高三生物dna重组技术的基本

范文一：高三生物dna重组技术的基本工具

生物专题 1 基因工程

本专题教材分析

一、教学目的要求

知识方面

1. 简述基础理论研究和技术进步催生了基因工程。

2. 简述基因工程的原理及技术。

3. 举例说出基因工程的应用。

4. 简述蛋白质工程。

情感态度与价值观方面

1. 关注基因工程的发展。

2. 认同基因工程的应用促进生产力的提高。

能力方面

1. 运用所学 DNA 重组技术的知识,模拟制作重组 DNA 模型。

2. 尝试运用基因工程原理,提出解决某一实际问题的方案。

3. 通过讨论、进展追踪等活动,提高收集资料、处理资料、撰写专题综述报告的能力。基因工程属于生物科技前沿的内容, 这一专题的教学, 首先要考虑基础性。高中阶段的教学不是培养专家, 而是要全面提高学生的科学素养, 因此, 着力点应瞄准对学生的发展起根本作用的知识、能力、思想情感上。忽视了这一点,而一味追求知识的深和透,就会本末倒置, 影响学生的全面发展。

本专题教学的另一个重要原则就是要在学生原有的知识、经验基础上提升。违背了渐进性, 易使学生认为“基因工程难学”而产生“危乎高哉”的想法,望而却步。紧密联系学生已有的经验、生活阅历, 尽量紧密联系必修课中的基础知识, 一步步引领学生登上这一科技前沿的舞台,学生们才会心驰神往地投入到学习中来。

在学习本专题内容时, 不能忽视知识与能力、情感态度与价值观的有机结合。情感态度与

价值观是学习的动力, 要利用国际上重大科技成果的素材, 开阔学生的视野, 增强他们奋发图强的紧迫感; 利用国内重大科技成果的素材, 培养他们自强不息的民族精神, 从而唤起他们学习的积极性。

二、教学内容的结构和特点

(一)教学内容的特点

本专题的内容由题图、《科技探索之路》和四节内容构成。

题图为学习者创设了一个意境。沃森和克里克对 DNA 双螺旋结构的重大发现和随后的技术创新孕育了基因工程。在复制的 DNA 双螺旋结构上展示的转基因工程菌、牛、羊、鱼、番茄、甜椒、牵牛等,代表了基因工程在三个重要方面的研究成果:转基因微生物、转基因动物和转基因植物。在上述画面的基础上,点出基因工程的主题:“基因工程是按照人们的愿望, 进行严格的设计,通过体外 DNA 重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ”此题图不仅寓意深刻,且十分生动。

《科技探索之路──基础理论和技术的发展催生了基因工程》是正文的前奏曲。没有基础理论的研究成果,没有技术方面的创新发明,基因工程不可能诞生,也不可能迅速崛起。其内容分两部分:一部分介绍基础理论研究成果,一部分介绍在技术层面上发明的各种操作手段。编者精选这些最重要的成果, 其目的是使学生从科技史实中, 感悟创新是科学技术发展的不竭动力。

专题 1基因工程本专题参考学时为 7课时,其中第一节《 DNA 重组技术的基本工具》 2课时;第二节《基因工程的基本操作程序》 2课时;第三节《基因工程的应用》 2课时;第四节《蛋白质工程的崛起》 1课时。

对本专题的特点分析如下。

1. 纵观全章内容──折射创新与发展的光辉

纵观本章科技探索之路和四节内容, 鲜明揭示出理论创新、技术进步是促进基因工程问世和迅猛发展的主导因素。例如,在《科技探索之路》中,有关基础理论研究,相关操作工具的发现,催生了基因工程。在《基因工程的基本操作程序》中, PCR 基因扩增技术的发明,又

将基因工程提升到一个新阶段。由于基因导入方法的不断创新和完善, 使基因工程技术在微生物、植物、动物领域硕果累累。在《基因工程的应用》中, 不仅可以看到转基因技术在微生物、植物、动物中的应用, 而且看到这项技术已经发展到基因工程药物治疗、基因治疗等医药卫生领域。在《蛋白质工程的崛起》中,描述基因工程虽然硕果累累,但仍满足不了日益发展的生活、生产的更多要求,从而崛起了第二代基因工程──蛋白质工程。基因工程从诞生到现在, 时间虽短,但包括的内容已折射出人类不断开拓创新、不断寻求发展的精神光辉。

2. 透视字里行间──体现“科学、技术、社会(STS ) ”教育思想

在科技探索之路──《基础理论和技术的发展催生了基因工程》中,以精选的史实,说明了科学和技术的关系。在《 DNA 重组技术的基本工具》中, “工欲善其事,必先利其器”又一次说明科学和技术是一对孪生兄弟。在《基因工程的基本操作程序》中,目的基因获取等一系列步骤,把社会需求、基础理论和先进技术融合在一起。在《基因工程的应用》中,社会的需求推动着科学技术的迅猛发展;基因工程的迅猛发展,促进了社会的不断进步。而《蛋白质工程的崛起》一节说明, 社会的更高需求召唤着科学、技术的再创新──第二代基因工程的崛起。 3. 感悟呈现方式──体现“简约、形象、诱思”原则

由于基因工程内容上的“高”与“新” ,处理不好,会提高学习难度,令学生视高科技为畏途,致使教学流于形式,为此,教材的编写采用简化手法,化复杂为简约。在科技探索之路中,摘其基础理论和技术创新中主要内容呈现给学生,在《 DNA 重组技术的基本工具》中摘其基本工具介绍给学生。在《基因工程的基本操作程序》和《基因工程的应用》中, 呈现主干, 割舍枝杈,将非主干内容以资料卡、拓展视野等方法呈现,做到有主有次。

对于基因工程,学生接触得少,为此,教学内容的另一种呈现方式是形象化。在文字描述感到抽象时,课文中都配以插图,力争图文并茂。对课文中难以理解的名词、概念,通过打比方,使其“形象化” 。例如,基因文库中把基因组文库比作国家图书馆,而把 cDNA 文库比作某市图书馆,这样便于学生理解和掌握。

“简约”和“形象”不是为了降低学生智力参与的力度,恰恰相反, “简约”给学生留有了思维的时间和空间。 “形象”为学生左右脑协同思考创设了情境。为此,在本章教学内容中,

结合图文,都提出了一些相应的问题,诱导学生思考,从而把学习的注意力,从简单的死记硬背引导到分析、批判、创新等有利于学生终身发展的能力上来。例如,在模拟制作中,通过提出问题,引导学生进一步思考特定限制酶的功能、 DNA 连接酶的作用位点。又如,在学习限制酶时,提出“限制酶在原核生物中的作用”的问题,是为学生创设一个问题情境,从而为深入理解限制酶在生物体中的作用打开思路。

(二)教学内容的结构

科技探索之路──基础理论和技术的发展催生了基因工程

三、与学生经验的联系

报刊、杂志、广播、电视等媒体都有基因工程技术的介绍。高中学生已经或多或少了解一些基因工程的内容, 知道人的生长激素基因可在鲤鱼中表达, 使鲤鱼生长迅速; 知道寒冷水域中鱼的抗寒基因可在植物中表达, 从而培育出抗寒性能高的植物??由于基因工程的诞生, 实现了在微生物、动物、植物之间的基因交流,人类以前不能实现的种种奇思妙想将变为现实。在现实生活中, 转基因生物也来到了人们的身边:超市中摆放着转基因大豆榨出的油; 大田里种植了转基因的抗虫棉; 药品商店出售着转基因微生物生产的胰岛素??可以说, 以上内容都是学生学习新知识可联系的经验。

还有一些必修课中学习过的知识可作为学习新知识的铺垫。

在学习限制酶与 DNA 连接酶时, 可与必修本中有关 DNA 结构的知识紧密联系。有了 DNA 结构的基础知识,才能较好地理解这两种酶的功能。

在学习目的基因检测时,可与必修本中 DNA 指导蛋白质合成的过程联系。这样学生才能理解, 为什么要在三个层次上检测:①检测转基因生物是否插入了目的基因; ②检测目的基因是否转录出 mRNA ;③检测目的基因是否翻译成蛋白质。

在学习基因组文库时,可联系必修本中人类基因组计划的内容,从而获得一些感性认识。而在学习 cDNA 文库时,联系 DNA 转录的有关知识:获得 mRNA 后,以它为模板,反转录则可获一条 DNA 单链,再以单链为模板合成双链 DNA 。

在学习 PCR 扩增技术时,可联系必修本中的 DNA 复制的内容。

在学习基因工程的应用一节时, 应鼓励学生主动联系当地生产、生活中的具体事例, 引导学生思考用基因工程的方法解决实际问题。

四、与其他专题的联系

本专题多数内容都与其他专题有紧密的联系。关于转基因生物, 在学习技术知识的基础上应引导学生主动学习《生物技术的安全性和伦理问题》专题。《胚胎工程》中有关胚胎移植技术的内容,可使学生对培育转基因动物有更加透彻的理解。《细胞工程》中介绍植物细胞培养技术,是目的基因导入植物细胞、培育转基因植物的重要环节。另外,学习本专题内容时,密

切关注《生态工程》专题中呈现的生态环境问题,思考利用基因工程的方法,解决生态环境问题中常规技术难以解决的问题。

1.1DNA 重组技术的基本工具

一、教学目标

1. 简述 DNA 重组技术所需三种基本工具的作用。

2. 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。

二、教学重点和难点

1. 教学重点

DNA 重组技术所需的三种基本工具的作用。

2. 教学难点

基因工程载体需要具备的条件。

三、教学过程

1. 设置问题情境,引导学生在思索中学习新知识。

本节内容主要是介绍 DNA 重组技术的三种基本工具及其作用。如果我们采用直白、平淡的方式介绍, 不利于调动学生学习的积极性, 也不利于学生科学素养的全面提高。应当通过创设情境,提出问题,诱导学生积极参与教学活动,开启他们思想的闸门。

酶来切割外源 DNA ,而使之失效,达到保护自身的目的”。这样就将书中直白的“这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的写法,变成了一个自主探索的思想活动。

DNA 连接酶── DNA 片段的“分子缝合针”,写得比较简洁。我们可以从原有的知识出发, 诱发学生思考, 达到辨析、明理的作用。要想连接被切割开的 DNA , 学生根据从前学过的知识, 第一反应就想到“ DNA 聚合酶”。学生这种想法的产生是很自然的。但实际上并不能用这种酶进行 DNA 片段的连接。应引领学生分析 DNA 聚合酶与 DNA 连接酶的不同作用, 从而达到更深层次认识 DNA 连接酶的目的。

基因进入受体细胞的载体── “分子运输车” 的学习内容, 提到作为载体必需的四个条件。教学不能仅仅着眼于让学生记住这几个条件, 而应该通过诱导思索, 明确为什么要有这四个条件才能充当载体。

2. 让抽象的语言在直观的插图中找到注释,在实际动手中形成正确认识。

语言文字具有抽象、概括的特点;插图等信息媒体,具有形象、直观的特点,容易被感知和理解,但抽象、概括功能差。要想真正理解本节语言文字中的含义,必须将抽象的语言文字与形象的插图等非语言信息媒体有机地结合起来, 做到优势互补。这样学生一时琢磨不透的抽象语言,就能在具体、直观的插图中找到注解。

抽象的黏性末端、平末端的叙述以及磷酸二酯键的部位, 与直观的插图协同运用, 可使学生准确地理解切割或连接部位,理解“黏性”的内涵。 DNA 连接酶是“缝合”磷酸二酯键的, 在重组 DNA 过程中到底体现在何处, 结合插图会易于理解。紧密结合质粒载体结构的模式图教学,也将使学生对构建载体条件的有关内容变得容易理解。

在模拟制作 DNA 重组模型时, 单纯动手剪纸板只能算是手工劳动, 而模拟制作是富含科学内涵的动手过程。当拿来剪刀时,首先意识到这是一把 EcoRI 的特异剪刀,应去寻找 G — A — A — T — T — C 的碱基序列,然后从 G 和 A 之间剪开。当拿来不干胶时,意识到只能黏连磷酸二酯键处,而不能去黏连碱基对处。当出现模拟制作失误时,也要想想,这在真实情况下可能是什么原因所致。

3. 引导学生从基因工程的整体思考问题,解决本节教学难点。

本节的难点是对载体必须具备条件的分析。要想解决这个问题, 就事论事的做法不能奏效。只有将这局部的内容整合到整个基因工程的设计过程中才能理解。例如, 我们选用从霍乱弧菌中的质粒来做载体, 结合基因工程的实际目的来想:谁敢用它来做受体细胞的载体?显然人们对分离出的基因产物运用后果有顾虑, 从而认清载体必须对细胞无害。当然这里主要考虑载体不能有害于受体细胞,影响其生命活动的正常进行。

又如, 载体上没有标记基因, 我们用肉眼又看不到载体是否真正进入, 那么如何鉴定?因此只有真正想到实际工作中这方面的困难,才会明白预先为什么要选具备标记基因的载体。再如,没有一个和多个切割位点,就不能进行 DNA 的重组。重组 DNA 不能复制,就可能丢失。所以要引导学生, 将一个个的问题置于整体过程中考虑, 这样才能理解局部的做法是为了实现整体的目标。

1.2基因工程的基本操作程序

一、教学目标

1. 简述基因工程原理及基本操作程序。

2. 尝试设计某一转基因生物的研制过程。

二、教学重点和难点

1. 教学重点

基因工程基本操作程序的四个步骤。

2. 教学难点

(1)从基因文库中获取目的基因。

(2)利用 PCR 技术扩增目的基因。

三、教学过程

本节是《基因工程》专题的核心,上承《 DNA 重组技术的基本工具》一节,下接《基因工程的应用》。本节教学难点多,学生学习有一定的困难,因此采取化整为零、各个击破的教学过程。

1. 加强预习环节, 先解决为什么要分四个步骤的问题, 然后解决每一步骤的技术方法问题。为了突破难点及培养自学能力, 在上节课结束时, 可布置学生预习本节内容。在上新课时, 首先解决基因工程的基本操作程序为什么要分四个步骤,即分析每一步骤的必要性。

为什么要有“目的基因的获取”这一步?引导学生看本专题题图中基因工程的概念:“基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外 DNA 重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性, 创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ” 可以说这既是概念, 也是原理。这里所说的“更符合人们需要” ,就是目的,那么更符合人们需要的那个基因就是目的基因了。有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。

为什么要有“表达载体的构建”这一步?单独的 DNA 片段──目的基因是不能稳定遗传的。课文中谈到构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在, 并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能表达和发挥作用。

为什么要有 “目的基因导入受体细胞” 这一步?教材指出含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞,并且维持稳定和表达,才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。

为什么要有 “目的基因的检测与鉴定” 这一步?这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的 DNA 中,是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达,只有通过检测、鉴定才能得知。在解决上述为什么基因工程操作程序分四个步骤的基础上, 进入每一程序的有关技术和方法的学习。

2. 加强教学媒体的运用,解决每一程序中的技术难点。

在各个操作程序中都有一些技术和方法层面上的难点不好理解, 成为学生学习过程的拦路虎。形象化是解决这一难题的好办法。例如,在目的基因获取的常用方法中有“从基因文库中

获得目的基因”的说法。尽管课文中运用了比喻的方法,但语言文字仍显抽象。应尽可能在教学中编制软件、绘制投影片或利用挂图来解决这一难点。让学生了解有了基因文库, 就可随时从中提取所需要的目的基因,引入受体细胞使之表达。而有关 PCR 扩增技术,则可结合书中插图,明示出文字中概括出的变性、退火、延伸、多次重复等四个过程。

又如, 在学习基因表达载体的构建方法时, 可结合插图, 说明插入必要的元件──目的基因、启动子、终止子和标记基因的位置及其作用。

再如, 学习目的基因导入方法时, 可借用目的基因导入植物细胞的方法──农杆菌转化法以及相关的图,讲清具体方法。攻破一点后,再扩展到其他导入方法。

3. 通过设计某一转基因生物,将基因工程的操作程序有机地串联起来。

本节学习的基因工程的基本操作程序和方法是对转基因植物、动物、微生物的概括。如果在本课将要结束时, 做个练习, 带领学生结合设计某一转基因生物的具体过程, 可将基因工程操作程序有机地串起来,从而加深对这一程序的认识。例如,烟草是人类健康的“杀手” 。如果让它生产出人类需要的药物蛋白, 应如何操作?通过这一实例引导学生结合目的基因从何而来,表达载体如何构建,如何导入烟草,如何检测药物蛋白产生与否等问题加以设计。可加深学生对基因工程原理的理解。不同学生会有不同的方法,让学生通过相互比较,相互借鉴,达到相互学习的目的。学生在课下还可查阅《科学》杂志等参考读物,了解科学家成功的做法。

1.3基因工程的应用

一、教学目标

1. 举例说出基因工程应用及取得的丰硕成果。

2. 关注基因工程的进展。

3. 认同基因工程的应用促进生产力的提高。

二、教学重点和难点

1. 教学重点

基因工程在农业和医疗等方面的应用。

2. 教学难点

基因治疗。

三、教学过程

1. 加强收集信息和处理信息环节的指导。

基因工程的应用是基因工程基本操作程序的一个必然结果。如果本节只作为成果的学习, 那么就显得思维力度不足了。为此,加强指导学生收集和处理信息这一环节。具体做法如下:无论是学习转基因植物方面的应用, 还是学习转基因动物方面的应用, 乃至转基因工程菌生产药物方面的应用, 首先必须寻找目的基因。可利用下表, 指导学生整理课本中提供的信息, 填写此表。这样做既可以调动学生学习的积极性,也增强了他们分析和处理信息的能力。表转基因生物与目的基因的关系

指导学生提高处理信息的能力, 还可以体现在对教材内容的重组上。例如, 我们可以解决当前世界上存在的重大问题作为主题,如以解决“粮食” 、 “环境污染” 、 “能源危机” 、 “攻克不治之症” 等问题作为主题, 让学生将课文中的知识或学生知道的课外的基因工程应用方面的知识进行重组。这样的活动不仅培养了学生处理信息的能力, 还会使学生感悟到肩负的社会责任, 从而激发用科学技术报效祖国的志向。

2. 课文中的一些难点,采用小组讨论,师生共同归纳的方法学习。

课文中有几处是学生学习感兴趣的知识, 但文字说明不多, 学生学习有一定难度。例如 “ 什么叫乳腺生物反应器” 、 “什么叫工程菌” 、 “什么是基因治疗” 等。可创设问题情境,让学生讨论, 加深用已有知识认识新事物的能力。学生想不到的地方, 可由师生共同归纳。例如, 学习乳腺生物反应器时,学生提出“给我们讲讲乳腺生物反应器究竟是怎么回事” 。这时可提出以下问题,让学生讨论。

(1)用动物乳腺作为反应器,生产高价值的蛋白质(如教材中列举的血清白蛋白、抗凝血酶等)比工厂化生产的优越之处有哪些?

(2)用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的?

第一个问题, 既可以解决乳腺生物反应器的优越性问题, 而且显示了社会需求是乳腺生物反应器这一创新成果产生的动力。学生在充分讨论和发表观点的基础上, 师生共同归纳出乳腺生物反应器的优点:①产量高;②质量好;③成本低;④易提取。

第二个问题, 用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程与转基因动物操作过程相同。而不同之处可由提出:为了将目标产品在奶中形成, 需要使用乳腺组织中特异表达的启动子,要在编码目的蛋白质的基因序列前加上乳腺组织中特异表达的启动子构建成表达载体。操作过程大致归纳为:获取目的基因(例如血清白蛋白基因)→构建基因表达载体(在血清白蛋白基因前加特异表达的启动子) →显微注射导入哺乳动物受精卵中→形成胚胎→将胚胎

送入母体动物→发育成转基因动物(只有在产下的雌性个体中,转入的基因才能表达) 。关于工程菌的学习, 也可结合基因工程操作程序, 予以说明, 并结合微生物生长和代谢的特点,说明工程菌生产药物的优越性。

关于基因治疗, 可结合课文中的具体实例, 归纳出大致治疗过程。至于是否采用讨论方式, 可根据课堂时间而定。如果时间紧,也可采用引导学习的方法。

1.4蛋白质工程的崛起

一、教学目标

1. 举例说出蛋白质工程崛起的缘由。

2. 简述蛋白质工程的原理。

3. 尝试运用逆向思维分析和解决问题。

二、教学重点和难点

1. 教学重点

(1)为什么要开展蛋白质工程的研究?

(2)蛋白质工程的原理。

2. 教学难点

蛋白质工程的原理。

三、教学过程

1. 采用 “ 问题 — 探究 — 新问题 — 再探究 ” 的教学模式。

本节内容是基因工程的延伸和发展。由于蛋白质工程刚刚起步, 学习内容较少。如何学得充实, 又让学生悟出些终身学习的道理,采用 “ 问题 — 探究 — 新问题 — 再探究 ” 的教学模式。

新课一开始,可以带领学生回忆原有知识:要想让一种生物的性状在另一种生物中表达, 在种内可以用常规杂交育种的办法实现, 但要使有生殖隔离的种间生物实现基因交流, 就显得力不从心了。基因工程的诞生,为克服这一远缘杂交的障碍问题,带来了新的希望。于是取得

了丰硕成果:大肠杆菌为人类生产出了胰岛素, 牛的乳腺生物反应器为人类制造出了蛋白质类药物, 烟草植物体内含有了某种药物蛋白 …… 至此, 人们也只是实现了世界上现有基因在转基因生物中的表达。但一个新问题出现了,生物产生的天然蛋白质是在长期进化过程中形成的, 它的结构、性能不能完全满足人类生产和生活的需要。为了加深这一点的认识, 可调动学生从书中找实例(干扰素例子、工业用酶的例子)加以佐证。于是要对现有蛋白质进行改造,制造出目前从天然蛋白质中找不到的蛋白质。这样人们又开始了新一轮的探索, 蛋白质工程应运而生了。

2. 加强与已有知识的联系,用逆向思维的方法解决新问题。

学生在必修课中已学习过中心法则及蛋白质具有复杂的空间结构等知识。中心法则告诉我们遗传信息的流动方向如图所示。

遗传信息的流动方向

这是学习新知识的基础。既然蛋白质的功能是由 DNA 决定的, 那么要制造出新的蛋白质, 就要改造 DNA 。所以蛋白质工程的原理应该是中心法则的逆推。结合课本中插图,可以较明确地说明这一点。

还有两点教学需要说明。第一, 蛋白质工程的诞生是有其理论与技术条件支撑的, 正如课本中开头描述的, 它是随着分子生物学、晶体学以及计算机技术的迅猛发展而诞生的, 也与基因组学、蛋白质组学、生物信息学的发展等因素有关(本书 “ 前沿动态 ” 中有简要介绍) 。第二,说明蛋白质工程目前的现状:成功的例子不多, 主要是因为蛋白质发挥其功能需要依赖于正确的空间结构, 而科学家目前对大多数蛋白质的空间结构了解很少。这样学习, 可以使学生认识到科学探索之路的漫长、艰辛和永无止境。

范文二：高三生物dna重组技术的基本工具2

1.1 DNA重组技术的基本工具

一、教学目标

1. 简述 DNA 重组技术所需三种基本工具的作用。

2. 认同基因工程的诞生和发展离不开理论研究和技术创新。

二、教学重点和难点

1. 教学重点 DNA 重组技术所需的三种基本工具的作用。

2. 教学难点 :基因工程载体需要具备的条件。

三、教学策略

1. 设置问题情境,引导学生在思索中学习新知识。

限制酶──“分子手术刀”, 主要是介绍限制酶的作用, 切割后产生的结果。可在进入这部分内容学习时, 设置学生关心的问题“限制酶从哪里寻找”, 诱导学生联想从前学过的内容──噬菌体侵染细菌的实验, 进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭, 有何保护机制?进而诱导学生产生“可能是有什么酶来切割外源 DNA , 而使之失效, 达到保护自身的目的”。这样就将书中直白的“这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的写法,变成了一个自主探索的思想活动。

DNA 连接酶──DNA 片段的“分子缝合针”,写得比较简洁。我们可以从原有的知识出发,诱发学生思考,达到辨析、明理的作用。要想连接被切割开的 DNA ,学生根据从前学过的知识,第一反应就想到“DNA 聚合酶”。学生这种想法的产生是很自然的。但实际上并不能用这种酶进行 DNA 片段的连接。应引领学生分析 DNA 聚合酶与 DNA 连接酶的不同作用, 从而达到更深层次认识 DNA 连接酶的目的。

基因进入受体细胞的载体──“分子运输车”的学习内容, 提到作为载体必需的四个条件。教学不能仅仅着眼于让学生记住这几个条件, 而应该通过诱导思索, 明确为什么要有这四个条件才能充当载体。

2. 让抽象的语言在直观的插图中找到注释,在实际动手中形成正确认识。

语言文字具有抽象、概括的特点;插图等信息媒体,具有形象、直观的特点,容易被感知和理解, 但抽象、概括功能差。要想真正理解本节语言文字中的含义,教师必须将抽象的语言文字与形象的插图等非语言信息媒体有机地结合起来, 做到优势互补。这样学生一时琢磨不透的抽象语言,就能在具体、直观的插图中找到注解。

在模拟制作 DNA 重组模型时, 单纯动手剪纸板只能算是手工劳动, 而模拟制作是富含科学内涵的动手过程。当拿来剪刀时,首先意识到这是一把 EcoRI 的特异剪刀,应去寻找 G — A — A — T — T — C 的碱基序列,然后从 G 和 A 之间剪开。当拿来不干胶时,意识到只能黏连磷酸二酯键处, 而不能去黏连碱基对处。当出现模拟制作失误时, 也要想想,这在真实情况下可能是什么原因所致。

3. 引导学生从基因工程的整体思考问题,解决本节教学难点。

本节的难点是对载体必须具备条件的分析。要想解决这个问题, 就事论事的做法不能奏效。只有将这局部的内容整合到整个基因工程的设计过程中才能理解。例如, 我们选用从霍

乱弧菌中的质粒来做载体, 结合基因工程的实际目的来想:谁敢用它来做受体细胞的载体? 显然人们对分离出的基因产物运用后果有顾虑, 从而认清载体必须对细胞无害。当然这里主要考虑载体不能有害于受体细胞,影响其生命活动的正常进行。

又如, 载体上没有标记基因, 我们用肉眼又看不到载体是否真正进入, 那么如何鉴定? 因此只有真正想到实际工作中这方面的困难,才会明白预先为什么要选具备标记基因的载体。

再如, 没有一个和多个切割位点,就不能进行 DNA 的重组。重组 DNA 不能复制,就可能丢失。所以教师要引导学生, 将一个个的问题置于整体过程中考虑, 这样才能理解局部的做法是为了实现整体的目标。

四、答案与提示

(一)思考与探究

1. 限制酶在 DNA 的任何部位都能将 DNA 切开吗?以下是四种不同限制酶切割形成的 DNA 片段:

(1) ?CTGCA (2) ?AC (3) GC?

?G ?TG CG?

(4) ?G (5) G? (6) ?GC

?CTTAA ACGTC? ?CG

(7) GT? (8)AATTC?

CA? G?

你是否能用 DNA 连接酶将它们连接起来?

答:

2和 7能连接形成?ACGT?

?TGCA?;

4和 8能连接形成?GAATTC?

?CTTAAG?;

3和 6能连接形成?GCGC?

?CGCG?;

1和 5能连接形成?CTGCAG?

?GACGTC?。

2. 联系你已有的知识,想一想,为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的 DNA ?

提示:迄今为止,基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的, 它们各自可以识别和切断 DNA 上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身 DNA ,是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制, 对于外源入侵的 DNA 可以降解掉。生物在长期演化过程中, 含有某种限制酶的细胞, 其 DNA 分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列, 或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上, 使限制酶不能将其切开。这样,尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的 DNA 被切断,并且可以防止外源 DNA 的入侵(本题不要求学生回答的完全,教师可参考教师用书中的提示,根据学生的具体情况,给予指导。上述原则也应适用于其他章节中有关问题的回答。 ) 。

3. 天然的 DNA 分子可以直接用做基因工程载体吗?为什么?

提示:基因工程中作为载体使用的 DNA 分子很多都是质粒 (plasmid ) , 即独立于细菌拟核处染色体 DNA 之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的 DNA 分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢?其实不然,作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 (1) 载体 DNA 必需有一个或多个限制酶的切割位点, 以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置, 还必须是在质粒本身需要的基因片段

之外,这样才不至于因目的基因的插入而失活。

(2) 载体 DNA 必需具备自我复制的能力,或整合到受体染色体 DNA 上随染色体 DNA 的复制而同步复制。

(3) 载体 DNA 必需带有标记基因,以便重组后进行重组子的筛选。

(4) 载体 DNA 必需是安全的, 不会对受体细胞有害, 或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。

(5) 载体 DNA 分子大小应适合,以便提取和在体外进行操作,太大就不便操作。实际上自然存在的质粒 DNA 分子并不完全具备上述条件, 都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。

4. 网上查询:DNA 连接酶有连接单链 DNA 的本领吗?

提示:迄今为止,所发现的 DNA 连接酶都不具有连接单链 DNA 的能力, 至于原因, 现在还不清楚,也许将来会发现可以连接单链 DNA 的酶。

(二)寻根问底

1. 根据你所掌握的知识,你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗? 提示:原核生物容易受到自然界外源 DNA 的入侵, 但是, 生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制, 以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具, 当外源 DNA 侵入时,会利用限制酶将外源 DNA 切割掉,以保证自身的安全。所以,限制酶在原核生物中主要起到切割外源 DNA 、使之失效,从而达到保护自身的目的。

2. DNA连接酶与 DNA 聚合酶是一回事吗?为什么?

答:不是一回事。基因工程中所用的连接酶有两种:一种是从大肠杆菌中分离得到的, 称之为 E·coli连接酶。另一种是从 T4噬菌体中分离得到, 称为 T4连接酶。这两种连接酶催化反应基本相同, 都是连接双链 DNA 的缺口 (nick ) ,而不能连接单链 DNA 。 DNA 连接酶和 DNA 聚合酶都是形成磷酸二酯键 (在相邻核苷酸的 3位碳原子上的羟基与 5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成) ,那么,二者的差别主要表现在什么地方呢?

(1) DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的 3′末端的羟基上, 形成磷酸二酯键;而 DNA 连接酶是在两个 DNA 片段之间形成磷酸二酯键,不是在单个核苷酸与 DNA 片段之间形成磷酸二酯键。

(2) DNA 聚合酶是以一条 DNA 链为模板,将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的 DNA 链; 而 DNA 连接酶是将 DNA 双链上的两个缺口同时连接起来。因此 DNA 连接酶不需要模板。

此外,二者虽然都是由蛋白质构成的酶,但组成和性质各不相同。

(三)模拟制作讨论题

1. 你模拟插入的 DNA 片段能称得上一个基因吗?

提示:不能。因为一般基因有上千个碱基对。

2. 如果你操作失误,碱基不能配对。可能是什么原因造成的?

提示:可能是剪切位点或连接位点选得不对(也可能是其他原因) 。

(四)旁栏思考题

想一想,具备什么条件才能充当“分子运输车”?

提示:能自我复制、有一个或多个切割位点、有标记基因位点及对受体细胞无害等。五、知识拓展

1. 限制酶所识别的序列有什么特点?

限制酶所识别的序列,无论是 6个碱基还是 4个碱基,都可以找到一条中心轴线(图 1-1) ,中轴线两侧的双链 DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。

图 1-1 限制酶识别序列的中心轴线

2. 限制酶在 DNA 的任何部位都能将 DNA 切开吗?

任何一种限制酶都只识别和切断特定的核苷酸序列,这是由限制酶的性质所决定的。 3.DNA 连接酶连接的是什么部位?

DNA 连接酶是将一段 DNA 片段 3′端的羟基与另一 DNA 片段 5′端磷酸基团上的羟基连接起来形成酯键,而不是连接互补碱基之间的氢键。

4. 什么叫磷酸二酯键?

3,5磷酸二酯键是核酸中核苷酸的连接方式,组成了核酸的一级结构。在核酸中一个核苷酸核糖上第 3位的羟基与下一个核苷酸核糖上第 5位的磷酸羟基脱水缩合成酯键, 该酯键称 3,5磷酸二酯键。若干个核苷酸间以 3′,5′磷酸二酯键(图 1-2)连接成的多核苷酸链为核酸。在链的一端的一个核苷酸, 其核糖上第 5位连接的磷酸只有一个酯键, 称此核苷酸为 DNA 链的 5′磷酸末端或 5′端。另一端核苷酸上第 3位的羟基是自由的,所以此核苷酸称为 3′羟基末端或 3′端。链内的核苷酸第 5位上的磷酸已形成二酯键,第 3位上的羟基也已参与二酯键的形成,故称核苷酸残基。

范文三：第八节 dna重组及基因工程技术对医学和生命科学发展的贡献

第八节 DNA重组及基因工程技术对医学和生命科学发展的贡献

作为分子生物学发展的重要组成部分，DNA重组及基因工程技术给生命科学带来了革命性变化，促进着生命科学各学科研究和应用的进步，对推动医学各领域的发展同样起着重要的作用。一、对人类遗传信息的认识

遗传信息决定生物的形态和特征，是生物生存之本。估计人类的基因组DNA约有4×109bp，含有约5-10万个基因，但至今人类对自己赖以生存繁衍的这个庞大的遗传信息库还知之甚少，目前已经知道的人基因只占估计数的百分之几，已搞清楚其表达调控者更寥寥无几，对占基因组80-90%不为蛋白质编码序列的认识更少，因而实际上我们现在对自己生存的基础和实质只有很表面的肤浅认识，设想如果人类掌握了自身全部遗传信息的结构、功能、表达和调控，无疑将能够深刻认识人的生长、发育、生存、繁衍的整个生老病死历程，将能对疾病的诊断、治疗和预防提出极有效的措施，将能真正掌握自己生存和发展的命运。 DNA重组技术的出现和发展，就使人们有可能去深入探索这个重大的课题。1985年提出的人基因组研究计划(Human Genome Project)很快得到世界科学的响应，这个研究计划的目标是要阐明人类遗传信息的组成和表达，是迄今全球性生物学、医学领域最引人注目的巨大研究工程。DNA重组是完成这个任务的主要手段，其中包括大片段DNA克隆、DNA的大尺度分析、全自动DNA序列测定，基因组信息数据库的建立等新思维和新技术的不断出现和发展，再加上大规模引入其它领域先进的科学技术，原预定21世纪头10年绘制出完整的人类染色体基因定位图、测定出人类基因组全部DNA序列，有望按期或提前完成。当然在这基础上要搞清楚全部人类基因的功能、各基因间的关系，基因表达调控、人类遗传信息的多样性等还要经历更长期和更艰苦的努力。但DNA重组技术促进了分子生物学迅速发展，给人类探索自身生命的奥秘展示了光明的前景。

生命关键的基础在于蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸相的相互作用，生物大分子的结构与功能的联系正是生命“活”的本质所在。凭借基因工程人们可以克隆获得天然的或任意设计的核酸序列，可以大量获得过去难以得到的生物体内极微量的活性蛋白质、可以设计获得任意定点突变(site-directed mutagenesis)的基因和蛋白质，这就为研究蛋白质与核酸的结构与功能、揭露生命的本质提供了很有力的手段。二、基因工程药物与疫苗

利用基因工程技术生产有应用价值的药物是当今医药发展一个重要的方向，现在世界上已有几千家生物技术公司，其中多数都生产医药或医药研究所需的试剂。利用基因工程技术生产药物有两个不同的途径:一是利用基因工程技术改造传统的制药工业，例如用DNA重组技术改造制药所需要的菌种或创建的菌种，提高抗菌素、维生素、氨基酸产量等;二是用克隆的基因表达生产有用的肽类和蛋白质药物或疫苗，虽然基因诊断和医药研究试剂的基因工程产品已经很多，但目前基因工程药物还只处在发展的早期，至今真正被卫生部门正式批准投放市场的基因工程肽或蛋白类治疗药物现在还不多，但正在开发的基因工程治疗药物却有几百种，且而逐年迅速增加，可见其具有的巨大潜力。基因工程药物不仅用于医药上，还能用于工农业上，促进生产的发展，已经投放市场或近期可望投放市场的基因中程药物可举出以下例子。 1、基因工程疫菌乙型肝炎是常见的传染病，过去从病人血液中分离乙肝病毒的表面抗原作为疫苗，来源有限，价格昂贵，有潜在交叉感染的危险。现在克隆得病毒编码的HbsAg基因，使其表达获得大量HbsAg用作疫苗。1986年美国正式批准基因工程乙肝疫苗投放市场，我国的科学工作者也克隆得在我国流行常见乙肝病毒亚型的HbsAg基因，研制得适用于我国乙肝基因工程疫苗，并已生产和使用。近期可能投放市场的还有甲型肝炎、巨细胞病毒、流行性出血热、轮状病毒、细菌性腹泻等基因工程疫苗。我军事医学科学

院研制的仔畜腹泻基因工程疫苗，使仔畜免遭大肠杆菌腹泻之害，保护率达90%以上，为我国的肉食供应做出了贡献。

2、基因工程肽类药物由免疫细胞和其它细胞分泌的细胞因子是具有很高活动性的肽类分子，在调节细胞生长分化、调节免疫功能、参与炎症反应和创伤修复中起重要作用，其中许多很有应用价值，但其生成量极微，难以提取获得，基因工程则可克隆其基因，使之表达获得大量产物供用。传统的肽类激素，血液中的微量活性成分、酶类同样可用基因工程手段获得。表20-3列出一些已上市的正在研制的基因工程多肽药物。

表20-3 基因工程肽类药物

名称作用

各种干扰素(interferon IFN) 抗病毒、抗肿瘤、免疫调节

各种细胞介素(interleukins ,IL) 免疫调节、促进造血

各种集落刺激因子(colony stimulating 刺激造血 factors ,CSF)

红细胞生成素(erythropopoetin EPO) 促进红细胞生成，治疗贫血

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF) 杀伤肿瘤细胞、免疫调节、参与炎症和全身性反应表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF) 促进细胞分裂、创伤愈合、胃肠道溃疡防治神经生长因子(nerve growth factor ,NGF) 促进神经纤维再生

骨形态形成蛋白(bone morphogenetic protein ,BMP) 骨缺损修复、促进骨折愈合

组织纤溶酶激活剂(tissue-type plasminogen 溶解血栓、治疗血栓疾病 activator ,t-PA)

血凝因子?、? 治疗血友病

生长激素(rgowth hormone ,GH) 治疗侏儒症

胰岛素(insulin) 治疗糖尿病

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD) 清除自由基、抗组织损伤、抗衰老 3、基因工程抗体用传统细胞融合杂交瘤技术制备的单克隆抗多数是鼠源性抗体，用于人体会产生免疫排斥反应，用杂交瘤方法制备人源性抗体又遇到难以克服的困难。用基因工程的方法可以不经过杂交瘤技术而直接获得特定的人的抗体基因克隆。也可以计算机辅助设计，用DNA重组技术将鼠源性抗体基因人源化，然后放入表达载体，表达产生人源化抗体。我国已成功克隆得到多种肿瘤、抗病毒、抗细胞因子、抗细胞受体等不同单克隆的基因，鼠源性抗人肝癌、抗人黑色素瘤、抗人纤维蛋白抗体基因的人源化工作正在进行，并已成功直接获得人源性抗乙型肝炎病毒抗体基因。不同类型的抗体基因已分别在细菌、昆虫细胞、培养的哺乳细胞和植物中表达。基因工程抗体被称为第三代抗体，其研制虽然刚起步，但已展示出良好的应用前景。

三、转基因动物和植物

克隆的基因不仅导入细菌和培养的细胞，而且能转入动植物体内、改变其遗传特性。转基因动物(transgenic animals)就是指在其基因组内稳定地整合有外源基因、并能遗传给后代的动物。1979年Mintz等将SV40

病毒NDA导入小鼠早期胚胎的囊胚腔，第一次得到载有人工导入外源基因的嵌合体小鼠(chimeic morse)。1982年Palmiter等将克隆的生长激素基因用显微注射(microinjection) 的方法直接导入小鼠受精卵细胞核内，所得转基因的小鼠的肝、肌、心等组织都能产生生长激素，小鼠比原个体大几倍，称为“巨鼠”，使人们意识到转基因技术的巨大潜力及其在遗传育种方面的划时代意义，除受精卵外，从胚胎中分离的多潜能干细胞(ES细胞 ,embryonic stem cells)也能接受外源基因发育成个体，外源基因的导入还可以采取逆转录病毒载体感染等方法。目前已经得到的转基因动物除鼠外还有转基因兔、羊、猪等。利用转基因动物可以建立人类疾病的动物模型，为对人类疾病病因研究，以及测试新治疗方法提供了有力手段。例如用导入各种癌基因、致瘤病毒基因或其调控序列等的转基因小鼠，可以观察肿瘤发生的历程和影响因素;导入相关突变基因的转基因动物可以造出糖尿病、镰刀形细胞贫血、白内障等疾病模型;用肝炎病毒基因的转基因动物可以研究肝炎病毒基因在肝炎病中的作用，利用导入各种细胞因子基因、免疫功能基因、以及特定核酸序列的转基因动物可以从整体研究细胞因子、免疫调控、基因表达调控等问题。近年来转基因动物技术又有新的发展。ES细胞导入与目的基因同源的序列，则在体内可以经同源重组使用的基因发生突变，这样成长起来的动物有目的基因的缺陷，这种技术称为基因打靶(gene targetting)。用基因打靶可以在整体水平上研究基因的功能，并能制造出遗传缺陷的疾病模型。用转基因动物还能获得治疗人类疾病的重要的蛋白质。例如导入了凝血因子?基因的转基因绵羊分泌的乳汁中含有丰富的凝血因子?，能在效地用于血友病的治疗。

”，激起了人们的创造优良品持家畜的热情。我国转基因技术在遗传育种上闯出了新路。成功获得“巨鼠

水生生物研究所将生长激素基因转入鱼受精卵，得到的转基因鱼生长显著加快、个体增大;转基因猪也正在研制中。

转基因植物在育种上也获得成绩。1994年比普遍西红柿保鲜时间更长的转基因西红柿投放市场，1996年转基因玉米、转基因大豆相继投入商品生产。美国最早研制得抗虫棉花，我国科学家将自己发展的蛋白酶抑制剂基因转入棉花获得抗棉铃虫的棉桦株。到1996年全世界已有250万公顷土地种植转基因植物。与按传统孟德尔遗传规律育种比较，转基因技术显出其优越和更大的潜力，提高光合作用、扩大固氮能力、提高营养价值、抗虫、抗病、抗旱等转基因植物都在研究中。将人的基因转入植物还可能获得医学上的治疗用途的药物，例如将人抗体基因转入烟草，从烟叶中就能提取得人的抗体蛋白。

四、基因诊断与基因治疗

基因克隆和基因分析的手段得到与人类疾病有关的基因异常变化、以及致病微生物基因结构方面的知识，就可能用检测和分析基因的方法去诊断疾病。对与疾病相关的基因及其调控了解，就有可能导入外源目的基因去纠正基因缺陷或改变基因表达调控以期达到治疗疾病的目的。这些都是分子生物学进展在医学上重要的应用。因而本书列出两章专门讨论，在此不再重复叙述。

NDA重组技术和基因工程使人类进入了能动改造的生物界的新纪元，使医学发展到分子医学的新阶段。但由于人类对生物基因组的结构、基因表达调控等认识还很有限，因而分子生物学的成果在医学上的应用还处在初级阶段。新的基因工程药物虽然不断涌现，但已应用的还是少数，而且由于对基因产物的整体效应等研究还不够充分，即使已批准投入市场的基因工程药物，有的疗效还不很理想。基因诊断应用的范围尚有待扩大，基因治疗理想成功的例子还不多。转基因的工作还由于基因导入后在基因组上的定位整合等知识和技术尚不成熟，因而现在转基因的工作还很盲目、成功率还很低。这些都有待于进行许多扎实的基础研究，了解更多分子遗传学方面规律，并改进和创建新的技术，才能得到提高。然而探索着生命本质的分

子生物学已经指出了光明的前程，随着科学的进步，肯定将逐步实现能按人们的意志去获得理想的结果，可以说“前途光明灿烂，道路曲折而遥远”。

小结

基因工程又称遗传工程，是生物工程的主导技术。DNA重组技术或分子克隆是基因工程的核心。分子生物学研究中发现的许多核酸酶类都可用作基因工程的工具。其中能识别特定的回文序列并切割DNA双链的?类限制性核酸内切酶在DNA重组技术中被广泛应用。

当前目的基因序列主要来源于自然界的生物，无性繁殖的纯基因称为基因克隆，目的基因或核酸序列必须由载体携带进入宿主细胞复制繁殖才能分离到克隆。常用的载体有质粒、噬菌体、病毒、酵母人工染色体等，载体必须能携带目的序列有效地进入宿主细胞复制繁殖，并应当具有良好的标志可供识别和筛选，常用有抗药性和α互补蓝白筛选标志等。为获得目的基因克隆，可构建生物的基因组文库，完整的基因组文库是含有该生物全部遗传信息的克隆集合体，从基因组文库中可以克隆得该生物的基因组基因;以mRNA为模板经反转录酶催化合成与 NRA序列互补的DNA称为cDNA，可以从组织细胞提取mRNA构建cDNA文库，完整的cDNA文库可以获得特定基因的cDNA构隆。目的基因也可以用PCR或人工合成核酸的方法得到，但还离不开从生物基因组和cDNA获得基因序列知识。要设计严密的方案，借助工具酶的作用，将目的基因或序列以适当的连接方式插放载体，用转化、感染或转染的方法导入宿主细胞繁殖，经抗药生长、呈色显示，核酸分子杂交、PCR、免疫学亲和结合或限制性酶谱分析等方法筛选获得克隆，最后要经过核酸序列分析鉴定。

克隆的基因可以插入表达载体中带有宿主细胞中表达，这是研究目的基因功能和获取基因产物必需步骤。表达载体应当具备在宿主细胞中复制繁殖、筛选、目的基因插入、以及基因表达所需要的各种元件。大肠杆菌遗传背景清楚、操作容易、经济、表达水平高，是最常用的表达系统，但它不适用于真核基因组基因的表达并缺乏真核转录后加工、翻译后加工等功能。

DNA重组技术和基因工程是分子生物学发展的突出领域，开创了人类能动改造生物界的新阶段，推动了医学和整个生命科学的进步，为基因诊断、基因治疗、基因工程药物的发展开辟了道路，是分子生物学走向广泛应用的重要方面，目前基因工程还只是发展的初阶段，它将依赖于分子生物学的进步而发展。复习思考题

1、什么是DNA重组技术,它包含那些内容,

2、列举常用的基因工程工具酶的特性和用途。

3、叙述常用的基因工程载体的种类、特点和用途。

4、怎样获得目的基因或核酸序列的克隆,有那些方法,要经过那些基本步骤,

5、怎样能在大肠杆菌中获得真核基因的表达产物,

佛学经典励志语录，

一、人之所以痛苦，在于追求错误的东西。

二、与其说是别人让你痛苦，不如说自己的修养不够。

三、如果你不给自己烦恼，别人也永远不可能给你烦恼。因为你自己的内心，你放不下。

四、好好的管教你自己，不要管别人。

五、不宽恕众生，不原谅众生，是苦了你自己。

六、别说别人可怜，自己更可怜，自己修行又如何?自己又懂得人生多少?

八、福报不够的人，就会常常听到是非;福报够的人，从来就没听到过是非。

九、修行是点滴的工夫。

十、在顺境中修行，永远不能成佛。

十一、你永远要感谢给你逆境的众生。

十五、当你快乐时，你要想，这快乐不是永恒的。当你痛苦时你要想这痛苦也不是永恒的。

十六、认识自己，降伏自己，改变自己，才能改变别人。

十八、你可以拥有爱，但不要执著，因为分离是必然的。

十九、不要浪费你的生命在你一定会后悔的地方上。

二十、你什么时候放下，什么时候就没有烦恼。

二一、内心没有分别心，就是真正的苦行。

二二、永远不去只看众生的过错。你只看众生的过错，你永远污染你自己。

二五、每一种创伤，都是一种成熟。

二六、当你知道迷惑时，并不可怜，当你不知道迷惑时，才是最可怜的。

二七、狂妄的人有救，自卑的人没有救。

二八、你不要一直不满人家，你应该一直检讨自己才对。不满人家，是苦了你自己。

二九、一切恶法，本是虚妄的，你不要太自卑你自己。一切善法，也是虚妄的，你也不要太狂妄你自己。

三十、当你烦恼的时候，你就要告诉你自己，这一切都是假的，你烦恼什么?

三一、当你未学佛的时候，你看什么都不顺。当你学佛以后，你要看什么都很顺。

三二、你要包容那些意见跟你不同的人，这样子日子比较好过。你要是一直想改变他，那样子你会很痛苦。要学学怎样忍受他才是。你要学学怎样包容他才是。

三四、修行就是修正自己错误的观念。

三五、医生难医命终之人，佛陀难渡无缘的众生。

三六、一个人如果不能从内心去原谅别人，那他就永远不会心安理得。

三七、心中装满着自己的看法与想法的人，永远听不见别人的心声。

三八、毁灭人只要一句话，培植一个人却要千句话，请你多口下留情。

三九、当你劝告别人时，若不顾及别人的自尊心，那么再好的言语都没有用的。

四十、不要在你的智慧中夹杂着傲慢。不要使你的谦虚心缺乏智慧。

四一、根本不必回头去看咒骂你的人是谁?如果有一条疯狗咬你一口，难道你也要趴下去反咬他一口吗?

四二、忌妒别人，不会给自己增加任何的好处。忌妒别人，也不可能减少别人的成就。

四三、永远不要浪费你的一分一秒，去想任何你不喜欢的人。

四四、多少人要离开这个世间时，都会说出同一句话，这世界真是无奈与凄凉啊!

四五、恋爱不是慈善事业，不能随便施舍的。感情是没有公式，没有原则，没有道理可循的。

四六、请你用慈悲心和温和的态度，把你的不满与委屈说出来，别人就容易接受。

四七、创造机会的人是勇者。等待机会的人是愚者。

四八、能说不能行，不是真智慧。

四九、多用心去倾听别人怎么说，不要急着表达你自己的看法。

五十、同样的瓶子，你为什么要装毒药呢?同样的心理，你为什么要充满着烦恼呢?

五一、得不到的东西，我们会一直以为他是美好的，那是因为你对他了解太少，没有时间与他相处在一起。当有一天，你深入了解后，你会发现原不是你想像中的那么美好。

五二、这个世间只有圆滑，没有圆满的。

五三、修行要有耐性，要能甘于淡泊，乐于寂寞。

五四、活着一天，就是有福气，就该珍惜。当我哭泣我没有鞋子穿的时候，我发现有人却没有脚。

五五、多一分心力去注意别人，就少一分心力反省自己，你懂吗?

五六、眼睛不要老是睁得那么大，我且问你，百年以后，那一样是你的。

五七、欲知世上刀兵劫，但听屠门夜半声。不要光埋怨自己多病，灾祸横生，多看看横死在你刀下的众生又有多少?

五八、憎恨别人对自己是一种很大的损失。

五九、每一个人都拥有生命，但并非每个人都懂得生命，乃至于珍惜生命。不了解生命的人，生命对他来说，是一种惩罚。

六十、自以为拥有财富的人，其实是被财富所拥有。

六一、情执是苦恼的原因，放下情执，你才能得到自在。

六四、当你对自己诚实的时候，世界上没有人能够欺骗得了你。

六五、用伤害别人的手段来掩饰自己缺点的人，是可耻的。

六七、在你贫穷的时候，那你就用身体去布施，譬如说扫地、洒水、搬东西等，这也是一种布施。

六八、内心充满忌妒，心中不坦白，言语不正的人，不能算是一位五官端正的人。

六九、默默的关怀与祝福别人，那是一种无形的布施。

七十、多讲点笑话，以幽默的态度处事，这样子日子会好过一点。

七一、与人相处之道，在于无限的容忍。

七二、不要刻意去猜测他人的想法，如果你没有智慧与经验的正确判断，通常都会有错误的。

七三、要了解一个人，只需要看他的出发点与目的地是否相同，就可以知道他是否真心的。

七四、人生的真理，只是藏在平淡之中。

七五、不洗澡的人，硬擦香水是不会香的。名声与尊贵，是来自于真才实学的。有德自然香。

七六、与其你去排斥它已成的事实，你不如去接受它。

七七、佛菩萨只保佑那些肯帮助自己的人。

七八、逆境是成长必经的过程，能勇于接受逆境的人，生命就会日渐的茁壮。

七九、你要感谢告诉你缺点的人。

八十、能为别人设想的人，永远不寂寞。

八一、如果你能像看别人缺点一样，如此准确般的发现自己的缺点，那么你的生命将会不平凡。

八二、原谅别人，就是给自己心中留下空间，以便回旋。

八三、时间总会过去的，让时间流走你的烦恼吧!

八四、你硬要把单纯的事情看得很严重，那样子你会很痛苦。

八五、永远扭曲别人善意的人，无药可救。

八六、人不是坏的，只是习气罢了，每个人都有习气，只是深浅不同罢了。只要他有向道的心，能原谅的就原谅他，不要把他看做是坏人。

八七、说一句谎话，要编造十句谎话来弥补，何苦呢?

八八、其实爱美的人，只是与自己谈恋爱罢了。

八九、世界上没有一个永远不被毁谤的人，也没有一个永远被赞叹的人。当你话多的时候，别人要批评你，当你话少的时候，别人要批评你，当你沈默的时候，别人还是要批评你。在这个世界上，没有一个不被批评的。

九一、你目前所拥有的都将随着你的死亡而成为他人的，那为何不现在就布施给真正需要的人呢?

九二、为了赞美而去修行，有如被践踏的香花美草。

九三、白白的过一天，无所事事，就像犯了窃盗罪一样。

九四、能够把自己压得低低的，那才是真正的尊贵。

九五、广结众缘，就是不要去伤害任何一个人。

九六、沈默是毁谤最好的答覆。

九七、对人恭敬，就是在庄严你自己。

九八、拥有一颗无私的爱心，便拥有了一切。

九九、仇恨永远不能化解仇恨，只有慈悲才能化解仇恨，这是永恒的至理。

一00、你认命比抱怨还要好，对于不可改变的事实，你除了认命以外，没有更好的办法了。

范文四：dna测序技术-发展历史

DNA测序技术 - 发展历史

70年代末，WalterGilbert发明化学法、FrederickSanger发明双脱氧终止法手动测序，同位素标记

80年代中期，出现自动测序仪(应用双脱氧终止法原理)、荧光代替同位素，计算机图象识别

90年代中期，测序仪重大改进、集束化的毛细管电泳代替凝胶电泳

2001年完成人类基因组框架图

DNA测序技术 - 测序原理

DNA测序技术

化学修饰法测序原理

化学试剂处理末段DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离。化学切割反应:包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基的糖环处DNA断裂。

Sanger法测序的原理

就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

DNA测序技术 - 方法概述

3700型全自动遗传分析仪

生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起点，但却随机终止于特定的一种或者多种残基上。

由于DNA上的每一个碱基出现在可变终止端的机会均等，因些上述每一组产物都是一些寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA全片段上的位置所决定。

在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可从凝胶的放射自影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。

DNA测序技术，又叫基因测序技术。

人类基因组这部由A、T、G、C四个字母组成的卷帙浩繁的生命天书如同一座宝库，保藏着几千年来人们迫切想知道的秘密，DNA测序技术就好似“芝麻开门”这样的咒语，是我们打开宝库的金钥匙世界上第一个测定DNA序列的方法是由英国生化学家弗雷德里克?桑格尔发明的。自此DNA测序的速度就一直呈加速态势。2001年人类基因组草图耗资4.37亿美元，耗时13年。到了2007年，第一个完整人类基因组序列图谱的诞生只花费了150万美元，3个月就搞定。2009年1月2日，美国加州太平洋生物科学公司的科学家乔纳斯?考尔拉赫、斯蒂芬?特纳及其研究小组在《科学》杂志上发表论文称，他们将纳米技术与芯片技术相结合，发明了一种新型测序方法，速度是现有技术的3万倍。

DNA sequencing technology

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

非同位素银染测序系统操作技术

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到;电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。

DNA测序策略

Taq DNA聚合酶在95?时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95?变性、70?退火伸的循环模式。一般来说，较长的引物及gc含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，="">24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处:(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

范文五：DNA重组技术

四川大学

硕士研究生课程考试试卷

姓名_____ __学号_ _ 专业__ __ 研究方向 _

院、系（所）任课教师____等____

四川大学研究生院制

一、实验名称：DNA重组技术二、实验报告人：硕士

三、实验日期：2012年1月9号-1月12日地点：生化实验室

四、实验目的：在分子水平上，用人工方法提取或合成遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后通过载体把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达，按需要产生出不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。五、实验步骤：

DNA重组技术包括：①获得目的基因；②酶切；③与克隆载体连接，形成新的DNA重组分子；④用DNA重组分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；⑤对转化子筛选和鉴定。

详细步骤：

1、获得目的基因（略）。 2、酶切：

2.1 质粒酶切： Puc18(5ug) 2.5ul 10×buffer 2ul HindⅢ(15u) 5ul DDH2O 10.5ul 20ul

2.2 目的基因酶切： λDNA(5ug) 10ul 10×buffer 2ul HindⅢ(9u) 3ul DDH2O 5ul 20ul

3、质粒鉴定：1﹪琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1﹪琼脂糖40ml微波炉融化反复3次，稍冷却，加3ml golden view。在电泳槽中插好梳子，倒入凝胶，避免产生气泡。待凝固后，拔出梳子。向电泳槽中加入电泳缓冲液，淹没梳孔。

上样，每孔加入20ul（15ul样品+5ul loading buffer）。电泳：80v，40min，观察。（见图 1.） 4、凝胶回收：

4.1单一的目的DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量得0.42克。

4.2向胶块中加入3 倍体积溶胶液PN（共加入1269ul溶胶液），50℃水浴放置10 分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。

4.3将上一步所得溶液加入一个吸附柱中（吸附柱放入收集管中），13,000 rpm 离心30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。

4.4向吸附柱中加入700 μl 漂洗液PW（已加入无水乙醇），13,000 rpm 离心30 秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。

4.5向吸附柱中加入500 μl 漂洗液PW，13,000 rpm 离心30 秒，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，13,000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底地晾干。

4.6将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量 65–70℃ 水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2 分钟。13,000 rpm 离心1 分钟收集DNA 溶液。 5、连接：

λDNA 2ul 10×buffer 1ul T4连接酶(1u) 1ul DDH2O 6ul

10ul 16℃过夜。

6、转化：

100ul DH5α（大肠杆菌）

10ul 连接产物

7、提取质粒：将摇得的细菌提取质粒。

7.1柱平衡步骤：向吸附柱CP4 中（吸附柱放入收集管中）加入500 μL的平衡液BL，12000 rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.2取3ml 过夜培养的菌液加入离心管中，12000 rpm 离心1 min，尽量吸除上清。

7.3向留有菌体沉淀的离心管中加入500 μL

溶液Pl （已加入RNaseA ) ，使用移液器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

7.4向离心管中加入500μL溶液P2 ，温和地上下翻转6-8 次使菌体充分裂解。

7.5向离心管中加入700 μL溶液P3 ，立即温和地上下翻转6-8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm 离心10 min，此时在离心管底部形成沉淀。

7.6将上一步收集的上清液分次加入过滤柱Cs （过滤柱放入收集管中）, 12000rpm离心2 min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱CP4 中（吸附柱放入收集管中）。

7.712000rpm 离心l min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。

7.8向吸附柱CP4 中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心l min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。

7.9向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW（已加入无水乙醇），12000rpm离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP4 放入收集管中。

7.10向吸附柱CP4 中加入600μL漂洗液PW , 12000rpm离心l min，倒掉收集管中的废液。

7.11将吸附柱CP4 重新放回收集管中置于12000rpm离心2 min，将吸附柱中残余的漂洗液去除。

7.12将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100-300μL洗脱缓冲液TB ，室温放置2 min，12000rpm离心l min将质粒溶液收集到离心管中。 8、酶切：

Puc18+ λDNA重组产物 20ul

10×buffer 3ul HindⅢ 5ul DDH2O 2ul 30ul 37 ℃，1.5h。

9、电泳鉴定：上样，每孔加入30ul（25ul样品+5ul loading buffer）。

电泳：80v，40min，观察。（见图 3.）六、实验结果：

图 1. 第一次酶切电泳结果

图 2. 转化后长出的菌落，挑取较小的单个菌落。

图 3. 连接后酶切的电泳图，未见条带

七、讨论：失败的原因。

1、可能目的片段未转入puc18质粒中。 2、转化后挑菌时未选择到理想的菌落。

3、转化后质粒浓度较低，未能得到目的片段。

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