范文一:胰岛素的化学结构简述
胰岛素是胰岛β细胞分泌的一种由51个氨基酸组成的多肽类激素。胰岛β细胞首先在粗面内质网生成含102个氨基酸的前胰岛素原,其N末端的氨基酸顺序引导此多肽穿过内质网膜,同时切除16个氨基酸的引导序列而成为含86个氨基酸的胰岛素原,形成由许多高尔基囊组成的胰岛β颗粒。当β细胞接受刺激后,β颗粒移向细胞膜,并在蛋白水解酶的作用下,使胰岛素原分解脱下一段含35个氨基酸残基(第31位至第65位氨基酸)的连接肽并进一步在其氨基端和羧基端分别切下精一赖、精一精两对氨基酸,形成含31个氨基酸的C肽,和以β链(30个氨基酸残基)C末端与α链N末端(21个氨基酸残体基)以两对二硫键相连接构成的胰岛素。因此在分泌胰岛素的同时,总是有等克分子的C肽和少量的胰岛素原分泌。C肽既无胰岛素的生物活性,也无胰岛素的免疫原性质;而胰岛素原有3%的胰岛素活性,在免疫效应方面与胰岛素有交叉反应。
范文二:测定胰岛素一级结构的方案
标题:测定胰岛素一级结构的方案
姓名:
学号:
院系:
专业:
提交时间:2012年11月19日星期一
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
摘要:研究蛋白质结构与功能关系是目前分子生物学的重大课题之一,1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。1969年,基本与应用化学联合会规定以各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质基本结构。测定蛋白质(胰岛素)结构,主要要测定出:多肽链的数目;每条多肽链末端氨基酸的种类;每条肽链上氨基酸的种类,数目及连接顺序;链内于连间二硫键的数目与位置。至此,一种蛋白质的结构已基本明确。
关键字:胰岛素 一级结构 测定方法 化学法与酶解法
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,这是世界上第一个被确定一级结构的蛋白质。同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。生物化学由此迈向了一个更高层次——分子生物学时代。
, 胰岛素的一级结构
由51个氨基酸残基组成
分两条链:A链:21个氨基酸残基
B链:30个氨基酸残基
含三个二硫链:一个A链内的二硫
两个链间二硫键
, 胰岛素的功能:
胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质类激素促进肌肉、脂肪组织细胞膜对
葡萄糖的通透性
, 诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成,增强糖的分解代谢
, 促进肝、肌肉中糖原合成
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
, 抑制糖异生
, 促进糖转变为脂肪
, 抑制脂肪分解
人与各种动物胰岛素一级结构比较
表:一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异
名 称 A A A B 与人的差异数 活性 891030
人 苏氨酸 丝氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 -
猪 - - 丙氨酸 1 抹香鲸 - - 丙氨酸 1
马 - 甘氨酸 丙氨酸 2 ?
象 - 甘氨酸 缬氨酸 2 ?
牛 丙氨酸 - 缬氨酸 丙氨酸 3 ?
蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分
,S,定位等。 析以及,S
1.多肽链的分离
在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。
1)肽链的拆开
胰岛素分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,采用的方法:
巯基乙醇还原: 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后,可以使-S-S-定量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-。此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。
2)末端分析
(1)N-末端测定:
二甲基氨基萘磺酰氯法: 1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用,方法类似于Sangerpersonal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
的DNFB法(二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。),产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP 氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。
(2)C-末端分析:
肼解法: 这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中,100?下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺,则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解,以免释出的氨基酸混淆末端分析。
3)氨基酸组成分析
在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前,首先应了解它是由那几种氨基酸组成的,每种氨基酸有多少?分析组成的方法有:
离子交换层析法: Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸型的离子交换树脂,这是一种高分子量的固体聚苯乙烯,带有大量的功能基团,磺酸基在
+低pH和低离子强度条件下,根据氨基酸的酸碱性,氨基酸带正电,于是替换下树脂上的Na,借助静电作用而结合到磺酸基上。
由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同,因此当改变溶液pH和离子强度,便可依次将它们洗脱下来而分开,并进行定量测定。在此基础上发展了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的日益进展,氨基酸自动分析仪在样品的用量,分离速度及检测能力上也有了很大的提高。目前最好的仪器样品分析量只要几十Picomole,分析时间只要数十分钟,而且计算全部自动化,给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。
2.多肽链的降解
多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂,因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段,然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题,它要求裂解点少,选择性强,而且反应产率高,目前主要有化学法和酶解法两类。
化学法
溴化氰法: 是最理想的化学方法,能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键.
溴化氢化学降解法其优点:
?一般蛋白质含甲硫氨酸较少,由此可获得大片段;
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
?专一性强;
?产率高达80%以上;
?作用条件温和,在室温中用几到十几小时即可。
3.肽段的分离
大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法,由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。
4.肽的顺序分析
酶解法:分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析结果如下:
Ala?Phe+Gly?Lys?Asn?Tyr+Arg?Trp+His?Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val)
胰蛋白酶水解
Ala?Phe?Gly?Lys+Asa?Tyr?Arg+Trp?His?Val
将此两套寡肽可以做分析比较,因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val,因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下
寡肽号 氨基酸组成部分顺序
A-1 Ala?Pha
B-1 Ala?Phe?Gly?Lys
A-2 Gly?Lys?Asn?Tyr
B-2 Asn?Tyr?Arg
A-3 Arg?Trp
B-3 Trp?His?Val
A-4 His?Val
+肽顺序 Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
5.二硫键定位
蛋白质分子不经任何处理,直接用酶水解,检出其中二硫键的肽段,然后将二硫键拆开,分别测定两个肽的顺序,将此两肽结构与测出的一级结构比较,就能找出相应的二硫键的位置。
用酶直接水解变形的蛋白质: 由于二硫键只在偏酸性条件下才稳定存在,(在碱性条件下易发生交换),因此常用胃蛋白酶水解,且此酶专一性低,位点多,生成的肽段中包含二硫键的比较少,易于鉴定。
含-S-S-肽被分离后,即可进行肽段顺序分析,并与已测定的胰岛素的一级结构进行比较,即可找出相应的-S-S-位置,至此胰岛素的一级结构基本阐明。
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
参考文献
? 引自网上期刊: 作者 :网站原创 ,《蛋白质一级结构的测定方法》 ,2004年4月
27号.
? 引自期刊: 作者 :曹秋平 《中国科学》 ,1981 年版, 7:第886页.
? 引自百度文库.
personal and collective learning on your own, combining learning reading and discussion, read, learn, and understanding of the original principles, focused learning around topics discussion, ongoing positive and negative type education. Members should close their own thoughts, work, real life, comparing reflection and further improve the pertinence and effectiveness of learning, continue to unlock the buttons, correct wrong, think of practical realization in mind, party rules discipline, firm and correct political orientation, develop discipline, and being a qualified member of the adherence to the Constitution Party rules and political discipline. Second, "to do" as the key, seriously, do try to do, to set an example. Two lies in the doing. To learn to do, and the unity of knowledge, qualified party member, is the focus of this study and education and essential point. A qualified party members not only to watch his Constitution Party rules and talk to learn how, through, dark and light, and also what does he end up doing, is not a unity. This study and education, is essential to enhance the party's political awareness, awareness of overall, core, par. In learning education in the, each members are to control "told political, and has faith, do political qualified; told rules, and has discipline, do implementation discipline qualified; told moral, and has conduct, do conduct qualified; told dedication, and has as, do play role qualified" "four told four has" this put ruler, often measure himself, view himself, transformation himself, with actual action reflected learn of effectiveness, and reflected belief faith of power. To firm to to Central par, to XI General Secretary par, to party of theory, and route, and approach par, to Central of the decision deployment par, strongly maintenance Central of authority, maintenance XI General Secretary this core, strongly obey Central of concentrated unified led, in thought, and political
范文三:测定胰岛素一级结构的方案
标题:测定胰岛素一级结构的方案
姓名:
学号:
院系:
专业:
提交时间:2012年11月19日星期一
摘要:研究蛋白质结构与功能关系是目前分子生物学的重大课题之一,1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。1969年,基本与应用化学联合会规定以各种氨基酸按一定顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质基本结构。测定蛋白质(胰岛素)结构,主要要测定出:多肽链的数目;每条多肽链末端氨基酸的种类;每条肽链上氨基酸的种类,数目及连接顺序;链内于连间二硫键的数目与位置。至此,一种蛋白质的结构已基本明确。
关键字:胰岛素 一级结构 测定方法 化学法与酶解法
1953年,英国生物化学家Fred Sanger报道了胰岛素(insulin)的一级结构,这是世界
上第一个被确定一级结构的蛋白质。同年,Watson与Crick发现DNA的双螺旋结构。生物
化学由此迈向了一个更高层次——分子生物学时代。
, 胰岛素的一级结构
由51个氨基酸残基组成
分两条链:A链:21个氨基酸残基
B链:30个氨基酸残基
含三个二硫链:一个A链内的二硫
两个链间二硫键
, 胰岛素的功能:
胰岛素是由胰岛β细胞分泌的一种蛋白质类激素促进肌肉、脂肪组织细胞膜对
葡萄糖的通透性
, 诱导、促进肝脏葡萄糖激酶等合成,增强糖的分解代谢
, 促进肝、肌肉中糖原合成
, 抑制糖异生
, 促进糖转变为脂肪
, 抑制脂肪分解
人与各种动物胰岛素一级结构比较
表:一些哺乳动物胰岛素一级结构的差异
名 称 A A A B 与人的差异数 活性 891030
人 苏氨酸 丝氨酸 异亮氨酸 苏氨酸 -
猪 - - 丙氨酸 1 抹香鲸 - - 丙氨酸 1
马 - 甘氨酸 丙氨酸 2 ?
象 - 甘氨酸 缬氨酸 2 ?
牛 丙氨酸 - 缬氨酸 丙氨酸 3 ?
蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和顺序分
,S,定位等。 析以及,S
1.多肽链的分离
在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测蛋白质的纯度,使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分成几个多肽链。
1)肽链的拆开
胰岛素分子多肽链的连接有共价结合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多肽链,采用的方法:
巯基乙醇还原: 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8条件下室温保温几小时后,可以使-S-S-定量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性,多肽链松散成为无规则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-。此反应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的浓度必需在0.1-0.5摩尔。
2)末端分析
(1)N-末端测定:
二甲基氨基萘磺酰氯法: 1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法,采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用,方法类似于Sanger
的DNFB法(二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。),产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性较高(比FDNB法提高100倍,样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解稳定性较DNP 氨基酸高),可用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。
(2)C-末端分析:
肼解法: 这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中,100?下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺,则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解,以免释出的氨基酸混淆末端分析。
3)氨基酸组成分析
在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前,首先应了解它是由那几种氨基酸组成的,每种氨基酸有多少?分析组成的方法有:
离子交换层析法: Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸型的离子交换树脂,这是一种高分子量的固体聚苯乙烯,带有大量的功能基团,磺酸基在
+低pH和低离子强度条件下,根据氨基酸的酸碱性,氨基酸带正电,于是替换下树脂上的Na,借助静电作用而结合到磺酸基上。
由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同,因此当改变溶液pH和离子强度,便可依次将它们洗脱下来而分开,并进行定量测定。在此基础上发展了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的日益进展,氨基酸自动分析仪在样品的用量,分离速度及检测能力上也有了很大的提高。目前最好的仪器样品分析量只要几十Picomole,分析时间只要数十分钟,而且计算全部自动化,给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。
2.多肽链的降解
多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂,因此直接分析多肽的氨基酸顺序还是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段,然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题,它要求裂解点少,选择性强,而且反应产率高,目前主要有化学法和酶解法两类。
化学法
溴化氰法: 是最理想的化学方法,能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键.
溴化氢化学降解法其优点:
?一般蛋白质含甲硫氨酸较少,由此可获得大片段;
?专一性强;
?产率高达80%以上;
?作用条件温和,在室温中用几到十几小时即可。
3.肽段的分离
大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法,由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。
4.肽的顺序分析
酶解法:分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析结果如下:
Ala?Phe+Gly?Lys?Asn?Tyr+Arg?Trp+His?Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val)
胰蛋白酶水解
Ala?Phe?Gly?Lys+Asa?Tyr?Arg+Trp?His?Val
将此两套寡肽可以做分析比较,因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val,因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。如此类推如下
寡肽号 氨基酸组成部分顺序
A-1 Ala?Pha
B-1 Ala?Phe?Gly?Lys
A-2 Gly?Lys?Asn?Tyr
B-2 Asn?Tyr?Arg
A-3 Arg?Trp
B-3 Trp?His?Val
A-4 His?Val
+肽顺序 Ala?Phe?Gly?Lys?Asn?Tyr?Arg?Trp?His?Val
5.二硫键定位
蛋白质分子不经任何处理,直接用酶水解,检出其中二硫键的肽段,然后将二硫键拆开,分别测定两个肽的顺序,将此两肽结构与测出的一级结构比较,就能找出相应的二硫键的位置。
用酶直接水解变形的蛋白质: 由于二硫键只在偏酸性条件下才稳定存在,(在碱性条件下易发生交换),因此常用胃蛋白酶水解,且此酶专一性低,位点多,生成的肽段中包含二硫键的比较少,易于鉴定。
含-S-S-肽被分离后,即可进行肽段顺序分析,并与已测定的胰岛素的一级结构进行比较,即可找出相应的-S-S-位置,至此胰岛素的一级结构基本阐明。
参考文献
? 引自网上期刊: 作者 :网站原创 ,《蛋白质一级结构的测定方法》 ,2004年4月
27号.
? 引自期刊: 作者 :曹秋平 《中国科学》 ,1981 年版, 7:第886页. ? 引自百度文库.
名句赏析~~~~~
不限
主题
不限抒情四季山水天气人物人生生活节日动物植物食物
山有木兮木有枝,心悦君兮君不知。____佚名《越人歌》
人生若只如初见,何事秋风悲画扇。____纳兰性德《木兰词?拟古决绝词柬友》 十年生死两茫茫,不思量,自难忘。____苏轼《江城子?乙卯正月二十日夜记梦》 只愿君心似我心,定不负相思意。____李之仪《卜算子?我住长江头》 玲珑骰子安红豆,入骨相思知不知。____温庭筠《南歌子词二首 / 新添声杨柳枝词》 曾经沧海难为水,除却巫山不是云。____元稹《离思五首?其四》 愿得一心人,白头不相离。____卓文君《白头吟》
去年今日此门中,人面桃花相映红。____崔护《题都城南庄》
平生不会相思,才会相思,便害相思。____徐再思《折桂令?春情》 入我相思门,知我相思苦。____李白《三五七言 / 秋风词》
山无陵,江水为竭。冬雷震震,夏雨雪。天地合,乃敢与君绝。____佚名《上邪》 人生自是有情痴,此恨不关风与月。____欧阳修《玉楼春?尊前拟把归期说》 一往情深深几许,深山夕照深秋雨。____纳兰性德《蝶恋花?出塞》 两情若是久长时,又岂在朝朝暮暮。____秦观《鹊桥仙?纤云弄巧》 执子之手,与子偕老。____佚名《击鼓》
花自飘零水自流。一种相思,两处闲愁。____李清照《一剪梅?红藕香残玉簟秋》 问世间,情为何物,直教生死相许,____元好问《摸鱼儿?雁丘词 / 迈陂塘》 一日不见兮,思之如狂。____司马相如《凤求凰 / 琴歌》
人生如逆旅,我亦是行人。____苏轼《临江仙?送钱穆父》
世间无限丹青手,一片伤心画不成。____高蟾《金陵晚望》
林花谢了春红,太匆匆。无奈朝来寒雨,晚来风。____李煜《相见欢?林花谢了春红》 独立寒秋,湘江北去,橘子洲头。____**《沁园春?长沙》
身无彩凤双飞翼,心有灵犀一点通。____李商隐《无题?昨夜星辰昨夜风》 滚滚长江东逝水,浪花淘尽英雄。____杨慎《临江仙?滚滚长江东逝水》 怕相思,已相思,轮到相思没处辞,眉间露一丝。____俞彦《长相思?折花枝》 此情可待成追忆,只是当时已惘然。____李商隐《锦瑟》
思悠悠,恨悠悠,恨到归时方始休。____白居易《长相思?汴水流》 取次花丛懒回顾,半缘修道半缘君。____元稹《离思五首?其四》
若是前生未有缘,待重结、来生愿。____乐婉《卜算子?答施》
雨打梨花深闭门,忘了青春,误了青春。____唐寅《一剪梅?雨打梨花深闭门》 少年不识愁滋味,爱上层楼。爱上层楼。为赋新词强说愁。____辛弃疾《丑奴儿?书博山道中壁》
自在飞花轻似梦,无边丝雨细如愁。____秦观《浣溪沙?漠漠轻寒上小楼》 近水楼台先得月,向阳花木易为春。____苏麟《断句》
一骑红尘妃子笑,无人知是荔枝来。____杜牧《过华清宫绝句三首》 抽刀断水水更流,举杯消愁愁更愁。____李白《宣州谢脁楼饯别校书叔云 / 陪侍御叔华登楼歌》
疏影横斜水清浅,暗香浮动月黄昏。____林逋《山园小梅?其一》
人面不知何处去,桃花依旧笑春风。____崔护《题都城南庄》
时光只解催人老,不信多情,长恨离亭,泪滴春衫酒易醒。____晏殊《采桑子?时光只解催人老》
一生大笑能几回,斗酒相逢须醉倒。____岑参《凉州馆中与诸判官夜集》 天涯地角有穷时,只有相思无尽处。____晏殊《玉楼春?春恨》
问君能有几多愁,恰似一江春水向东流。____李煜《虞美人?春花秋月何时了》 似此星辰非昨夜,为谁风露立中宵。____黄景仁《绮怀》
菩提本无树,明镜亦非台。____惠能《菩提偈》
溪云初起日沉阁,山雨欲来风满楼。____许浑《咸阳城东楼 / 咸阳城西楼晚眺 / 西门》 春风得意马蹄疾,一日看尽长安花。____孟郊《登科后》
枯藤老树昏鸦,小桥流水人家,古道西风瘦马。____马致远《天净沙?秋思》 空山新雨后,天气晚来秋。____王维《山居秋暝》
人到情多情转薄,而今真个悔多情。____纳兰性德《山花子?风絮飘残已化萍》 同是天涯沦落人,相逢何必曾相识~____马致远《杂剧?江州司马青衫泪》 浮云一别后,流水十年间。____韦应物《淮上喜会梁川故人 / 淮上喜会梁州故人》
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主题不限抒情四季山水天气人物人生生活节日动物植物食物
山有木兮木有枝,心悦君兮君不知。____佚名《越人歌》
人生若只如初见,何事秋风悲画扇。____纳兰性德《木兰词?拟古决绝词柬友》 十年生死两茫茫,不思量,自难忘。____苏轼《江城子?乙卯正月二十日夜记梦》 只愿君心似我心,定不负相思意。____李之仪《卜算子?我住长江头》 玲珑骰子安红豆,入骨相思知不知。____温庭筠《南歌子词二首 / 新添声杨柳枝词》 曾经沧海难为水,除却巫山不是云。____元稹《离思五首?其四》 愿得一心人,白头不相离。____卓文君《白头吟》
去年今日此门中,人面桃花相映红。____崔护《题都城南庄》
平生不会相思,才会相思,便害相思。____徐再思《折桂令?春情》 入我相思门,知我相思苦。____李白《三五七言 / 秋风词》
山无陵,江水为竭。冬雷震震,夏雨雪。天地合,乃敢与君绝。____佚名《上邪》 人生自是有情痴,此恨不关风与月。____欧阳修《玉楼春?尊前拟把归期说》 一往情深深几许,深山夕照深秋雨。____纳兰性德《蝶恋花?出塞》 两情若是久长时,又岂在朝朝暮暮。____秦观《鹊桥仙?纤云弄巧》 执子之手,与子偕老。____佚名《击鼓》
花自飘零水自流。一种相思,两处闲愁。____李清照《一剪梅?红藕香残玉簟秋》 问世间,情为何物,直教生死相许,____元好问《摸鱼儿?雁丘词 / 迈陂塘》 一日不见兮,思之如狂。____司马相如《凤求凰 / 琴歌》
人生如逆旅,我亦是行人。____苏轼《临江仙?送钱穆父》
世间无限丹青手,一片伤心画不成。____高蟾《金陵晚望》
林花谢了春红,太匆匆。无奈朝来寒雨,晚来风。____李煜《相见欢?林花谢了春红》 独立寒秋,湘江北去,橘子洲头。____**《沁园春?长沙》 身无彩凤双飞翼,心有灵犀一点通。____李商隐《无题?昨夜星辰昨夜风》 滚滚长江东逝水,浪花淘尽英雄。____杨慎《临江仙?滚滚长江东逝水》 怕相思,已相思,轮到相思没处辞,眉间露一丝。____俞彦《长相思?折花枝》 此情可待成追忆,只是当时已惘然。____李商隐《锦瑟》
思悠悠,恨悠悠,恨到归时方始休。____白居易《长相思?汴水流》 取次花丛懒回顾,半缘修道半缘君。____元稹《离思五首?其四》 若是前生未有缘,待重结、来生愿。____乐婉《卜算子?答施》 雨打梨花深闭门,忘了青春,误了青春。____唐寅《一剪梅?雨打梨花深闭门》 少年不识愁滋味,爱上层楼。爱上层楼。为赋新词强说愁。____辛弃疾《丑奴儿?书博山道中壁》
自在飞花轻似梦,无边丝雨细如愁。____秦观《浣溪沙?漠漠轻寒上小楼》 近水楼台先得月,向阳花木易为春。____苏麟《断句》
一骑红尘妃子笑,无人知是荔枝来。____杜牧《过华清宫绝句三首》 抽刀断水水更流,举杯消愁愁更愁。____李白《宣州谢脁楼饯别校书叔云 / 陪侍御叔华登楼歌》
疏影横斜水清浅,暗香浮动月黄昏。____林逋《山园小梅?其一》 人面不知何处去,桃花依旧笑春风。____崔护《题都城南庄》
时光只解催人老,不信多情,长恨离亭,泪滴春衫酒易醒。____晏殊《采桑子?时光只解催人老》
一生大笑能几回,斗酒相逢须醉倒。____岑参《凉州馆中与诸判官夜集》 天涯地角有穷时,只有相思无尽处。____晏殊《玉楼春?春恨》 问君能有几多愁,恰似一江春水向东流。____李煜《虞美人?春花秋月何时了》 似此星辰非昨夜,为谁风露立中宵。____黄景仁《绮怀》
菩提本无树,明镜亦非台。____惠能《菩提偈》
溪云初起日沉阁,山雨欲来风满楼。____许浑《咸阳城东楼 / 咸阳城西楼晚眺 / 西门》 春风得意马蹄疾,一日看尽长安花。____孟郊《登科后》
枯藤老树昏鸦,小桥流水人家,古道西风瘦马。____马致远《天净沙?秋思》 空山新雨后,天气晚来秋。____王维《山居秋暝》
人到情多情转薄,而今真个悔多情。____纳兰性德《山花子?风絮飘残已化萍》 同是天涯沦落人,相逢何必曾相识~____马致远《杂剧?江州司马青衫泪》
浮云一别后,流水十年间。____韦应物《淮上喜会梁川故人 / 淮上喜会梁州故人》
论诗三十首?其四
(53人评分) 8.7
朝代:金朝
作者:元好问
原文:
一语天然万古新,豪华落尽见真淳。
南窗白日羲皇上,未害渊明是晋人。
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译文
陶渊明的诗语言平淡、自然天成,摒弃纤丽浮华的敷饰,露出真朴淳厚的美质,令人读来万古常新。陶渊明自谓自己是上古时代的人,但并未妨碍他仍然是个晋人。? 参考赏析
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赏析
这首诗是元好问评晋代诗人陶渊明。出于对当时诗坛雕琢粉饰、矫揉造作诗风的反感,元好问评论晋代诗人陶渊明时前两句说:“一语天然万古新,豪华落尽见真淳。”元好问崇尚陶渊明诗歌自然天成而无人工痕迹,清新真淳而无雕琢之弊。陶渊明的诗句自然质朴不假修饰,剥尽铅华腻粉,独见真率之情志,具有真淳隽永、万古常新的永恒?
作者介绍
元好问
元好问 元好问,字裕之,号遗山,太原秀容(今山西忻州)人;系出北魏鲜卑族拓跋氏,元好问过继叔父元格;七岁能诗,十四岁从学郝天挺,六载而业成;兴定五年(1221)进士,不就选;正大元年(1224 ),中博学宏词科,授儒林郎,充国史院编修,历镇平、南阳、内乡县令。八年(1231)秋,受诏入都,除尚书省掾、左司都事,转员外郎;金亡不仕,元宪宗七年卒于获鹿寓舍;工诗文,在金元之际颇负重望;诗词风格沉郁,并多伤时感事之作。其《论诗》绝句三十首在中国文学批评史上颇有地位;作有《遗山集》又名《遗山先生文集》,编有《中州集》。...
范文四:【新品速递:德谷胰岛素】德谷胰岛素的分子结构
德谷胰岛素的研发背景
生理性的基础胰岛素控制空腹和两餐间血糖,其分泌相对平稳和持久。为了模拟这种分泌特性,既往,人们通过改变胰岛素制剂的成分,如加入鱼精蛋白(如低精蛋白锌胰岛素)或增加锌离子的浓度(如Lente?)来延长胰岛素的作用时间。
当代基础胰岛素类似物的研发则主要是通过改变胰岛素分子的氨基酸结构(如甘精胰岛素、地特胰岛素)等方法来实现长效的作用模式1。理想的基础胰岛素制剂在达到稳态时应具有平稳的、覆盖全天24小时的药代/药效学特性。为了进一步满足临床的需求,诺和诺德公司研发了超长效基础胰岛素类似物——德谷胰岛素。
德谷胰岛素的分子结构
德谷胰岛素是在人胰岛素分子的骨架上,去掉了B链30位的苏氨酸,在B29位的赖氨酸上,通过一个L-γ-Glu连接子,与16碳的脂肪二酸侧链相连(如图)。在锌离子的作用下,德谷胰岛素单体聚合成六聚体。
图:德谷胰岛素的分子结构
在胰岛素制剂中,由于苯酚的存在(作为抑菌剂),德谷胰岛素六聚体的一端处于开放状态,可与另一个六聚体相互作用,形成稳定的双六聚体。
皮下注射后,随着苯酚的弥散,德谷胰岛素双六聚体的两端打开,相互作用,形成独特的多六聚体长链2。
参考文献
Kurtzhals et al. Int J Obes 2004; 28: S23-8
Jonassen et al. Pharm Res 2012; 29: 2104–14
《新品速递:德谷胰岛素》介绍:
为了让广大医学专业人士更系统的了解新一代基础胰岛素类似物——德谷胰岛素,诺和诺德医学事务团队推出了全新的学术版块——《新品速递:德谷胰岛素》。该版块集中报道德谷胰岛素的结构特点、作用机制、临床研究等学术信息,每月发布2期,全年共24期,欢迎大家关注 。
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范文五:胰岛素一级结构的测定方法
胰岛素一级结构的测定方法 胰岛素是生物体内的一种蛋白质,胰岛素是由胰岛 β 细胞受内源性或外 源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的 一种蛋白质激素。胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,同时促进糖原、 脂肪、蛋白质合成。所以研究蛋白质的一级结构测定方法就可以知道胰岛 素的一级结构的测定方法。 蛋白质分子的一级结构测定,概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段 的分离和顺序分析以及,S,S,定位等。我们以牛胰岛素为例 一级结构的测定方法可概述如下: 1. 多肽链的分离 在测定一个蛋白质的结构以前,首先必须保证被测 蛋白质的纯度,使结 果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基数,按照其亚基数将蛋白质分 成几个多肽链。 1二硫键的拆开 蛋白质分子多肽链的连接有共价结合和非 共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接 的多肽链,我们采用巯基乙醇还原的方法。 利用还原剂巯基乙醇亦可使蛋白质的-S-S- 断裂。当高浓度的巯基乙醇在 pH8条件下室 温保温几小时后, 可以使-S-S-定量还原为桽 H。 与此同时反应系统中还需要有 8 摩尔脲或 6 摩 尔盐酸胍使蛋白质变性, 多肽链松散成为无规 则的构型,此时还原剂就可作用于-S-S-。 此反 应是可逆的,因此要使反应完全,疏基乙醇的 浓度必需在 0.1-0.5 摩尔。 2)稳定还原蛋白 还原蛋白不稳定,SH 基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定 SH 基的方法 有几种任选一种即可: A烷基化试剂使 SH 基转变为稳定的硫醚衍生物。 如果碘代乙酰胺代替碘代乙酸,其产物 S 磺代乙酸也可与组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应,但反应条件不同,可 通过各种 pH 及反应时间进行控制。 B氨乙基化1 蛋白质分子的几条肽链若以非共价健结合,则用尿素、盐酸胍等变性剂 即可拆开。蛋白质的多肽链被拆开后,将它分离纯化,一般多用凝胶过滤、 离子交换、电泳等方法,兹不赘述。 分离纯化后的每条肽链还要进一步分析其末端。 3末端分析了解有几条肽链 其方法较多,这里我们只介绍较常用的几种。 1N-末端测定 A.二硝基氟苯法FDNB,DNFB: 1945 年 Sanger 提出此方法,是他的重要贡献之一。DNP-氨基酸用有机 溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger 用此方法测定 了胰岛素的 N 末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。 B.氰酸盐法: 1963 年 Stank 及 Smyth 介绍了一种测定 N 由于乙内酰脲氨基酸不带电荷,因此可用离子交换层析法将它与游离氨基 酸分开,分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解,重新生成游离的氨基 酸,鉴别此氨基酸即可了解 N-末端是何种氨基酸。 C.二甲基氨基萘磺酰氯法: 1956 年 Hartley 等报告了一种测定 N-末端的灵敏方法,采用 1-二甲基 氨基萘-5-磺酰氯,简称丹磺酰氯。它与游离氨基末端作用,方法类似于 S anger 的 DNFB 法,产物是磺酰胺衍生物。丹磺酰链酸具有强烈的黄色荧 光。 此法优点为灵敏性较高比 FDNB 法提高 100 倍, 样品量小于 1 毫微克 分子及丹磺酰氨基酸稳定性较高对酸水解稳定性较 DNP ,可 用纸电泳或聚酰胺薄膜层析鉴定。 2C-末端分析 A.肼解法: 这是测定 C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中,100?下进行反 应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成 氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其 分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨 酰胺,则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任 何少量的水解,以免释出的氨基酸混淆末端分析。 B.羧肽酶水解法: 羧肽酶可以专一性地水解羧基末端氨基酸。根据酶解的专一性不同,可 区分为羧肽酶 A、B 和 C。应用羧肽酶测定末端时,需要事先
进行酶的动 力学实验,以便选择合适的酶浓度及反应时间,使释放出的氨基酸主要是 C 末端氨基酸。1 4氨基酸组成大致分析 在进一步分析多肽链的氨基酸顺序之前,首先应了解它是由那几种氨基 酸组成的,每种氨基酸有多少分析组成的方法有: ?层析法 将多肽链完全酸水解成游离氨基酸,然后进行 Dansyl 标记,聚酰胺薄 膜层析,此方法在蛋白质结构分析中是一种超微量的分析术,但此方法用 于定量分析尚不够准确。 ?离子交换层析法 Spaekman 等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们采用磺酸 型的离子交换树脂,这是一种高分子量的固体聚苯乙烯,带有大量的功能 基团,磺酸基在低 pH 和低离子强度条件下,根据氨基酸的酸碱性,氨基 酸带正电,于是替换下树脂上的 Na,借助静电作用而结合到磺酸基上。 由于各种氨基酸在树脂上的亲和力不同,因此当改变溶液 pH 和离子强 度,便可依次将它们洗脱下来而分开,并进行定量测定。在此基础上发展 了氨基酸自动分析仪。随着科学技术的日益进展,氨基酸自动分析仪在样 品的用量,分离速度及检测能力上也有了很大的提高。目前最好的仪器样 品分析量只要几十 Picomole分析时间只要数十分钟,而且计算全部自动化, 给研究蛋白质一级结构带来了极大的方便。 2.多肽链的降解 多肽链的氨基酸组成往往是比较复杂,因此直接分析多肽的氨基酸顺序 还是很困难的,多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段,然后再行分 析。肽键的裂解是一级结构研究工作中的重要问题,它要求裂解点少,选 择性强,而且反应产率高,目前主要有化学法和酶解法两类。 1化学法 1溴化氰法 是最理想的化学方法,能选择性断裂甲硫氨酸所在的肽键1 2部分酸水解法 Sanger 在分析胰岛素的一级结构中采用了此法,即用 0.1N 盐酸在 110? 或用 6N 盐酸在 37?水解。这种部分酸水解的方法特异性不强,因此对大 片段的蛋白质和肽均不合适。 3羟胺法 这种方法近十年来开始受人注意,羟胺能专一性地裂解 Asn Gly 的 肽键,酸性条件下裂解 Asn-Pro 肽键。已用于某些蛋白质的分析。 4N-溴代琥珀酰亚胺法 主要裂解 Try 处的肽键,五十年代研究较多。但由于它也能断裂 Tyr His 肽键,因此应用不广。 2酶解法 酶水解法较化学法具有更多的优越性,使用也更广泛。因其具有较高专 一性,而且水解产率较高,所以可以选择各种不同专一性的酶进行专一性 的断裂。常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。 蛋白水解酶的专一性 酶 来源 主要作用点 其它作用点 胰蛋白酶 胰 Arg,Lys Leu,Met,His,Asu, 糜蛋白酶 胰 Tyr,Phe,Trp Gln 弹性蛋白酶 胰 Leu,Ile,Ala 其它等 Tyr,Phe,Trp,Met, Ala,Glu,Asp,其 胃蛋白酶 胃粘膜 Len 它等 Papayplant 木瓜 木瓜蛋白酶 Arg,Lys,Gly 其它等 植物 嗜热解蛋白芽孢 嗜热菌蛋白酶 Leu,Ile,Phe Val,Tyr 杆菌 枯草杆菌蛋白 枯草杆菌 芳香族及脂肪族残基 酶 肽链的裂解和重组大致有三种情况: 一种是非特异性裂解,如酸水解。由于裂解的片段较小,造成分离的困难。因此这种非特异性裂解对大分子肽链是不适用的。第二种是特异性裂解,采用两种以上的专一裂解,然后进行组合,这种方法一般也适用于分子量小于 5 万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂解,首先将某种氨基酸进行化学修饰,使水解酶专一断裂某一种氨基酸,分成若干片段,然后解除化学封闭,再用此酶裂解,使曾被封闭过的氨基酸断裂。目前倾向于采用这种裂解方式。1 3.肽段的分离 大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法,由于大分子肽溶解度小。往往 采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一 般纯度不高,常需辅以离子交换层析法,大片段肽可用离子交换葡聚糖作 载体,小肽则多用
Dowex-50 等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析 相结合的指纹图谱法,得到纯净肽。 4.肽的顺序分析 在蛋白质一级结构的测定中,肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺 序分析也有化学法和酶解法两种。 1 Edman 降解法 这是目前用于顺序分析的最主要的方法。它的原理是从 N 端开始,逐 步降解。将肽先与异硫氰酸苯酯PTH 试剂在 pH8-9 条件下作用,肽的 N H2 末端接到异硫氰酸苯酯的 C 原子上生成苯异硫甲氨酰肽,简称 PTC 肽,在强酸作用下,可使靠近 PTC 基的氨基酸环化,肽键断裂形成苯氨基 噻唑啉酮衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不被破坏,因而又可 出现一个新的 N,末端。重复以上的步骤,继续与 PTH 试剂作用,继续分 析,苯氨基噻唑啉酮衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。但此衍 生物很不稳定,在水中可转化为稳定的乙邗,搅螂灏被酨TH,氨基酸。 这些步骤通常称为 Edman 氏逐步降解法。 所以可用来测定氨基酸的排列顺 序。Edman 降解法的优点是样品用量少,灵敏度高。 PTH,氨基酸的鉴定可以用各种层析方法,如纸层析、薄层层析、气相 层析和质谱法等,现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点, 但是由于操作繁琐,工作量大,所以目前有人根据 Edman 降解的原理作一 系列改进。 下面简单介绍几种方法 A.1967 年 Edman 及 Begg 介绍了一种 Edman 降解的液相自动分析装置, 使顺序分析开始走向自动化。 将样品先在反应杯内旋转成薄膜,使之固定。 然后与 PITC 试剂反应。再用有机溶剂多次抽提除去过剩试剂,因而样品 易丢失,且仪器昂贵,使用受到限制。 B.1970 年 Laursen 改进为固相氨基酸顺序仪。此法样品用量少,检出灵 敏,可分析 200 肽,其原理是将肽共价结合到惰性支持物上,固定后装柱 再行 Edman 降解。 C.另外也有从化学反应的角度考虑,试图改进 Edman 方法。1976 年有 酸盐简称 DABITC。 产物 DABIH 这是一种有色试剂, 因此鉴定时无需染色,用肉眼即可分辨。此方法灵敏度很高,一次分析小1 肽段只要几个 nanomole 样品即可,是目前一种很可取的方法。此外也有人 将异硫氰酸酯进行 35 S 标记,使分析样品更向微量化方向发展。 2 分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂 成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装 配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜 蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡 肽。分析结果如下: AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal 糜蛋白酶水解 肽
AlaPheGlyLysAsnTyrArgTrpHisVal 胰蛋白酶水解
AlaPheGlyLysAsaTyrArgTrpHisVal 将此两套寡肽可以做分析比较,因为十肽的 N 末端及 C 末端已事先测 定分别为 Ala 及 Val,因此第一段寡肽必然是 AlaPhe 寡肽号 氨基酸组成部分顺序 A-1 AlaPha B-1 Ala Gly Phe Lys A-2 Lys Gly Asn Tyr
B-2 Tyr Asn Arg A-3 ArgTrp B-3 His Trp Val A-4 HisVal 肽顺序 Ala Gly Asn Arg His Phe Lys Tyr Trp Val 水解酶也可运用二肽酶,两组可用同一种酶水解如第一套肽是 A 桞,C 桪,E 桭,G 桯……第二套肽水解则先将该肽段 N 酸,然后再开始二肽酶断裂,结果是 A,B 桟,D 桬,F 杯……这样分析 比较也可排列出肽段顺序。 5.二硫键定位 蛋白质分子不经任何处理,直接用酶水解,检出其中二硫键的肽段,然 后将二硫键拆开,分别测定两个肽的顺序,将此两肽结构与测出的一级结 构比较,就能找出相应的二硫键的位置。 含二硫键肽的检出方法。 1 凝胶过滤或离子交换层析:1 用以分离各肽段,然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的
肽。 2 对角线电泳或层析: 1966 年 Brown 及 Hartlay 提出用对角线电泳进行含,S-S-肽的定位,此 方法是将水解后的肽混合物进行第一相电泳,样品点在中间,电泳毕,将 样品纸条剪下,置于装有过甲酸的器皿中,用过甲酸蒸气处理 2 小时,使- S-S-断裂,此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸 上,进行第二相电泳电泳,电泳条件与第一相相同,只是与第一次方向成 直角。在第二相电泳中,那些不含-S-S-的髣民泳情况与第一相相同,因此 电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上,而那些含-S-S-的肽由于被氧化,电 荷发生变化,第二相电泳速度就与第一相不同,电泳结果这些肽斑就偏离 对角线,肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快,操作简便以及能 用于小分子样品,是直接分离-S-S-肽的好方法。 含-S-S-肽被分离后,即可进行肽段顺序分析,并与已测定的该蛋白质 的一级结构进行比较,即可找出相应的-S-S-位置,至此蛋白质的一级结构 基本阐明。 6.总结数据得出胰岛素的一级结构 今后蛋白质一级结构的测定正朝自动化、快速化及微量化发展,关键问 题仍然是进一步寻找蛋白裂解和肽分离的方法。 蛋白质一级结构的测定不断有新方法和新思路出现,如 X 衍射法测定 一级结构;分离相应蛋白质的 mRNA,由 mRNA 的一级结构排出蛋白质的 一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定,使人们 掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。1
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