质变异cAM P o scillation s in an a rchaea l ce ll cyc le. BMC Cell B io l. 的一种常见方 ( ) 2007 Jun 11; 8 1 : 21 式 ,其主要表现在 DNA 分子碱基顺序的改变 。细胞分裂 [ 13 ] Gho sh A K, B ha ttacha ryya S, V a rga J. The tumo r supp re s2 的过程是一个非常敏 感的过程 , 在 分 裂 过 程 中 一 旦 受 到

so r p53 ab roga tes Sm ad - dep enden t co llagen gene induc tion 内 、外因素的干扰 ,不可避免的会发生基因突变现象 ,就突

变而言 ,其带来的生物性状的变异 ,可能对生物体是有适 in m e senchym a l ce lls. J B io l Chem. 2004 Nov 12; 279 应意义的 ,也可能是非常有害的 。园艺生产中常常利用果 ( ) 46 : 47455 - 63.

树的芽变等培育新的优良品种 ,实际上就是利用有丝分裂 [ 14 ] Zhou T, Chou JW , Simp son DA , Zhou Y, M u llen TE, M e2 过程中突变导致的变异 。 de iro s M , B u she l PR , Pau les R S, Yang X, H u rban P, Lo2

benhofe r EK, Kaufm ann W K. P rofiles of globa l gene ex2

p re ssion in ion izing - rad ia tion - dam aged hum an d ip lo id fi2

b rob la sts revea l synch ron iza tion beh ind the G1 checkpo in t in

a G0 - like state of qu ie scence. Environ H ea lth Pe rsp ec t.

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( ) [ 4 ]姚敦义 ,张慧娟. 细胞分裂 [ J ]. 生物学通报 , 1992 , 9 :

C han ge of gen e t ic m a ter ia l in ce ll d iv is ion

ZHA NG A im in g

( )D ep a rtm en t of B io logy, J in ing co llege, Q ufu 273100 , Ch ina

A b stra c t: D u ring ce ll d ivision, gene tic m a te ria l is existing the rep lica tion、tran sfe r and m u ta tion. A s an impo r2 tan t p roce ss of ce ll d ivision, a nuc leu s d ivision ha s a feedback to DNA rep lica tion and a lways occu rs afte r the nuc leu s d ivision. The re exist m u ta tion s and recom b ina tion du ring the p roce ss of he red ita ry m a te ria l rep lica tion and tran sfe r.

Keyword s: ce ll d ivision; gene tic m a te ria l; rep lica tion; tran sfe r; m u ta tion

范文三：遗传物质的传递

《遗传信息的传递》教学设计

一. 设计思想：

总体设计指导思想本节课突出对学生科学素质的培养，精心设计课堂教学，将科学研究的过程（发现问题——提出假设——推导结论——实验验证——得出结论）作为本节课的教学主线，以求向学生介绍科学研究的一般过程和方法，并让学生亲身参与探究过程，从而培养学生科学工作的能力和方法。

二. 教材分析：

教材中的地位本节课内容是浙教版高中课本生物必修2第三章第三节遗传物质的传递是遗传学的基本理论。这一课时，在联系DNA 结构的基础上，进一步阐明DNA 通过复制传递遗传信息的功能。学好这一课时，有利于学生对有丝分裂、减数分裂、遗传规律等知识得理解和巩固，对于学生深刻认识遗传的本质是非常重要的。“DNA的复制”又是后面变异部分的基础，学好这一课时，有利于学生对基因突变、基因重组、生物进化等内容的理解和掌握。 三. 学情分析

学生在上节课已了解了DNA 的结构，同时学生经过必修1和必修2的学习，已经初步具有获取信息、处理信息以及利用信息的能力，能较好地完成对本节中视频的理解和分析。 四. 教学目标

（一）知识与技能

1. ．能熟练说出碱基互补配对原则和各碱基在DNA 分子中所占的比例关系。 2．了解DNA 分子的稳定性、多样性和特异性与丰富多采的生物界的关系。 （二）能力与方法

1．培养自学能力：在自学中去领悟知识，去发现问题和解决问题。 2．培养观察能力、分析理解能力：通过计算机多媒体软件和DNA 结构模型

观察来提高观察能力、分析和理解能力。 3．通过讨论交流培养学生口头表达能力和逻辑思维能力。

4．培养创造性思维的能力：通过探索求知、讨论交流激发独立思考、主动获

取新知识的能力。 （三）情感态度与价值观

1. 通过DNA 的半保留复制的学习，探索生物界丰富多彩的奥秘，从而激发学生学科学、用科学、爱科学的求知欲望。 2. 从小树立敢于攀登，勇于拼搏的精神。

五. 教学重点与难点： DNA 的半保留的复制 关于DNA 复制的计算问题。

六. 教学工具 ：多媒体、DNA 复制过程图解

七. 教学方法：多媒体教学组合模式，采用自学、讨论与讲述法。

九． 板书设计

十. 作业

1．在生物实验室内模拟生物体DNA 复制所必需的条件是 [ ]

①酶类 ②游离四种脱氧核苷酸 ③ATP ④DNA 分子 ⑤mRNA ⑥

tRNA ⑦适宜的温度 ⑧适宜的PH 值 答案：D 。 A ．①②③④⑤⑥ B ．②③④⑤⑥⑦ C ．①②③⑤⑦⑧ D ．①②③④⑦⑧

2．某生物的双链DNA 分子共含有氨碱基700对，其中一条链上（A+T）：（C+G）

=2.5，问该DNA 分子连续复制两次共需游离的胸腺嘧啶脱氧核苷酸的数目是 [ ] A ．300个 B ．400个 C ．600个 D ．1200个 答案：C 。

范文四：细胞的遗传物质

第二篇 细胞的遗传物质

第二章 核酸杂交技术

自Southern于1975年创建了检测特异DNA的核酸杂交技术以来，Southern

杂交以及在此基础上发展起来的其它核酸杂交技术已成为分子生物学的基本技

术。

核酸杂交（hybridization）是两条互补的核苷酸单链在特定的条件下退火形成

异质双链的过程。核酸杂交是建立在以碱基互补为基础的、以双链核酸分子在特

定条件下的变性和复性为手段的，对核酸分子进行定性和定量检测的技术。即把

经酶切的、电泳分离的、经碱变性后生成单链分子的待检测核酸片段转印到特定

的膜上，用已知特定序列的标记探针与之杂交，以检验该核酸片段是否与已知的

探针有同源序列。

核酸杂交既可以是DNA与DNA链、RNA与RNA链之间的杂交，又可以是DNA与RNA链之间的杂交（图2-2-1）。待检核酸既可以是内源的又可以是外源

的，既可以是细胞生物的基因组又可以是质粒和病毒的核酸。探针或是用基因克

隆技术分离获得的特异的DNA序列，或是特异DNA序列在体外转录出的RNA

序列或cDNA序列，或是人工合成的寡核苷酸片段；探针的标记物或是放射性

同位素，或是一些非放射性物质如生物素、地高辛和荧光素等。核酸杂交可进行

染色体图谱分析，测定特异DNA序列的拷贝数（甚至可检测到哺乳动物基因组

中的单拷贝基因），鉴定与疾病有关的限制性片段长度多态性标记，进行基因克

隆的筛选，检测不同浓度的DNA，鉴别特异基因的表达部位，进行RNA结构的

初步分析、特异RNA的定量检测，分析基因转录的含量变化，末端标记的寡核

苷酸探针可检测点突变，确定有无病毒感染等。

图2-2-1 核酸杂交路线图

第一节 核酸探针

一、核酸探针的概念

核酸探针是含有标记物的已知特定序列的核酸片段，因为与待检测核酸片段

具有高度同源性而结合，可以对待检测核酸进行定性、定量和定位的工具。

二、探针的种类及选择

根据核酸探针分子性质的不同可分为DNA探针和RNA探针，根据核酸探针来源的不同又分为基因组DNA探针、人工合成的寡核苷酸探针和cDNA探针。可以根据实验目的的不同和来源是否经济，选择不同性质或来源的探针。选择探

针时所应遵循的基本原则是核酸探针与待检测核酸片段间要具有高度同源性。

三、探针的标记

核酸探针如今已被广泛应用于分子生物学的许多研究领域中。最早使用的放

射性同位素标记的核酸探针具有灵敏度高、特异性强等特点，但因放射性同位素

半衰期短、具放射性污染、成本高等原因，逐渐被非放射性的探针标记物---生物素、地高辛和荧光素等替代。

（一）标记物的种类

1．放射性标记物 放射性同位素是最早使用的核酸探针标记物。可供选择

3233514125131P、H、S、C、I、或I，前三种较常的用于探针标记的放射性同位素有

用。但放射性同位素在探针标记中由于存在放射性污染、半衰期短及在储存、运

输和后期处理上的不便利因素，而逐渐被安全性较高的非放射性标记物所替代。

2．非放射性标记物

（1）生物素：生物素是一种生物小分子，可与亲和素（Avidin，Av）发生特异性的结合，形成生物素-亲和素的生物反应放大系统，而用于对标记有生物

素的核酸探针的显示。亲和素是一种碱性的糖蛋白，由四个相同的亚基组成，每

个亚基都可以结合一个生物素分子，这种四价反应产生了放大效应。生物素与亲

和素相互结合的亲和力高、稳定性很好。但亲和素是一种糖蛋白，应用中往往有

较高的非特异性结合。1963年，Chaiet在从链球菌培养液中筛选抗菌素时发现

了一种能与生物素结合的类亲和素蛋白质-链酶亲和素（Streptavidin, Sa）。链酶亲和素与亲和素的结构相似，但不含糖基，因而以链酶亲和素代替亲和素，弥补

了亲和素非特异性结合高的缺点。

根据生物素与亲和素或链酶亲和素间特异性结合的属性，通过与偶联有荧光

素或特定的报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）相互作用，形成“靶核酸-探针-生物素-亲和素-报道酶（或荧光素）”连接复合体。之后，通过检测荧光物质的存在或使报道酶发生水

解生色或化学发光反应而完成对目的核酸的检测。但是，由于生物素普遍存在于

生物体内，因此在Southern、Northern和原位杂交中造成本底升高。另外，生物

素化的探针可牢固地结合于尼龙膜上，也可造成本底升高。鉴于生物素的以上缺

点，促使人们去寻找特异性强于生物素的其它探针标记物。

（2）地高辛：地高辛(digoxigenin, Dig)是一种类固醇半抗原分子，可以通过

一连接臂被人工连接于dUTP上，如形成Dig-11-dUTP，在酶学反应中可代替dTTP掺入到探针中去。自然界中只有洋地黄类植物产生地高辛，所以相对来说，

以地高辛标记的探针在Southern、Northern和原位杂交中本底较低，它的特异性

优于生物素。地高辛标记的杂交复合体，可用与报道酶如碱性磷酸酶或辣根过氧

化物酶偶联的抗地高辛的抗体加以检测，如使报道酶发生水解生色或化学发光反

应。

（3）荧光素：核酸探针可以直接用荧光素(fluorecein)标记，如罗丹明或FITC。

荧光素标记的探针系统，使用的是荧光素-12-dUTP或荧光素-12-UTP（也有用荧光素-11-dUTP或荧光素-11-UTP）代替dTTP或TTP在酶学反应中掺入到探针中去，然后用连接有报道酶如碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）或辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase）的抗荧光素抗体检测。

（二）探针标记的方法

总体看来，核酸探针标记的方法有两大类：酶促法和光化学标记法。酶促法

是通过酶促反应预先将标记物标记在核苷酸分子上，常用的核酸探针标记的酶促

法有缺口平移法、PCR末端填补法、随机引物标记法和转录标记法等。光化学

标记法是将生物素的衍生物—连接有硝基苯叠氮的生物素—光敏生物素在UV

或强可见光（350nm）照射激发下，形成的一个芳香硝基中间化合物（氮宾）可

以非特异性地与DNA或RNA形成稳定的共价键而将生物素引入已经合成好的

核酸探针中，这样，标记有生物素的探针可以被亲和素标记的报道酶或荧光物质

所检测。用光化学标记法制备的核酸探针因为平均每200个左右核苷酸才带有一个生物素残基，所以不会影响探针与靶核酸的杂交，足以用于在针对哺乳动物基

因组中的Southern杂交中检测出单拷贝序列。相比之下，光化学标记法的标记

效率远低于酶学标记法，另外，光化学标记法较酶学标记法所获得的探针的信号

强度要弱许多，所以，在进行探针标记时，人们首选的是酶学标记法。

四、探针的纯化

一般情况下，用于杂交的核酸探针在制备完成后，可直接用于进行杂交实验。

但如果探针过长的话（＞25nt），在制备过程中就会有一些不符合长度要求的核

苷酸片段被合成，对于某些探针精度要求较高的实验，需要进行探针纯化。常用

的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳、柱层析、阳离子去垢剂沉淀法和乙醇沉淀法。

第二节 Southern杂交技术

一、Southern杂交的概念

Southern杂交技术是将凝胶电泳分离的酶切DNA片段通过印记法（imprinting）转移到硝酸纤维素膜上，检测标记过的探针是否与变性后的DNA发生杂交，而对靶DNA进行定性和定量的一项分子生物学技术，包括DNA的印记转移和DNA的杂交两部分内容。

二、Southern杂交的一般程序

首先从组织或培养细胞分离基因组DNA，并以一种或多种限制性核酸内切

酶消化基因组DNA，消化后所得的DNA片段以标准琼脂糖凝胶电泳进行大小分

离，再对DNA进行原位变性，以印记法将DNA片段从胶上转移至固相支持物

上（如尼龙膜或硝酸纤维素膜）（图2-2-2），用标记的DNA或RNA探针在膜上与转印后的DNA片段杂交，最后，针对不同的探针标记物选择特定的检测方法

如放射自显影法、比色法、荧光检测或化学发光检测来确定与探针互补的靶DNA的存在及位置（图2-2-3）。

图2-2-2 印记转移

图 2-2-3 Southern杂交路线图

三、Southern杂交的实验步骤：

（一）材料与设备

1．PBS：0.137 mol/L NaCl

2.68 mmol/L KCl

7.89 mmol/L NaHPO24

1.47 mmol/L KHPO(pH 7.2) 24

2．STEL缓冲液：0.2% SDS

10 mmol/L Tris-HCl (pH7.5)

10 mmol/L EDTA

100 mmol/L LiCl

3．5 mol/L LiCl

4．TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl (8.0)

1 mmol/L EDTA (8.0)

5．限制酶高盐缓冲液（1×）：100 mmol/L NaCl

50 mmol/L Tris-HCl (7.5)

10 mmol/L MgCl2

1 mmol/L DTT

6．限制酶中盐缓冲液（1×）：50 mmol/L NaCl

10 mmol/L Tris-HCl (7.5)

10 mmol/L MgCl2

1 mmol/L DTT

7．限制酶低盐缓冲液（1×）：10 mmol/L Tris-HCl (7.5)

10 mmol/L MgCl2

1 mmol/L DTT

8．牛血清白蛋白：1 mg/ml

9．限制性内切酶

10．上样液（6×）：0.25% 溴酚蓝

0.25% 二甲苯氰FF

30%甘油水溶液

11．10×TBE：Tris 545g

硼酸 278g

EDTA 46.5g

去离子水 5L

12．亚精胺：100 mmol/L

13．溴化乙锭（EB）：10 mg/ml的母液

14．脱嘌呤缓冲液：0.25 mol/L HCl

15．变性缓冲液：1.5 mol/L NaCl

0.5 mol/L NaOH

16．转移缓冲液：1.5 mol/L NaCl

0.5 mol/L NaOH

17．20×SCC：3 mol/L NaCl

0.3 mol/L 柠檬酸钠

调节pH为7.0

18．100×Denhardt氏溶液：2%（w/v）BSA

2%（w/v）聚蔗糖

2%（w/v）聚乙烯吡咯烷酮

贮存于-20?。

19．10%SDS

20．预杂交液：6×SSC

5×Denhardt溶液

0.5%（m/v）SDS

1μg/ml Poly（A）

100μg/ml 鲑鱼精子DNA

50%（v/v）甲酰胺

21．标记探针

22．洗膜液A：2×SSC

0.5% SDS

23．洗膜液B：2×SSC

0.1% SDS

24．洗膜液C：0.1×SSC

0.1% SDS

25．酚:氯仿（1:1 v/v）

26．杂交液：在预杂交液中加入10%（w/v）硫酸葡聚糖。

27．抗地高辛溶液：2.5μl 抗地高辛抗体/碱性磷酸酶结合物

1 mol/L Tris-HCl（pH9.5）

1 mol/L MgCl2

5 mol/L NaCl

28．检测缓冲液：0.1 mol/L二乙醇胺

1 mmol/L MgCl 2

0.02%叠氮化钠

用浓HCl调节pH到10.0。

29．AMPPD溶液：在3μl检测缓冲液中加入6μl Tropix AMPPD。

30．脱色液：0.1 ×SSC

0.1% SDS

31．有关设备：电热板、电泳仪、电泳槽、长波紫外灯（365nm）、312nm紫外灯、尼龙杂交膜、杂交袋或杂交瓶

（二）样本制备

1．DNA提取 具体步骤见细胞内核酸的提取

2．DNA的限制性内切酶消化 DNA的限制性内切酶是从细菌中分离出来

的、在特定序列识别并切割双链DNA的蛋白酶，包括?类、?类和?类。分子

生物学中常用的是?类DNA限制性内切酶，识别并切割双链DNA的特定序列通常是4～6个核苷酸长度的短的回文结构，如AAGCTT（Hind ?）、GAATTC（Eco R?）、GAGCTC（Sac ?）等，不同的酶切割的结果有所不同：有些酶在

回文结构的对称点上同时切割DNA双链而产生平末端的DNA片段；另外一些酶则在回文结构对称点左右相应的位点同时切割两条链而形成粘末端的DNA片段。DNA的限制性内切酶的消化步骤如下。

（1）在冰水浴中混合下列反应成分于微量离心管中，组成DNA限制性内切酶酶切反应体系混合液：

酶切缓冲液 5μl

1 mg/ml的牛血清白蛋白 5μl

待切割的DNA 1μg

加灭菌蒸馏水至终体积为50μl，混匀，于4?放置1h，以确保DNA均匀分散。

（2）取出冷冻的限制性内切酶，待溶化后，用灭菌微量吸管迅速吸取5单位酶加入反应管中，在冰水浴中温和搅拌2min，再升至酶切反应所需的温度（大

多数酶的反应温度为37?，但有些酶的反应温度偏高或偏低，所以应以酶的产

品说明书提供的温度为准），保温1h（如果是基因组DNA，保温8～12h）。

（3）如果使用的限制性内切酶不只一种，消化20min后，加入第二份限制酶（5单位/μg DNA），重复步骤?。

（4）取2μl反应后的酶切样品，加上样液后电泳检查酶切是否完全。

3．琼脂糖凝胶电泳 选择不同浓度（0.2%～3%）的琼脂糖凝胶进行电泳，

电泳结束后于紫外灯下检测。

4．琼脂糖凝胶电泳的印记转移 探针与目的DNA片段的杂交所依附的支

持物可以是液相的也可以是固相的，常用的是固相支持物。在将电泳分离后的

DNA片段转印到固相支持物上之前，要对琼脂糖凝胶上的DNA片段进行适当处理，首先，将电泳后的DNA片段在紫外灯下与marker进行对比，看目的DNA片段是否较长（＞15kb），大片段的DNA转移较慢且效率较低，可以用弱酸进

行脱嘌呤处理，以水解DNA成较小片段来增加转印效率，通常脱嘌呤处理应在

弱酸环境下作用到溴酚蓝变成黄色或二甲苯青变成黄绿色，水解后的DNA片段长度以为原来长度的三分之一左右为宜，过短的DNA片段在印记转移过程中容

易丢失和扩散，扩散将使检测观察到的DNA条带模糊。其次，要对双链DNA进行变性处理。这些处理工作完成后将琼脂糖凝胶上的DNA片段以适当的方法转移到固相支持物上以备杂交。

将电泳分离后的DNA片段转移到固相支持物是印记杂交的关键步骤，目前，

常用的转移方法有五种：液流向上的毛细管转移法、液流向下的毛细管转移法、

上下同时向两张膜转移法、电转移法和真空转移法。

最初所选用的固相支持物是硝酸纤维素膜，核酸通过疏水相互作用与硝酸纤

维素膜结合，牢固程度较差，在碱性条件下的结合能力进一步下降，且这种膜质

地较脆，操作时需格外小心。目前核酸杂交实验多采用尼龙膜，尼龙膜坚固耐用，

可进行多次杂交；而且核酸可在低离子强度下结合到尼龙膜上，可用电转移法将

DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶上转移到尼龙膜上，极大提高了转移效率，在紫外

线照射下，核酸可与尼龙膜发生共价结合而被固定。另外，带电荷的尼龙膜结合

核酸的能力更强，且带正电荷的尼龙膜在碱性转移缓冲液中可与核酸共价结合，

转移后不需进行固定。。

以毛细管转移法介绍印记转移的操作过程：?将修整后的凝胶浸泡于脱嘌呤

缓冲液中直至溴酚蓝变为黄色；?弃掉脱嘌呤缓冲液，用去离子水冲洗凝胶数次；

?将胶浸入变性缓冲液，室温轻摇40min；?弃掉变性缓冲液，用去离子水冲洗

凝胶一次；?将胶放置在毛细管转移装置上，DNA片段转移需16小时；?将胶从转移装置上取下，在杂交膜上对应于点样孔位置作适当记号；?用2×SSC缓冲液淋洗杂交膜数秒；?将杂交膜放入烘箱，80?烘烤50min；?将杂交膜不含DNA的一面朝向312nm紫外灯照射3min以固定DNA。

（三）探针

任选探针制备中所提供的方法制备放射性标记的或非放射性标记的探针。

（四）杂交

杂交的目的是以带有标记物的探针去对目的核酸进行定性、定位检测，而探

针与目的核酸的准确复性是影响杂交实验的关键所在，所以，杂交环境及用于进

行杂交的探针的特异性和纯度对于确保杂交实验的成功就显得尤为重要。

杂交步骤包括：?于杂交管中用6×SSC洗膜，之后加入10ml预杂交液，65?摇动4h；?探针于沸水中变性5min，变性后的探针与10ml（65?）混合；?弃去预杂交液，加入含有探针的杂交液，42?摇动过夜；?杂交结束后，将膜取出，

放入含有数百毫升洗膜液A的器皿中，轻轻震荡洗膜5min，此时勿使膜干燥！?如果探针是被放射性物质标记的，应将洗膜后的废液倒入处理放射性污染的废

液缸中；?向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液B，轻轻震荡洗膜15min，洗后弃去洗膜液；?向洗膜的器皿中加入数百毫升的洗膜液C，65?轻轻震荡2h；

?将膜取出，用聚乙烯膜（或袋）包好，勿使膜干燥；?如使用的是放射性探针，

应立即进行放射自显影；?放射自显影结束后，洗去第一个探针后，还可与第二

个探针杂交。

（五）杂交后标记探针的检测

对于带有不同标记的探针，可以有不同的检测方法。如果使用的是放射性探

针，则采用放射自显影使X光胶片曝光而加以显示；如采用的是非放射性物质

（生物素或地高辛）标记的探针，则是先以偶联有报道酶（常用碱性磷酸酶或辣

根过氧化物酶）的可与非放射性标记物特异结合的配基（链亲和素或抗地高辛抗

体）与对应的非放射性标记物（生物素或地高辛）发生特异结合，然后或是利用

某些物质可与报道酶发生颜色反应而间接地对靶核酸加以显示，或是利用某些物

质可与报道酶发生化学发光反应而得以对目的核酸加以检测。

显色反应中常用的报道酶是碱性磷酸酶。化学发光反应中使用的报道酶既可

以是辣根过氧化物酶（HRP）又可以是碱性磷酸酶。

1．放射性同位素标记探针的检测步骤 这些步骤包括：?用放射性标记的

探针与膜杂交，杂交完成后，洗膜，用吸水纸吸去大部分膜上的水；?将潮湿的

膜用Saran膜包好，放在增感屏内，于－70?用X-光胶片曝光24h（检测哺乳动物基因组中的单拷贝序列曝光2h左右）。

2．非放射性标记探针的化学发光法检测步骤 报道酶既可以是碱性磷酸酶也可以是辣根过氧化物酶。如果是辣根过氧化物酶（HRP），则应用HRP-鲁米诺检测系统；如果应用碱性磷酸酶，则应用碱性磷酸酶-AMPPD检测系统。以下介绍一个以地高辛作为非放射性标记物，报道酶为碱性磷酸酶，发光底物为AMPPD的检测系统的操作步骤：?用含有地高辛标记的探针与杂交膜预杂交、杂交和洗

膜；?将与地高辛标记的探针杂交后的杂交膜浸入含有200ml抗地高辛溶液的容器中，室温，30min；?将膜浸泡于检测缓冲液中，室温，10min；?将膜放置于一块与X-光胶片盒大小一致的有机玻璃板上，并放在X-光胶片盒上；?小心地向膜上加AMPPD溶液，之后用Saran膜包好以防干燥；?曝光于37?，3h（或室温过夜）；?用脱色液洗涤10min；?用TE冲洗，空气干燥后贮存。

四、注意事项

Southern杂交的注意事项包括以下几个方面。

1．限制性内切酶的选择时应注意酶切位点的量要适当，不宜过多，也不应

过少，一般消化前DNA的长度至少应为消化后长度的三倍。

2．酶切反应体系中不应含有氯仿、酚、乙醇、去污剂等成分，以免造成内

切酶的失活。

3．操作过程中，应在冰盒中进行，并且迅速，以免造成对酶的活性造成影

响（内切酶最好应事先分装）。

4．高分子量DNA的消化过程中，为避免消化不均匀，应加入限制酶缓冲

液对DNA进行稀释。

5．消化过程中应设置若干对照，随时检查消化是否彻底。

6．消化后应用乙醇沉淀浓缩DNA片段，并用溴化乙锭测定DNA消化后的浓度。

7．消化后置于4?贮存的DNA，上样前应于56?加热3分钟以破坏粘性末端的连接。

8．对于酶切获得的较大的DNA片段（＞100kb），上样前应与上样液充分混匀，以免上样时DNA漂浮而造成丢失。

9．根据经验，DNA片段大于5kb的电泳，电场强度为5V/cm时，可获得最佳分辨率；DNA片段小于1kb的电泳，电场强度为10V/cm时，可获得最佳分辨率。

10．电泳后的凝胶放置不应超过24小时，以免DNA条带扩散。

11．操作时，不能用手直接接触杂交膜，以免造成背景升高；膜一旦放置于

凝胶上后，就不可再移动膜。

12．预杂交时封闭要完全，以免背景升高。

13．不能使用已发生沉淀的SDS，以免造成背景升高。

14．如果目的DNA片段长度大于15kb，则转印前应进行脱嘌呤处理，以产

生较小的DNA片段以促进转印。

15．印记转移时，滤纸和杂交膜应完全湿润，并且凝胶与滤纸及凝胶与杂交

膜之间不能有气泡，以免影响转印效果。

16．以紫外交联进行固定时，照射剂量过大或过小都是不合适的，过大的剂

2量（湿膜＞1.5J/cm）将导致胸腺嘧啶与膜之间形成过多的共价键而影响杂交；

过小的剂量将使交联不牢固。

17．不马上杂交的膜应在室温下真空保存。

18．双链探针杂交前要变性。

19．杂交液中最好不添加硫酸葡聚糖，以免增加背景。

20．甲酰胺如果颜色发黄则不能使用，以免增加背景。

21．杂交洗膜过程中不可使膜干燥。

22．对放射性标记的探针的检测，放射自显影时间不应超过4小时。

第三节 Northern杂交技术

人们相对应于研究DNA的Southern杂交技术而将研究RNA的印记转移和杂交技术称之为Northern杂交技术。

一、Northern杂交的一般程序

Northern杂交分析RNA的基本步骤是：首先，从组织或细胞中分离总RNA；接下来根据RNA的大小，通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离；再将RNA转移到固相支持物上并通过紫外线交联将其固定在支持物上；再用含有标记物的探

针与固定后的RNA杂交；之后，除去非特异结合到固相支持物上的探针分子；

最后，对特异结合的探针分子的图象进行检测、捕获和分析。

二、Northern杂交的实验步骤

（一）材料与设备

1．PBS：0.137 mol/L NaCl

2.68 mmol/L KCl

HPO 7.89 mmol/L Na24

1.47 mmol/L KHPO(pH 7.2) 24

2．RNA沉淀液：1.2 mol/L NaCl

0.8 mol/L 柠檬酸二钠盐?15HO 2

3．5 mol/L NaCl：加2滴DEPC，高压灭菌（高压灭菌后的DEPC分解为乙醇、HO和CO）。 22

4．50 mmol/L醋酸钠：加2滴（DEPC），高压灭菌。

5．oligo（dT）- 纤维素

6．2×装柱缓冲液：40 mmol/L Tris-Cl（pH7.6）

1 mmol/L NaCl

2 mmol/L EDTA(pH8.0)

0.2%(m/v)月桂基肌氨酸钠

以上四种溶液中，前三种均以0.1%的DEPC水配制，高压灭菌，冷却到65?

时，加入65?含DEPC的水配制月桂基肌氨酸钠母液。

7．洗脱缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl（pH7.6）

1 mmol/L EDTA (pH8.0)

0.05%SDS

8．乙醇

9．10 mol/L NaOH（DEPC处理的无菌水配制）

10．200μg/ml溴化乙锭：用DEPC处理过的水配制。

11．10×甲醛凝胶电泳缓冲液：50%甘油（由DEPC处理过的水配制）

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

0.25%（m/v）溴酚蓝

0.25%（m/v）二甲苯腈蓝乙酸

12．10×MOPS电泳缓冲液：0.2 mol/L MOPS（pH7.0）

20 mmol/L乙酸钠

10 mmol/L EDTA（pH8.0）

均用经DEPC处理过的水配制。

13．甲酰胺

14．0.1mol/L乙酸胺

15．转移缓冲液：碱性转移缓冲液：0.01 mol/L NaOH

3 mol/L NaCl

中性转移缓冲液：20×SSC

16．预杂交缓冲液：0.5 mol/L 磷酸钠（pH7.2）

7%（m/v）SDS

1 mmol/L EDTA（pH7.0）

17．杂交缓冲液：0.25 mol/L 磷酸钠（pH7.2）

7%（m/v）SDS

0.25 mol/L NaCl

50%甲酰胺

18．2×SSC

19．0.1×SSC

20．0.5%SDS

（二）样本制备

1．RNA的提取 具体步骤见细胞内核酸的提取

+ RNA的分离 从真核细胞中分离出来的总RNA中，在mRNA2．Poly（A）

的结构中，由于在3′端具有特殊的Poly（A）尾巴，所以，可用oligo（dT）-纤维素亲和层析法从总RNA中分离出mRNA。而实践证明，柱层析也是从哺乳动

+物细胞提取的总RNA中纯化大量（＞25μg）Poly（A）RNA的较好的方法。具体步骤如下。

（1）称取1.0g oligo（dT）- 纤维素，用0.1 mol/L NaOH重悬后灌注经DEPC处理过的柱子，并用3 ml 经DEPC处理过的水洗柱子。

（2）用1×装柱缓冲液洗柱子至流出液Ph达到8.0。

（3）用无菌去离子水溶解RNA，60?加热10分钟并加等体积的2×装柱缓冲液后加到柱上，收集流出液；于60?加热10分钟后重新加到柱之上，并收集；

再收集并加装于柱上，总共三次。

（4）加入3倍柱体积的洗脱缓冲液洗柱子，收集流出液（每管1ml，收集全部流出液），逐管于260nm处测吸光值（以1×装柱缓冲液作空白对照，以

40μg/ml=1为标准）来判断哪管含有RNA，混合含有RNA的收集液。

3．琼脂糖凝胶电泳 虽然RNA分子通常是单链的，但是，由于存在链内

互补序列，RNA分子往往自身折叠形成局部双链。所以，电泳前也应对RNA样品做变性处理，变性剂常使用甲醛、甲酰胺等构成的MOPS缓冲体系。RNA样品经过甲醛处理使之变性，并在含有甲醛的变性琼脂糖凝胶上进行大小电泳分离

后，变性琼脂糖凝胶会变脆，转印操作时应小心。另外，在电泳的同时，于变孔

中应加入判断分子质量的标记物（marker），但也可利用真核生物的rRNA作为

分子质量的标记物。真核生物细胞提取的总RNA中80%～85%是rRNA（28SrRNA、18SrRNA、5.8SrRNA和5SrRNA），这四种RNA可作为标记用以判断RNA的分子量或RNA是否遭降解。在大部分变性琼脂糖凝胶电泳系统中，

溴酚蓝迁移速度比5SrRNA稍快，而二甲苯腈蓝的迁移比18SrRNA稍慢，哺乳动物的18SrRNA的大小范围界于1.8kb～2.0kb之间，28SrRNA的大小范围界于4.6kb～5.3kb之间。电泳步骤如下。

O（1）带上手套，彻底清洗用于RNA电泳的电泳槽和梳子，并用3%的H22在室温下浸泡10分钟，最后用0.1%DEPC处理过的水再彻底洗涤电泳槽和梳子；

用1×MOPS电泳缓冲液配制含有2.2 mol/L甲醛的1.5%的琼脂糖凝胶并灌制凝胶。

（2）在一新的微量离心管中加入以下成分组成反应体系：RNA〔2.0μl（10μg/μl）〕、10×MOPS电泳缓冲液（2.0μl）、甲醛（4.0μl）、甲酰胺（10.0μl）、溴化乙锭（1.0μl）。盖紧盖子，于55?温育反应体系1小时；温育结束后，将反应管置于冰水混合液中10min，离心5秒。

（3）将反应管置于冰水混合液中，并向管中加入2μl 10×甲醛凝胶电泳缓冲液。

（4）加1×MOPS电泳缓冲液于电泳槽中，加RNA样本于凝胶上样孔中（于边孔加marker），在以5V/cm（电极间长度）电压电泳4小时（至溴酚蓝移出），电泳过程中每隔1小时换一次电泳液。

（5）紫外线检查电泳结果。

4．琼脂糖凝胶电泳的印记转移和RNA固定 将RNA印记转移到固相支持物上也是Northern杂交所必需的。转移到尼龙膜上的RNA经紫外照射以共价键交联于膜上后可反复杂交。这为研究不同基因表达的多种RNA提供了一个便捷的途径，人们每次可以使用不同的探针与膜杂交，这对于RNA材料较难获得或必需使用少量RNA的研究是很可贵的。

（1）安装印记装置，并将修整后的凝胶带孔的一面向下，放于湿的滤纸上，

注意不要在胶和滤纸之间产生气泡。

（2）用转移缓冲液湿润胶，在胶上放置湿润的尼龙膜，胶与膜之间不应存

在气泡（以玻棒赶走气泡）。

（3）将6cm厚的滤纸、吸水纸和玻璃板及重500g左右的重物放于胶上。

（4）上行的RNA印记转移：在中性转移缓冲液中的转移时间应少于4小时；在碱性转移缓冲液中的转移时间为1小时。

（5）转移完毕后，在膜上对应于胶孔的位置用圆珠笔做好标记，将膜移至

含有6×SSC的玻璃皿中，23?，轻摇5分钟。

（6）将膜取出，尽量沥干液体，将膜放于干滤纸上，在波长254nm下照射5分钟以固定RNA于膜上；照射后，将膜放于两张滤纸间于80?下干烤60分钟。

（三）探针

选择探针制备中所提供的方法制备所需的放射性标记的或非放射性标记的

探针。

（四）杂交

转移并固定到膜上的RNA样品，可以与特异的探针杂交，以判定感兴趣的

靶RNA的存在。

1．预杂交2小时。

2．取15ml杂交缓冲液与探针（探针为双链时则需变性）混合，如果是RNA探针，于65?杂交12小时（DNA探针的杂交温度为55?）。

3．杂交结束后，用2×SSC洗膜三次。

4．以0.1×SSC和0.5%SDS与膜在70?温浴1小时，反复三遍。

5．依探针标记物（放射性或非放射性）的不同，选择对应的检测方法。

（五）注意事项

1．如果有必要，可用不含RNA酶的DNA酶来彻底清除DNA，以免影响

+ 对Poly（A）RNA的分离速度。

2．洗脱液高压灭菌时会产生大量泡末，可先将Tris-Cl和 EDTA高压灭菌，再用DEPC处理过的水稀释。

3．一次性层析柱要用DEPC处理，并在300?下干烤灭菌4小时。

4．如果RNA总量较小（总RNA＜10mg），oligo（dT）-纤维素柱子的量应小于1ml。

5．如需再生oligo（dT）-纤维素柱子，可用NaOH、水、装柱缓冲液冲洗

即可。

6 电泳分离RNA时，如果RNA片段长度为1.5～8kb，使用1.4%的琼脂糖凝胶分离较理想。

7．凝胶上的Marker泳道，应在电泳结束后，马上切下染色。

8．用于杂交部分的RNA不能染色。

9．操作时，不能用手直接接触杂交膜，以免造成背景升高；膜一旦放置于

凝胶上后，就不可再移动膜。

10．预杂交时封闭要完全，以免背景升高。

11．不能使用已发生沉淀的SDS，以免造成背景升高。

12．转移前的变性时间不宜过长，以免造成RNA降解。

13．印记转移时，滤纸和杂交膜应完全湿润，并且凝胶与滤纸及凝胶与杂交

膜之间不能有气泡，以免影响转印效果。

14．紫外交联过程中，紫外光的剂量要适中，不宜过大或过小。

15．双链探针杂交前要变性。

16．操作过程中，避免膜干燥。

第四节 斑点杂交狭缝杂交技术

一、斑点杂交和狭线杂交的概念

Kafatos等人于1979报道了将几种未经分离的核酸样品点样于固相支持物

上，然后用特定探针与核酸杂交以检查靶核酸的存在的快速检测真核生物基因及

其差异表达的RNA产物的技术，因所点样品扩散形状的不同，就有了斑点杂交

和狭线杂交这两种名称。该技术简便、快速、灵敏，可迅速了解生物体某一基因

在不同发育阶段的差异表达情况，以了解该基因在生物发育过程中的作用。但应

用该技术对DNA或RNA的检测结果的稳定性较Southern杂交或Northern杂交

稍差。

二、杂交的一般程序

获得粗提的或纯化的DNA或RNA（纯化的核酸实验重复效果好），采用真

空加样法将核酸以斑点或狭线形式点样于尼龙膜而得到大小、形状、间距一致的

样品点，以紫外交联、烘烤或微波照射将核酸固定于膜上，用特异性的探针与核

酸杂交并检测靶核酸的存在。

三、杂交的实验步骤

（一）材料与设备

1．20×SSC

2．RNA变性液：660μl 甲酰胺

210μl 37%（m/v）甲醛

130μl 10×MOPS电泳缓冲液

3．预杂交液：0.5 mol/L 磷酸钠（pH7.2）

7%（m/v）SDS

1 mmol/L EDTA（pH7.0）

4．杂交液：0.25 mol/L 磷酸钠（pH7.2）

7%（m/v）SDS

0.25 mol/L NaCl

50%甲酰胺

（二）实验步骤

1．依说明安装印记装置。

2．将溶于10μl水中的RNA样品与30μl的RNA变性液混合于微量离心管中，65?温浴5分钟。

3．在冰盒中将温浴后的RNA与40μl的20×SSC混合；同时以10×SSC湿

润尼龙膜。

4．以真空装置点样（约5μg RNA/次）于膜上并吸干膜。

5．在波长254nm的紫外线下照射5分钟以固定RNA于膜上

6．加入杂交液68?预杂交2小时。

7．弃去预杂交液，把探针与68?预热的杂交液混合，将膜浸入含有探针的

杂交液中，68?温浴16小时。

8．取出杂交膜，放入含有0.1%SDS 的1×SSC的塑料袋内并封口，于室温下轻摇10分钟。

9．取出杂交膜，放入预热到68?的含有0.1%SDS的0.5×SSC的塑料袋内

并封口，于68?下轻摇10分钟。重复该步骤两次。

10．取出杂交膜，用滤纸吸干，依探针标记物（放射性或非放射性）的不同，

选择对应的检测方法进行检测。

（三）注意事项

1．操作时，不能用手直接接触杂交膜，以免造成背景升高。

2．双链探针杂交前要变性。

3．操作过程中，避免膜干燥。

4．有必要的话，可做Southern或Northern对照。

（山东中医药大学 李兰）

范文五：细胞的遗传物质

第二篇 细胞的遗传物质

第三章 基因表达的分析技术

生物性状的表现均是通过基因表达调控实现的。对基因结构与基因表达调控

进行研究，是揭示生命本质的必经之路。在基因组研究的过程中，逐步建立起一

系列行之有效的技术。针对不同的研究内容，可建立不同的研究路线。

第一节 PCR技术

聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是一种体外核酸扩增

技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。。PCR技术日斟完善，成为分子生物学和分子遗传学研究的最重要的技术。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段

可以直接通过电泳观察，并作进一步的分析。

一、实验原理

PCR是根据DNA变性复性的原理，通过特异性引物，完成特异片段扩增。

第一，按照欲检测的DNA的5＇和3＇端的碱基顺序各合成一段长约18～24个碱基的寡核苷酸序列作为引物（primer）。引物设计需要根据以下原则：?引物

的长度保持在18～24bp之间，引物过短将影响产物的特异性，而引物过长将影

响产物的合成效率；?GC含量应保持在45～60%之间；?5＇和3＇端的引物间不能形成互补。第二，将待检测的DNA变性后，加入四种单核苷酸（dNTP）、引物和耐热DNA聚合酶以及缓冲液。通过95?变性，在进入较低的温度使引物

与待扩增的DNA链复性结合，然后在聚合酶的作用下，体系中的脱氧核苷酸与

模板DNA链互补配对，不断延伸合成新互补链，最终使一条DNA双链合成为两条双链。通过变性（92～95?）?复性（40～60?）?引物延伸（65～72?）的顺序循环20至40个周期，就可以得到大量的DNA片段。理论上循环20周期可使DNA扩增100余万倍。

二、PCR技术的分类及其应用范围

1．逆转录PCR 逆转录PCR（RT-PCR）是将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中，用于逆转录的RNA模板要求完整，并且不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。

2．原位PCR 原位PCR技术（in situ PCR）是将检测细胞内特定基因的原

位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞

内微量的基因，并将其检测出来的技术。

3．甲基化PCR 甲基化PCR与常规PCR在原理上一致，但在引物的设计

以及DNA样本的处理上有所不同。针对扩增的DNA甲基化区域，一般需要设

计三条引物：正常序列引物、甲基化对应引物以及DNA序列修饰引物。通过三

组PCR，判断DNA序列中甲基化的存在与否。

4．实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR（real time quantitative PCR）是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR需要荧光探针参与，常用的探针可

分为以下几类：1）内掺式染料SYBRGreen I；2）序列特异性探针：Taqman， Molecular Beacons， Dual Probes； 3）特异性引物： Amplifluor（Intergen）， Lux引物， Scorpion； 4）阴阳探针。

荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量，用于临床诊断，而且可以应用不同

的探针检测基因突变和SNP分析。

5．多重引物PCR 多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩

增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或

同一疾病的几个不同的基因突变。

6．随机引物PCR 多态DNA的随机扩增 （random amplication of

polymorphic DNA，RAPD）或随机引物PCR（arbitrarily primed PCR，AP PCR）是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物，通过PCR扩增产生一组代表种

或株特性的DNA片段。因此，RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通用方法。

7．套式PCR 又称巢式PCR，是对靶DNA片段设计两套引物系统，第1

套引物扩增15～30个循环，再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增15～30个循环，可使目的DNA序列得到高效扩增。套式引物PCR可减少引物的非特异性扩增，增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。

8．突变体构建PCR

（1）应用载体构建突变体的PCR：原理是将野生型目的基因的cDNA插入到克隆载体上，设计携带突变点的一对引物，对克隆载体进行扩增，然后将经过

PCR而获得的DNA转染感受态细胞，并用筛选培养基筛选转染的细胞，获得的

克隆可以通过细胞扩增，获得大量的携带突变体DNA的载体。

（2）应用内外引物构建突变体的PCR：载体构建突变体PCR是构建点突变的高效方法，但不适用于缺失、易位、倒位等突变方式。内外引物构建突变体

PCR可以克服载体构建突变体PCR的不足。其原理是合成两对引物，即一对扩

增整个cDNA的外引物和一对包含突变序列并部分互补的内引物。分别以一个

外引物与一个内引物进行PCR，可以获得两条DNA序列，该两条DNA在突变位点存在部分重合。去除引物，将两条DNA变性，而后进行复性，将可导致两

条DNA重合部分互补，并在Taq酶的作用下补齐3＇末端。用外引物扩增DNA，将获得含有突变的cDNA。

PCR引物的设计是PCR成功的关键，必须遵守以下原则：?确定扩增区域

及其长度；?确定引物的Ｔｍ值；?避免引物自身二聚体、引物间二聚体和发夹

结构等二级结构的形成；?具有扩增的特异性。

三、应用PCR技术检测性别决定基因

（一）实验原理

SRY基因又称睾丸决定基因（Testis determining factor），位于人类Y染色体，在X染色体上没有相应的同源节段。根据SRY基因序列合成一对特异性引物，

通过PCR反应检查患者有无此基因相应扩增片段，以及患者的表型可对患者的

真正性别和病因作出判断，另外对胎儿性别的产前诊断有利于防止性连锁遗传病

患儿的出生。

（二）实验准备

1. 材料 人体静脉血、注射器、微量加样器及吸头、1.5ml及0.5ml Eppendorf管。引物序列：（SRY1：5′-GATCAGCAAGCAGCTGGGATACCAGTG-3′；SRY2：

5′-CTGTAGCGGTCCCGTTGCTGCGGTG-3′）

2. 试剂（实验中有关试剂和器材要进行高压灭菌处理）

EDTA ，pH 生理盐水、细胞裂解液（50mmol Tris-HCl，pH 8.0；1mmol Na28.0；0.5% SDS；0.1mmol NaCl）、10mg/ml蛋白酶K 、20%SDS 、水饱和酚(1mol/L Tris-HCl 抽提)、酚：氯仿：异戊醇（25?24?1）、氯仿：异戊醇（24?1）、8mol/L 醋酸钾、无水乙醇、70%乙醇、TE（pH8.0）（10 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；0.1 mmol/L NaEDTA，pH8.0）、10×buffer（500mmol/L KCl、100mmol/L Tris?HCl，pH8.3，2

室温15mmol/L MgCl；0.1% 明胶）、4×dNTP（1 mmol/LdATP，1 mmol/L dCTP，2

1 mmol/L dGTP，1 mmol/L dTTP）、Taq 酶（1U/μl）、引物溶液（10pmol/μl）、5×TBE缓冲液（1000ml）（54g Tris碱，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L EDTA，pH8.0）、DNA分子量标记、2%琼脂糖凝胶、载样缓冲液（100ml）（0.2%溴酚蓝，50%蔗糖，10mol/L NaOH 1,2滴）、10mg/ml溴化乙锭溶液（戴手套谨慎称取溴化乙锭约

200mg，放入棕色瓶中，加重蒸水20ml，溶解后置4?冰箱保存备用。使用时100ml琼脂糖凝胶中加5μl 10mg/ml 溴化乙锭溶液，终浓度为0.5μg/ml）。

3. 实验仪器 PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳

槽、紫外检测仪。

（三）实验步骤

1. DNA模板制备

方法?：取毛发1,2根，尽量剪碎，于15,20ml生理盐水中100?水浴10min，离心取上清备用。

方法?：外周血提取DNA

（1）白细胞的分离

?抗凝血用1～2倍的生理盐水或磷酸缓冲的生理盐水（PBS）稀释并混合。

?在50ml离心管中加入1倍体积淋巴细胞分离液（上海试剂二厂），在上面

仔细铺一层2倍体积已稀释的血液。

?室温以2000rpm离心15min～20min，红细胞应沉于管底，而白色的淋巴

细胞应分布于上层血浆与下层淋巴细胞分离液的界面。

?吸弃血浆，小心吸取淋巴细胞层，直至把淋巴细胞转移完全。

?用生理盐水或PBS洗淋巴细胞二次。

?最后得到的淋巴细胞沉淀，可立即用于DNA的提取，或冻存于超低温冰

箱中，直至使用。

（2）DNA的提取（见本篇第一章）。

2. PCR反应体系配制及扩增

（1）PCR反应总体积50μl，取一洁净的0.5ml Eppendorf管，依次加入：

10×buffer 5μl

dNTP 5μl

引物1 2.5μl

引物2 2.5μl

模板DNA 10μl

Taq DNA 2U

dHO 补足50μl 32

（2）将反应管放入PCR扩增仪上进行聚合酶链反应，条件为94?变性10min后，94? 45s、55? 45s、72? 90s共30个循环；最末一个循环紧接72?再延伸10min。

3. 扩增产物电泳检测

取PCR扩增产物10μl与2μl上样缓冲液混合后，与DNA Marker同时进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结束，取出凝胶置于紫外检测仪上观察。

（四）注意事项

1. 实验过程应设阴性及阳性模板对照。

2. PCR常见问题及解决办法

（1）没有得到预期的PCR扩增产物：?确证聚合酶的活性是否正常；?

DNA解链是否充分，变性温度是否准确；?引物组成是否正确，有无二级结构

组成；?反应系统有无蛋白酶或核酸酶存在，使聚合酶或模板及产物降解。

（2）有非特异性扩增产物出现：?增加复性温度，缩短复性时间及延伸时

2+间；?降低引物和Taq DNA聚合酶的用量；?调整Mg浓度；?减少热循环次数。

（3）形成了引物二聚体：?检查引物的序列，特别是3′端是否有互补区；

?增加引物的长度；?调整引物与模板浓度，使模板比例增高，降低引物使用浓

度；?增加复性温度；?减少热循环次数。

（4）PCR产物在凝胶电泳中成片状：?减少Taq DNA聚合酶的用量；?增

2+浓度；?减少循环次数；加复性温度，减少复性时间及延伸时间；?降低Mg

?从凝胶中回收与预期分子量相同的DNA，再次进行PCR反应。

3. 实验安全

溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上

手套，这些溶液经使用后，应进行净化处理。

第二节 单链构象多态性（SSCP）分析

单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）分析是利用DNA或RNA单链构象具有多态性的特点，结合PCR进行基因检测的一种分析技术，称为PCR-SSCP技术。其基本原理为：DNA或cDNA在变性后，由于序列的不同而导致单链DNA的空间结构各异。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

的过程中，不同空间结构的单链DNA迁移率存在差异。因此，PCR-SSCP可以用来鉴定单核苷酸的差异。该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、

遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

PCR-SSCP的敏感性随核苷酸片段长度的增加而降低，在检测200个核苷酸片段中单个碱基的突变时，检出率高达90%；而400个核苷酸片段单个碱基突变的检出率为80%。因而，在实验中要将大片段分成较短的片段。哺乳动物基因组

中的外显子一般小于300个碱基，可以使用内含子引物直接对目的片段进行

PCR-SSCP。

PCR-SSCP技术的基本程序

PCR-SSCP技术的基本程序为：首先PCR扩增特定靶序列，然后将扩增产

物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰

胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的是取

决于DNA单链所形成的构象。在非变性条件下，DNA单链可自身折叠形成具有一定空间结构的构象。这种构象由DNA单链碱基决定，其稳定性靠分子内局部

顺序的相互作用（主要为氢键）来维持。相同长度的DNA单链其顺序不同，甚

至单个碱基不同，所形成的构象不同，电泳迁移率也不同。PCR产物变性后，单链产物经中性聚丙烯酰胺凝胶电泳，靶DNA中含单碱基置换，或数个碱基插

入或缺失等改变时，因迁移率变化会出现泳动变位，从而可将变异DNA与正常DNA区分开。由此可见，PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变

化来检测基因变异。

二、实验准备

（一）试剂

甲酰胺加样缓冲液（95%甲酰胺，20mmoL/L EDTA，0.05%溴酚蓝和0.05%二甲苯青）、6%丙烯酰胺（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺=49?1）、10%甘油、0.5×TBE、10%醋酸、2%硝酸银、显影液（3%无水碳酸钠，0.2%甲醛，0.02%硫代硫酸钠）、去离子水

（二）实验仪器

PCR扩增仪、超净工作台、高速台式离心机、电泳仪及电泳槽、紫外检测

仪。

三、实验步骤

1．目的片段的PCR及其产物的变性 根据扩增的目的片段制定PCR扩增条件。PCR扩增结束后，用5倍体积的甲酰胺加样缓冲液混合。将样品于95?变性5min并直接置于冰浴上。

2．电泳 电泳胶有两种：?聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺、10%甘油和0.5×TBE组成。上样5μl，在室温下0.5W/cm，用0.5×TBE电极缓冲液电泳2.5h以上；?聚丙烯酰胺凝胶由6%丙烯酰胺和0.5×TBE组成。上样5μl，在4?下0.5 W/cm，用0.5×TBE电极缓冲液电泳2.5h以上。

3．染色 取下凝胶，置10%醋酸固定液中30min，再以去离子水漂洗3次（2min/次），加入2%硝酸银染液染色20min后，去离子水洗胶20s，凝胶置显影液中显色5～10min，以10%醋酸终止反应，漂洗及分析结果。

4．结果判读 SSCP结果判读的标准是正常个体由于等位基因相同，仅存在

两条单链，因此在凝胶上多出现两条带，有时由于两条链接近可形成一条带，或

一条单链有两种空间结构可形成三条带；突变个体由于等位基因不同，可以形成

四种不同的单链，因此在凝胶上多出现四条带，有时也可形成五条带。如果存在

复杂突变，可以形成超过5条的带纹（图2-3-1）。

图2-3-1 SSCP结果图（1为未变性的PCR产物;2、4、6、8、9为正常个体；3、5、7

为突变携带者）

四、注意事项

1. 核酸片段的大小是决定检测敏感性的首要因素： 用于SSCP分析的核酸片段越小，检测的敏感性越高。对于大于400bp的PCR产物可采用以下两种策

略进一步处理：?用限制性内切酶对PCR产物进行消化，产生较小片段；?通

过改变引物的位置和增加PCR扩增次数，缩短PCR产物。

2. 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是影响检测敏感性的另一个重要的因素：一

般情况下，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为49?1。可以选用10%甘油在室温或无甘油在4?条件下进行电泳。

3. 游离引物：游离引物可能同 PCR产物结合而改变其泳动率，即使游离引

物量为6nM都有明显影响。因此，应尽可能除去游离引物。可以采用不对称引

物扩增方法，尽可能消耗多余的引物。也可以运用过柱或磁性球方法纯化PCR产物。或者是稀释PCR产物，减少游离引物的干扰。

4. 低浓度变性剂：凝胶中加入低浓度的变性剂，如5％～10％甘油、5％尿素或甲酸胺、10％二甲亚砜（DMSO）或蔗糖等有助于提高敏感性，可能是因为

轻微改变单链DNA的构象，增加分子的表面积，降低单链DNA的泳动率。但有些变异序列却只能在没有甘油的凝胶中被检出。因此，对同一序列使用2～3种条件做SSCP，可能提高敏感性。

5. 电泳温度：一般认为保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关键的因素，温度有可能直接影响DNA分子内部稳定力的形成及其所决定的单链构象，从而影

响突变的检出。室温下电泳适于大多数情况，但由于在电泳时温度会升高，为确

保电泳温度相对恒定，应采取以下措施：减少凝胶厚度，降低电压，有效的空气

冷却或循环水冷却等。

6. 凝胶的长度： 可用测序板进行SSCP分析，凝胶板长度在40cm以上。

7. 凝胶浓度及厚度： 凝胶浓度很重要，一般使用5％～8％的凝胶，凝胶浓度不同，突变带的相对位置也不相同，如果在进行未知突变种类的SSCP分析时，

最好采用两种以上凝胶浓度，这样可以提高突变种类的检出率。凝胶的厚度对

SSCP分析也很重要，凝胶越厚，背景越深，在上样量较多的前提下，尽量使凝

胶越薄越好。

8. 假阴性：一般认为，如没有污染，PCR－SSCP分析不存在假阳性结果，但可能出现假阴性结果，后者是由于点突变引起的空间构象变化甚微，迁移率相

差无几所致，尤其是点突变发生在扩增片段的两端时。如果有阳性和阴性对照，

结果可以重复确定的突变带是可信的，如果没有阳性对照，应经测序来确定其是

否为突变带。由于PCR－SSCP的不足之处主要是可能检出假阴性结果。应通过

设置阳性对照，摸索电泳条件，假阴性结果在很大程度上是可以避免的。但对未

知基因变异的检测，假阴性结果就难以百分之百地消除。

9. 结果分析：单链凝胶电泳时，互补单链迁移率不同，一般形成两条单链

带。PCR产物进行单链凝胶电泳之前，通过加热变性产生单链。如变性不彻底，

残留双链亦可形成一条带．因此，PCR－SSCP分析结果至少显示三条带。但是，由于一种DNA单链有时可形成两种或多种构象，检出三条或四条单链带就不足

为奇。

第三节 基因表达谱研究技术

人类基因组大约有30000个左右的结构基因，其中在任一细胞中表达的基因

仅占总数的15%。管家基因在任何生长发育阶段以及生理状态下均有所表达，而

奢侈基因的表达则有组织特异性、时空特异性以及调节特异性。两者同时决定了

包括发育与分化、内环境稳定(homeostans)、对逆境的反应、细胞周期调控、衰

老乃至程序化死亡等整个生命过程。基因表达的变化是调控生命活动过程的核心

机制。通过比较同一类或不同种类细胞在不同生理条件下或在不同生长发育阶段

的基因表达差异，可为分析生命活动过程提供重要信息。因此，基因的表达谱研

究是揭示细胞生长、细胞分化、组织器官建立以及细胞衰老死亡的重要方向。

研究基因表达谱的方法主要有基因表达系列分析、基因芯片技术、差异显示

PCR法以及消减杂交技术等（表2-3-1）。

表2-3-1 不同基因表达谱研究技术的比较

基因表达系列克隆、DNA测序 不需特殊设备、实验成本克隆步骤较多、基因片段有可能丢失、提供

分析 较低、测序效率较高、可信息有限。

获得新基因。

基因芯片 分子杂交 操作简便、不需测序。 实验费用高、需要特殊设备；存在假阳性和

假阴性；图象和数据分析工作量较大。 差异显示PCR 电泳、分子杂交、不需特殊设备、可展示所方法繁琐、假阳性高、片段短而靠近

PCR技术、DNA有基因、差异表达基因片mRNA3＇末端。

测序 段、可获得新基因。

代表性差异分克隆、PCR技术、mRNA需求少、特异性高 酶切连接步骤多、cDNA存在丢失现象、获析技术 分子杂交 得的片段是酶切片段。 抑制消减杂交PCR、克隆、测序 特异性高 低丰度cDNA存在丢失、不能合成全长技术 cDNA。

基于PCR的消分子杂交、PCR、设备要求不高、操作简研究经费高、不能同时展示所有的基因和差

减杂交技术 克隆、测序 便、可获得新基因。 异基因、存在一定的假阳性、需大量测序。

一、SAGE技术

（一）概述

基因表达系列分析（serial analysis of gene expression，SAGE）是由Velculescu等建立并用以分析基因组表达的方法，可以在未知目的基因的前提下，分析来自

一个细胞的全部转录本信息；对已知或未知基因表达进行定性和定量分析；假阳

性率低，可重复性强。

随着SAGE技术的日益成熟，在基因表达方面已经得到了广泛的使用。

（二）SAGE的原理

mRNA的3＇末端特定部位存在可以标识其特异性的标签（tag），其长度一般在10～14个核苷酸之间，检测tag可以获得该mRNA的表达信息。SAGE技术主要是基于以上原理，通过获得tag从而确定基因的表达情况。其次，分离获

得的tag可以通过串联连接克隆于载体上，以便测序，提高了分析效率。同时，

根据同一tag重复次数，可以判断转录本的表达水平。

SAGE技术包括以下几个步骤：?提取RNA，并将其与携带生物素标记的

oligodT混合，以mRNA为模板，经逆转录得到双链cDNA；?锚定酶(anchoringenzyme，AE) 酶切生物素标记的双链cDNA。锚定酶要求至少在每一

种转录本上有一个酶切位点，一般4碱基限制性内切酶能达到这种要求。Nia ?是一种广泛的限制性内切酶，平均每250bp就存在一个Nia ?识别位点CATG，因此是理想的SAGE锚定酶；?应用带有亲和素的磁珠分离生物素标记的

cDNA3′端酶解片段，获得mRNA polyA尾部与最近的酶切位点之间的片段；?

将分离得到的 cDNA酶切片段等分为A和B两部分，分别与设计好的两种连接

子A或B连接。连接后的DNA片段在3＇端包含有?S型内切酶（如BsmF ?）的识别位点；?用?S型内切酶（又称标签酶）消化以上步骤获得的连接产物，

并去除与磁珠相连的DNA片段。?S型内切酶的作用方式以标签酶BsmF ?为例，BsmF ?的识别和切割位点为5′-GGGAC（N）10?-3′/3′-CCCTG（N）14?-5′，因此产生连有接头的短cDNA片段，长为10碱基，即释放的cDNA标签，不同的标签酶获得的碱基数不同，如Fok I可以获得9碱基的标签；?利用Klenow片段或T4 DNA聚合酶消化产生的粘性末端，混合两个cDNA池的短cDNA片段，并连接成100bp的双标签（ditag）?以引物A和B通过PCR扩增双标签，扩增产物含有2个尾尾相接的标签(一个Ditag)，其侧翼有锚定酶切割位点；?

利用锚定酶酶切扩增产物，分离纯化以收集标签(Ditag)；? 将每30～50个双标签连接起来，并克隆到pZErO-1载体中，建立SAGE文库；?对插入到pZErO-1载体中的双标签序列进行测序，并利用相应的应用软件进行结果分析，确定原始

序列中每个标签序列、数目以及发生率。同时可以与NCBI的SAGEmap、GenBank以及EST公众数据库进行比对，找出标签与基因及EST之间的对应关系，对标

签进行定性（图2-3-2、2-3-）。

图 2-3-2 通过SAGE获得的DNA片段

图2-3-3 SAGE的测序图

（三）SAGE技术的应用

1．全基因组转录图谱的建立 早在1995年，Velculescu等选择BsmFI和Nia ?分别作为标签酶和锚定酶对胰腺组织中1000多个标签进行手工测序，发

现95%以上的标签能够代表唯一的转录物。2001年，Caron等将公众SAGE数据库的231万标签以及他们自己从神经母细胞瘤分离到的16万个标签按照组织来源分成12组，并经过计算，将这12组不同组织的标签与已做染色体定位的基

因进行比对，获得了可以反映基因表达丰度的全基因组转录图谱，并发现染色体

上存在高表达的基因簇区域（region of increased gene expression，RIDGE）。结果提示，基因组结构是高度有序的，一个典型的RIDGE在1CR（centiary）的染色体长度上通常含有6～30个基因，而低转录区域仅含有1～2个基因，例如在18号染色体上，目前发现有385个表达丰度较低的基因，而在大小相近的19号染色体上分布着一连串RIDGE，包含了937个基因。

2．在基因差异表达中的研究 在生物的基因组中存在两大类基因：管家基

因和奢侈基因。管家基因在不同组织来源的细胞中广泛表达，而奢侈基因的表达

具有组织特异性。研究组织特异性基因的表达是揭示细胞分化的基础。SAGE技术为基因差异表达的研究提供了有效的手段，在发育生物学以及肿瘤生物学中得

到了广泛的应用。

通过SAGE技术对病理状态和正常生理状态的组织进行基因表达谱比较研

究，可以发现疾病相关的标记基因。此外，SAGE技术也可应用于化学物质处理

细胞前后基因表达变化的研究。例如有学者研究了神经生长因子（NGF）、雌激素、细菌脂多糖（LPS）等对相映的细胞神经元、乳腺癌细胞以及单核细胞处理

前后基因表达差异，发现了与之相关的下游基因。

3．模式生物的研究 SAGE技术已经广泛地应用于其它模式生物的研究中。

Velculescue等在酵母上分离得到60633个SAGE标签，其中93%的标签可与4665个基因对应。Matsumura等从水稻秧苗中分离出10122个标签，其中23.1%可与已知的1367个cDNA、EST匹配。

二、差异显示技术

（一）概述

差异显示技术（differential display RT-PCR，DDRT-PCR）是1992年由Liang

和Pardee创立而用于研究基因表达差异的方法。其原理是：真核细胞

mRNA3′polyA上游的两个碱基MN（M=A/C/G，N=A/C/G/T）可以形成12种组合，以T7T12MN作为锚定引物与mRNA的polyA以及上游的两个碱基结合，

在反转录酶作用下进行总mRNA的反转录，将形成与引物匹配的十二类cDNA。在mRNA（cDNA）5′端设计带有荧光标记的随机引物，并结合锚定引物，对cDNA进行扩增。由于不同的mRNA（cDNA）其随机引物结合部位不同，因此PCR产物的大小和序列不同。经聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离cDNA扩增产物，用GenomyxSC荧光扫描系统检测2kb～300bp的DNA片段。从聚丙烯酰胺胶中回

收特异cDNA片段，经再次PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，并以Northern blot排除假阳性后，对目的片段进行克隆。获得的cDNA可以制备为探针，从cDNA 文库或基因组文库中筛选全长cDNA或全基因序列。

差异显示技术在基因表达研究中具有以下优势：?实验要求的mRNA样品量较少；?DDRT-PCR技术包含PCR扩增过程，因此能够用于检测组织或细胞

中极低丰度表达mRNA样品的差异表达；?可以将两种或两种以上特定组织样

品来源的扩增产物放在同一块凝胶上鉴定，因此保证了测定的一致性，因此可以

用于鉴定不同来源组织或细胞转录水平mRNA的定性和定量变化。然而，差异

显示技术也存在以下主要缺陷：?假阳性较高，引起假阳性的因素有：DNA污染、差异cDNA条带可能包含多种产物、某些cDNA片段较小等；?cDNA产物的质量较低，在序列胶中表现为条带不清晰；?由于随机引物与模板匹配不适，

引起扩增产物产率较低。

改善DDRT-PCR合成体系是提高其应用的基础。引物的合理设计是降低差异

显示技术缺陷的重要手段。

RNA的质量是决定DDRT-PCR成功的另一个决定因素，实验要求：?RNA保持完整性；?OD260与OD280的比值在2左右；?RNA应无DNA污染，可以通过应用无RNase的DNase除去提取物中残存的DNA分子，也可通过oligo（dT）层析法分离纯化具有polyA尾部的RNA分子。

（二）实验操作的具体步骤

1．实验操作步骤

（1）总RNA的制备：按试剂盒提供的方法或按《分子克隆试验指南》提

供的方法提取总RNA，以RNase free DNase I（终浓度80 000U/L)降解其中污染的DNA，经甲醛变性凝胶电泳鉴定其完整性，并以紫外分光光度仪检测其纯度。

（2）逆转录反应：选择锚定引物T7（dT12）AP对总RNA进行逆转录反应，反应体系如下:总RNA10μg，引物4pmol，70 ? 5 min，置于冰上3 min，加

，10mmol/L DTT，入50mmol/L Tris-HCl(PH 8.3)，75mmol/L KCl，3mmol/L MgCl225μmol/L dNTPmix (1:1:1:1)，SuperScript ? 60U，总反应体系20μl。42 ? 5 min，50 ? 50 min，70 ? 15 min。

（3）荧光标记差异PCR：选取带有荧光标记的锚定引物TMR T7（dT12）AP和任意一个随机引物对逆转录产物进行PCR反应。反应体系包括：20mmol/L Tris-HCl(PH 8.4)，50mmol/L KCl，3.75mmol/L MgCl，逆转录产物3.0μl，50μmol/L 2

dNTPmix (1:1:1:1)，0.35μmol/L 5′随机引物，0.35μmol/L 3′锚定引物，AmpliTaq 0.5 U，总反应体系10μl。95 ? 2min；94 ?15 s，50 ? 30 s，72 ? 90 s，4个循环；94 ? 15 s，60 ? 30 s，72 ? 90 s, 25个循环；72 ? 延伸7min。

（4）分离差异显示片段：配置5.6%变性聚丙烯酰胺胶，胶厚0.25mm，大小61×33cm。将取PCR产物10μl与10μl上样缓冲液混合，95? 变性后上样。3000V、100W、55?电泳4.5h。制成干胶，在GenomyxSC上扫描，用AcquireSC program软件分析扫描结果。

（5）回收差异条带：确定差异条带位置，用一次性手术刀片切割下所需条

带，置于30μl去离子水中，37?水浴30～60min，备用。

（6）差异条带的再扩增：以回收条带为模板，用Ｔ7启动子锚定引物T7（dT12）AP 和随机引物对模板进行再扩增反应：模板2.0μl，20mmol/L Tris-HCl(pH 8.4)，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl，20μmol/L dNTPmix (1:1:1:1)，2

0.2 μmol/L 的引物，10U AmpliTaq，总反应体系20μl。反应条件同差异显示PCR。

三、基因芯片技术

基因芯片是生物芯片的一种，由分子生物学、微电子学和计算机科学等多种

学科相互交融而形成的新技术。其为基因表达谱的研究、新基因的发现、基因突

变的检测、DNA多态性的分析、基因组作图等提供了有效的手段。

（一）概述

基因芯片(genechip)又称DNA芯片或DNA微阵列，以DNA分子杂交技术

为基础，将许多已知的、特定的寡核苷酸或基因(cDNA)片段作为探针，有序地、

高密度地排列在玻璃、硅片或尼龙膜等载体上，制成DNA微阵列(DNAmicroarray)，对待测样品DNA或由RNA通过RT-PCR扩增得到的cDNA进行荧光分子标记，并与芯片上的探针杂交，再经过激光共聚焦荧光扫描系统扫

描，检测探针分子杂交信号强度，通过计算机系统对荧光信号综合分析获得样品

中大量基因序列及表达的信息。基因芯片可以获得每个点在不同波长下的荧光强

度值及其比值(ratio值)，并得到直观的显色图。目前常用的荧光染料是Cy3（绿色）和Cy5(红色)。以Cy3 dUDP标记正常对照组织mRNA，Cy5 dUDP标记实验组织mRNA，杂交后仅在实验组织中高表达基因呈现红色，而在正常对照组

织中高表达的基因呈现绿色；在两组织中表达水平相当的显黄色，而均不表达的

则为无色。基因芯片可同时对两组或两组以上样品中的基因表达水平进行平行检

测，从而可对来源于不同个体(正常人与患者)、不同组织、不同细胞周期、不同

发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激(包括不同诱导、不同治疗手段)下细胞内的mRNA或逆转录产物cDNA进行大规模检测和分析。

根据微阵列上探针的种类，可将基因芯片分为寡核苷酸芯片和cDNA芯片。前者是将寡核苷酸原位合成或合成后固定在芯片上，并与标记样本DNA杂交，根据杂交信号出现部位的寡核苷酸序列，推测与其互补的DNA序列。可用于基因发现、突变检测、表达监控和遗传制图等。后者是将cDNA固定在芯片上，并与一组标记探针杂交，可用于基因表达的研究。

（二）基因芯片使用的基本流程

基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应及信号检

测和结果分析。

1．待测样本的制备 基因芯片的样本来自于两个方面：其一是直接从组织

细胞中分离纯化DNA，并对待测样本中的DNA进行特异扩增；其二是提纯RNA，并进行逆转录以及cDNA扩增。在DNA扩增的过程中需要完成样本的标记。目

前样品标记常采用荧光标记法，也可用生物素或放射性同位素。标记后的样品需

要进行纯化，以减小荧光背景对杂交信号检测的影响。

2．分子杂交反应 基因芯片的分子杂交与Southern印迹的方法一致。由于

探针是附着在基因芯片的表面，会干扰靶分子与探针的结合，因此需要相应地延

长杂交时间或增加靶分子的浓度。杂交反应条件必须根据探针的长度、类型以及

GC含量等调整杂交液的盐浓度、杂交温度以及时间。

3．检测分析 基因芯片的分子杂交信号的检测和分析需要高灵敏度的检测

系统——阅读仪及其分析软件。根据成像原理的不同，阅读仪可分为激光共聚焦

扫描和CCD两种。前者分辨率和灵敏度较高，可获取高质量的图像和数据，但

扫描速度较慢，而且价格昂贵。后者的特点与之相反。目前常用的是激光共聚焦

扫描仪。

基因芯片杂交实验可以产生成千上万个点的杂交信息，因此需要生物信息学

手段的支持。借助读取和分析杂交信号的应用软件以及与网络公共数据库连接进

行数据分析的应用软件，可以高效获得研究对象的有效信息。

（三）基因芯片的应用领域

1．基因表达分析 发现和研究新基因可以从分子水平探求细胞生长代谢的

调控机制，揭示基因突变诱导人类疾病的病因以及发生机理。基因芯片技术是基

因筛选的有效方法。

个体生长发育、细胞分化或组织生理功能的发挥常需要一个或几个功能基因

群共同作用。基因芯片可同时检测成千上万个基因，获得细胞、组织和机体在某

一特定时点所有基因表达的信息，从而揭示细胞在某个阶段的调控网络或对某刺

激的反应通路。基因芯片在组织特异性基因筛选的研究中具有高效性和全面性，

而且可以检测低丰度表达水平的mRNA。

2．基因突变检测 基因芯片是检测基因突变高效的手段。经典的研究多采

用PCR-SSCP、手工或自动测序、异源双链分析、蛋白截短检测等方法，其缺点

为步骤烦琐、工作量大、工作效率较低，限制了在大规模研究中的应用。基因芯

片方法可以克服以上的不足，结合DNA聚合酶或连接酶，可进一步提高分辨率。

3．药物筛选 筛选、分离和鉴定药的有效成份是目前中药产业和传统的西

药开发的重要方向。基因芯片技术为大规模筛选药物提供了有效的手段，并能够

从基因水平揭示药物的作用机理。应用基因芯片技术不仅能够分析用药前后机体

的不同组织、器官基因表达的差异，而且可以利用RNA或单链DNA与靶蛋白

质结合形成蛋白质-RNA或蛋白质-DNA复合物的特点，筛选特异的药物蛋白或核酸。生物芯片技术不仅使药物筛选、靶基因鉴别和新药测试的速度大大提高，

而且大大降低了研究成本。

4．基因芯片在其它领域中的应用 随着人类基因组计划（HGP）的完成，人类医学将从群体医学向个体医学过度。由于每个个体的遗传背景不同，其对临

床治疗将有新的要求，即因人而治。由于不同患者对药物的敏感性存在差异，确

定患者与药物代谢相关的基因多态性极为重要，基因芯片为患者的基因多态研究

提供了高通量的测试手段。另外，基因芯片也是诊断同种疾病不同病原体的有效

手段。例如乙肝有多种亚型，HBV基因在S、P及C基因区易发生变异。利用乙肝病毒基因多态性检测芯片进行检测，可以指导临床用药，以及防止乙肝病毒

耐药性，因此具有临床指导意义。

在生物体的细胞内，存在着几千至数万个基因。不同基因间的关系错综复杂，

一个基因表达的上调或者下调均会影响上游和下游几个基因表达的改变，从而进

一步引起与该几个基因相关的更多基因表达的改变。生物信息学在分析基因相互

关系的网络中扮演至关重要的角色。基因芯片技术为生物信息的建立提供了高

速、并行采集和分析的技术平台，成为基因组信息学研究的主要技术支撑。

（潍坊医学院 杜长青、高志芹）

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