范文一：动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器

动物物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。

乳腺生物反应器生产的外源蛋白种类广泛，从小分子肽到大分子复杂蛋白质，从生物活性酶到抗体、病毒抗原蛋白均可有效生产。利用动物乳腺生物反应器生产重组蛋白的优点有：（1）生物活性高，无污染。动物乳腺有完整的蛋白质翻译后修饰系统，包括糖基化、磷酸化、羧基化等，从而保证了产品的高生物活性。（2）易分离提纯，成本低廉。现有的一些人药物蛋白之所以昂贵，除了原料难以收集外，另一原因是分离提纯极为困难成本极高。而动物乳腺生物反应器的产物直接经乳汁分泌出体外，只需用常规方法除去酪蛋白沉淀乳清，再经层析即可得到重组蛋白，已经建立起完整的分离纯化生产程序。（3）产量高。外源基因在动物乳腺中的表达量可以达到每升几克到几十克，小群转基因大家畜的产量即可满足全世界市场的需求。动物乳腺生物反应器已经成为生物技术领域最具开发应用前景的尖端方向。

动物乳腺生物反应器发展简史 转基因动物的研究始于20世纪80年代初。1980年，Gordon等将重组DNA用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。1982年，Palmiter等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠2 倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。此后几年的许多研究奠定了转基因动物技术体系的基础，但真正的乳腺生物反应器研究则始于1987 年Gordon 等的工作，他们将组织型纤溶酶原激活剂（tPA）与小鼠乳清酸蛋白（WAP）基因的启动子构成重组基因，成功地培育出了37只在乳汁中能表达tPA 的转基因小鼠，同年，世界上第一只能从乳汁中分泌α1-抗胰蛋白酶（AAT）的转基因绵羊在英国罗斯林研究所诞生。从此，开始了乳腺生物反应器的实用性研究。

Simons等（Simons等，1987年）将带MT启动子的β-乳球蛋白-凝血因子IX（BLG-FIX）、BLG-AAT 等重组DNA片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。Wilmut等将羊乳球蛋白基因片段与F-IX和AAT-cDNA 融合质粒注入小鼠及绵羊受精卵中，获得乳汁中含F-IX 和AAT 的转基因小鼠及绵羊。Wright等将绵羊BLG基因调控区与人AAT基因相连，获得了 4 只转基因绵羊。Velander 等利用WAP 基因启动子与人蛋白质C（hPC）cDNA 重组基因获得的转基因猪，重组hPC的表达量（1g/L）比人血中hPC 浓度还高200倍。Ebert等用β-CA基因的启动子引导tPA在山羊乳汁中得到表达（1-3g/L）。Wilmut等（Wilmut等，1997年）首创体细胞克隆技术并成功构建了表达人F-IX的转基因克隆绵羊。2000年，英国PPL 公司将人类AAT 基因定点整合到胎儿成纤维细胞的前胶原基因座，用转基因细胞生产的转基因打靶绵羊（McCreath等；2000年）；2001年，他们又利用基因打靶技术生产出了AAT、3-GT 和朊病毒双剔除的克隆绵羊。上述研究可以看出，乳腺生物反应器研究从模式动物——小鼠的转基因开始，逐步建立起了大动物乳腺生物反应器制备的技术平台。

我国的施履吉院士在20世纪80年代初就提出了乳腺生物反应器的构想并获得了表达乙肝病毒表面抗原的转基因兔。1996 年10 月，复旦大学遗传所和上海医学遗传所合作成功地获得了表达有活性的F-IX蛋白的转基因小鼠和5只转基因绵羊，真正开始了我国的乳腺反应器构建工作。1998年，上海医学遗传研究所构建成以牛酪蛋白基因启动子驱动F-IX基因表达的表达载体，显微注射到山羊受精卵的雄原核，成功制

备了5头转基因羊。上海医学遗传研究所于1999年2月，得到一头带有人血清白蛋白基因的转基因牛。2000年，中国农大和北京兴源生物科技中心合作，将改造的人AAT 基因显微注射到山羊受精卵原核中，获得了3只带有人AAT 的转基因山羊。近几年来的成功报道仍限于显微注射等常规方法，离国外尚有一定差距。

表达载体

制备乳腺生物反应器的关键是保证目的蛋白特异性在乳腺中的高效表达，传统表达载体都是选用某种乳蛋白基因的调控序列作为启动子元件。目前，已经克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主要有β-乳球蛋白（BLG）基因、aS1-酪蛋白基因、β-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清白蛋白基因。

目的基因

十多年来，已有数种高价值的产品在大动物乳汁中生产出来，于小鼠乳腺中获得表达的产品更是多达数百种。从国际大公司开发的情况可以看出，高经济价值的医用蛋白和营养蛋白是重要的研发对象，如AT一Ⅲ、AAT、蛋白C、乳铁蛋白、乳糖酶等都已进入了三期或二期临床试验阶段。选择目的基因应当首先考虑那些正常情况下来源困难或浓度低，其他表达系统难以生产且I临床应用前景广阔的蛋白基因。可以预见，由于细胞工程和基因治疗技术的发展，细胞因子类产品将不会通过动物乳腺反应器生产，而用途更广、需求量更大的治疗性抗体、营养蛋白和工程酶将成为制备乳腺生物反应器的首选靶蛋白。另外，若能建立起稳定的转基因家畜群，以乳腺反应器生产基因工程疫苗，不仅生产效率可观，而且可直接以乳汁进行临床免疫，达到方便快捷的目的。

动物乳腺生物反应器的关键技术：转基因技术 现有的应用于动物乳腺生物反应器制备的转基因技术主要有：

1 显微注射法 2 逆转录病毒介导法 3 配子介导法 4 胚胎干细胞（ES）介导法 5 核移植介导法

还有利用同源重组原理发展起来的基因打靶（敲除）技术，结合体细胞克隆，正成为动物乳腺生物反应器制备的新研究热点。

在乳腺反应器研制中尚存在下述待解决的难题：（1）转基因动物的成功率低。（2）目的蛋白的表达水平远低于乳汁中总蛋白含量。（3）目的基因的分离、改造、载体构建、体细胞克隆等技术环节还不够成熟。（4）“位置效应”与“剂量效应”目前无法克服。

（5）乳汁蛋白基因表达调控机理、目的基因在宿主染色体上整合的详细机制、基因表达调控元件在不同家畜表现差异的原因、乳腺细胞对蛋白质的加工修饰机理等还未弄清。（6）产品的安全性的问题，外源基因侵入对动物和基因药物对人体正常功能有何影响，否会造成基因污染，尚难定论。

虽有这些问题存在，但许多国家政府和大型制药企业仍竞相投入巨资资助乳腺生物反应器产品的开发和生产，使乳腺反应器研制和产业化呈现日益加速的趋势。利用乳腺反应器生产营养活性蛋白，如需求量极大的护肤品中的活性蛋白，或者改造奶质而使其具备营养和药用双重功能，或者直接生产口服生物制品，都具有极大的市场潜力。我们相信乳腺生物反应器产业不仅会成为有高额利润回报的新型行业，而且将会带动整个国民经济的发展，形成全新的产业结构模式。因此，我们应当抓住机遇，增加投资力度，大力兴办乳腺反应器产业，以在未来的生物高技术竞争中夺得主动权。

2006年6月2日，对于欧洲患有先天性抗凝血酶缺失症的病人们是一个好日子，世界上第一个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名：ATryn ）的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定批准意见，该重组蛋白药物将在未来3个月内开始销售。

ATryn 的主要成分——重组人抗凝血酶Ⅲ具有抑制血液中凝血酶活性，预防和治疗急慢性血栓血塞形成，对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果，据估计该药全球潜在市场每年高达1.5亿美元。人抗凝血酶Ⅲ是一种人血液中重要的抗凝血因子，但是，作为药物很难从人血中提取该酶，而且由于该酶分子结构复杂，利用微生物发酵系统往往不能表达出这种酶或者表达出的重组蛋白活性丧失，而利用哺乳动物细胞培养体系则成本太高，产量也较低，无法满足该药的临床需求。20世纪80年代中后期发展起来的转基因动物乳腺生物反应器体系则为生产这些分子结构复杂而且临床需求大的重组蛋白药物提供了可靠途径。

ATryn 是由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业美国Genzyme转基因公司研制成功的，该药物最神奇之处在于重组人抗凝血酶Ⅲ不是从天然物质中提取，也不是通过微生物发酵或哺乳动物细胞培养基因工程制药体系生产，而是从转基因山羊奶液中生产出来的，即利用一种新的基因工程制药技术——转基因动物乳腺生物反应器制药技术生产的。美国Genzyme转基因公司从1990年开始即致力于发展转基因山羊乳腺生物反应器技术生产重组人抗凝血酶Ⅲ，攻克了从转基因绵羊生产、重组蛋白表达研究、重组蛋白纯化、临床试验、上市申请到产品生产等环节的诸多技术和非技术障碍，最终使得ATryn 成为世界上第一个动物乳腺生物反应器生产的基因工程新药。而该药物一旦上市，将掀起制药业的一场革命，也将开辟生物制药业的新纪元——即转基因动物乳腺生物反应器制药将逐渐取代低效的细菌发酵制药和高成本的哺乳动物细胞制药，成为最主要的基因工程制药技术。

动物乳腺生物反应器制药技术是一种利用基因工程技术将目的基因与奶蛋白基因启动子构建成新的重组基因，然后将该重组基因转入动物细胞或受精卵基因组中并发育成转基因动物，发育成熟后在其乳腺中分泌出重组蛋白，这些重组蛋白可开发成重组药物的高新技术。为什么转基因动物乳腺生物反应器制药将成为最主要的基因工程制药技术呢？那是因为该制药技术具有其他技术无与伦比的优势。一是产出高产品活性高：乳腺组织是一种高效的产奶器官，一头奶牛一年可产奶8000～10000升，而一只绵羊和山羊也可产奶800～1000升，以最低表达量1克/升的重组蛋白计算（即转基因动物奶液中重组蛋白的含量，

一般为1～20克/升），一头奶牛一年就可生产8～10公斤重组蛋白，而哺乳动物细胞培养系统重组蛋白表达量为0.1～1克/升，一头奶牛重组蛋白年产量相当于1000升的发酵罐；而且动物乳腺生物反应器可以生产结构复杂分子量大的蛋白，而且生产的重组蛋白药物生理活性好，与人同源性高，非常接近天然产品。二是成本低、周期短：由于动物乳腺生物反应器生产重组蛋白不需要昂贵的生产设备（如发酵罐），动物饲养和繁殖成本都比较低，国外经济学家曾算过一笔账，若用其他生产工艺（如哺乳动物细胞培养方法）来生产1克药物蛋白质，成本需800～5000美元，而利用转基因动物只需0.02～0.5美元；目前一种新药由研制开发到上市，需15～20年，转基因动物制药则可缩短到5年。三是不耗能、无污染：该技术基本上为一畜牧业过程，虽饲养环境要求特别洁净，但仍是给牛羊草料，由牛羊奶中提取药品，因此蛋白生产过程不需昂贵设备，不消耗能源，不会产生工业废料，也不会对环境产生污染，因此动物乳腺生物反应器制药技术是一种可持续发展的新型生物制药技术。由于动物乳腺生物反应器制药技术具有如此巨大的优势，将成为一种产业化潜力巨大的高新技术，也是国内外政府和企业的研究和开发热点。据美国权威机构预测，到2010年，转基因动物生产的重组蛋白产品销售额将达到350亿美元，生产的药物将占整个基因工程药物种类的90%以上。

目前全世界有二三十家公司致力于开发动物乳腺生物反应器重组蛋白药物，除重组人抗凝血酶Ⅲ外，目前世界上还有利用转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器生产的人α-抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺气肿药物）、重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（抗栓药）和人C1抑制剂（治疗血管神经性水肿的药物）等重组蛋白药物也已经完成或进入临床Ⅲ期试验，特别是治疗性抗体药物，发展潜力更大。还有10多种重组蛋白药物处于临床研究，另有上百种重组蛋白处于研发阶段。因此第一个动物乳腺生物反应器蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ获准上市，预示着其他药物的审批将加快，研发周期将缩短，在未来几年内，将有多种动物乳腺生物反应器重组蛋白药物上市，从而形成市场前景广阔和利润巨大的新生物制药产业。

在这一新的基因工程制药革命浪潮中，我国也不甘落后。1980年初，我国就已经开始了转基因动物和动物乳腺生物反应器研究。由于动物乳腺生物反应器制药技术具有高产出、高活性、低成本、周期短、不耗能、无污染等优点，因此国家对该领域的研究给予了大力支持。在“九五”和“十五”期间，生物反应器均被列为科技部“863”计划的重大专项，而我国科学家们也不负众望，在动物乳腺生物反应器制药技术研究领域取得了巨大成就，先后获得了转基因鼠、转基因绵羊、转基因山羊、转基因猪和转基因牛等，并获得了

一批高效表达重组蛋白的转基因动物乳腺生物反应器，如2005年中国农业大学和北京济普霖生物技术有限公司联合研制的人乳铁蛋白和人乳清白蛋白转基因奶牛均获得高效表达，在转基因奶牛奶液中重组人乳铁蛋白和人乳清白蛋白的含量分别达到3.4克/升和1.5克/升，标志了我国首次获得可商业化生产的动物乳腺生物反应器重组人类蛋白。目前科学家们正在加紧开展重组蛋白纯化、临床前试验和临床试验等研究，力争早日实现我国动物乳腺生物反应器制药技术产业化。

也许，在未来的某个时候，你或者你的家人可能会用到动物乳腺生物反应器生产的重组蛋白药物，请不要惊讶！也许这种药物将成为人们最好的选择，因为动物乳腺生物反应器药物具有安全、廉价、高效的优点，而且某些重组蛋白药物只能通过该技术生产。总之，动物乳腺生物反应器制药时代已经悄然来临，而且其发展将会势不可当

范文二：动物乳腺生物反应器

－２?

动物乳腺生物反应器

刘

静

（山东省济宁学院生命科学与工程系２７３１５５）

摘要应用转基因动物乳腺生物反应器能够获得多种药用蛋白质．具有高效、经济、安全等特点。本文就转基因动物乳腺生物反应器的定义、研究发展简史、药用蛋白生产的特点及存在的主要闷题作了简要综述，并对其开发应用前景作了展望。关键词动物乳腺生物反应器药用蛋白转基因动物

动物乳腺生物反应器（ｍ啪抛ａｒｙｄａＩｌｄｂｉｏｐ瞪ｃｔｏｒ）

的研究始于２０世纪９０年代初，是一项利用转基因动物的乳房代替传统的生物发酵，进行大规模生产可供治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技术。动物乳腺反应器是生产外源蛋白质最有效的生物反应器，也是目前国际上唯一证明可以达到商业化生产水平的生物反应器。本文就动物乳腺生物反应器的定义、发展简史、药用蛋白质的生产特点及其存在的主要问题作简要综述。

ｌ

什么是动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器是指利用动物乳腺特异表达

的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，来制作转基因动物，指导特定外源基因在乳腺中特异、高效表达，并能从乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器…。其原理是应用转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段（或ｌ或２细胞的梦精卵）的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因的表达序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达，再通过回收乳汁获得具有生物活性的目的蛋白【２｜。．

２动物乳腺生物反应器的研究发展简史

转基因动物研究始于２０世纪８０年代初期Ｌ２Ｊ。１９８０年，Ｇｏｒｄｏｎ等…将重组ＤＮＡ用显微注射法导入小鼠受精卵原核，首次获得了整合有外源基因的小鼠。１９８２年，ＰａｌＩＩｌｉｔｅｒ等Ｌ４ｊ将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵中，首次获得了体重为正常小鼠２倍以上的“超级小鼠”并提出了从转基因动物中提取药物蛋白的设想。然而，真正的动物乳腺生物反应器研究则始于１９８７年Ｇ０ｒｄｏｎ等的研究【５｜，他们将组织纤溶酶原激活剂（ｔＰＡ）与小鼠乳清酸蛋白（ｗＡＰ）基因的启动子构成重组基因【引，成功地培育了３７只能在乳汁中表达ｔＰＡ的转基因小鼠，该研究结果揭示了应用动物乳腺生物反应器可能会生产出高附加值的药用蛋白。同年，世界上首只能从乳汁中分泌ｏＬｌ一抗胰蛋白酶（ＡＡＴ）的转基因绵羊在英国诞生。从此，应用乳腺生物反应器生产药用蛋白成为各国竞相研究的热点。

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方数据１９８７年，Ｓｉｍｏｍ等【６Ｊ将带ＭＴ启动子的Ｂ一乳球蛋白一凝血因子Ⅸ（ＢＬＧ—ＦＩＸ）、ＢＬＧ—ＡＡＴ等重组ＤＮＡ片段注射到绵羊受精卵中，获得了在乳汁中有外源基因表达的转基因后代。１９９１年，ｗｒｉ曲ｔ等【７］将绵羊ＢＬＧ基因调控区与人ＡＡＴ基因相连，获得了４只转基因绵羊。１９９２年，Ｖｅｌ眦ｄｅｒ等１８Ｊ利用ＷＡＰ基因启动子与人蛋白质Ｃ（ｈＰＣ）ｃＤＮＡ重组基因获得的转基因猪，使重组ｈＰＣ的表达量（１９／Ｌ）比人血中ｈＰＣ浓度高出近２００倍。１９９７年，ｗｉｌｌＴｌｕｔ等１９Ｊ首创体细胞克隆技术并成功构建了表达人源性蛋白的转基因克隆绵羊，并用导人人凝血因子Ⅸ和新霉素标记基因的绵羊的胎儿成纤维细胞作为核供体，再选择细胞系进行细胞核移植方法克隆出３只转基因绵羊。２０００年，英国ＰＰＬ公司【１０Ｊ将人类ＡＡＴ基因定点整合到羊胎儿成纤维细胞的ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ基因座，用转基因体细胞生产的克隆绵羊的每升乳中蛋白的含量达到了６５０ｍｇ，远高于显微注射法构建的转基因绵羊的１８ｍｇ的水平；２００１年，Ｄｅｎｌｌｉｎｇ等Ｌ１１］又生产出俚一ｌ，３一ＧＴ（半乳糖基转移酶）和朊病毒双剔除的克隆绵羊。由此可见，乳腺生

物反应器研究从试验模型动物——小鼠的转基因开

始，逐步建立起了大型哺乳动物乳腺生物反应器制备的技术平台。到２００６年６月２日，由全球最著名的动物乳腺生物反应器研发企业美国ＣＴＣ研制成功的世界上第１个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基

因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶Ⅲ（商品名为Ａｔ—

ｒｙｎ，用于治疗先天性抗凝血酶缺失症）的上市许可申请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定的批准意见。目前，国内外已在动物乳腺生物反应器的研究和开发方面投入了大量资金，该项技术也得到了显著改进和提高，全世界已有二三十家公司致力于开发动物乳腺生物反应器蛋白药物。迄今，已成功开发了至少１２０种药物，可进行商业生产的药用蛋白近３０种，正在进行临床试验的蛋白有１０余种，包括重组人抗凝血酶ＩＩＩ、人俚一抗胰蛋白酶（抗蛋白酶缺乏性肺气肿药物）、重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂（抗栓药）和人Ｃｌ抑制剂（治疗血管神经性水肿的药物）等，另外还有上百种重组蛋白正处在研发阶段Ｌｌ

２Ｉ。

３

动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的特点

３．１

生产成本低，周期短一头转基因动物相当于一个制药车间，作为乳腺生物反应器的转基因动物如牛、羊等草食性动物，产奶量高，饲养成本低，可通过繁殖扩大数量，进行工厂化生产。有资料显示…Ｊ，用哺乳动物细胞培养等方法生产ｌ克药物蛋白质，平均成本约为１００一１０００美元，而利用转基因动物乳腺反应器来生产则只需１０—２５美元；就管理和操作生产每克粗蛋白的费用而言，细胞培养为８００一５０００美元，乳腺生物反应器为０．０２—５．００美元；从药物生产开发周期来看，么种新药从研制开发、通过新药审批，直到上市需要１５—２０年，而应用转基因动物乳腺生物反应器生产药用蛋白，可使新药上市缩短到５年；以动物生命的周期计算，转基因羊从显微注射到泌乳的周期是１８个月，转基因牛也只需要２５—２９个月。

３．２产品产量高．易纯化动物乳腺是一种高度分化的专门化腺体，也是天然的高效合成蛋白质的生物反应器，有强大的合成蛋白质的能力，尤其是一些经过遗传改良的优良乳用品种。一般一头奶牛一年可产奶８０００—１００００ｋｇ，一只绵羊或山羊可产奶８００—１０００ｋｇ，以最低表达量为１Ｌ的重组蛋白计算。一头奶牛一年就可生产８—１０ｋｇ重组蛋白，年产量相当于１０００Ｌ的发酵罐；乳腺生物反应器技术生产的药用蛋白纯化工艺较简单，产品收率达９９．７％以上ｌ２１。

３．３产品活性高，无污染动物乳腺作为一个完善的“分子农场”可对重组蛋白进行翻译后加工。用动物乳腺生物反应器所生产的药物蛋白质在结构和生物活性上与天然蛋白质一样优质，用乳汁生产药物蛋白的过程也不会产生工业废料，不会对环境造成污染。另外，乳腺细胞表达的外源蛋白不会进入血液，不会对动物的健康及生理活动造成任何影响。可见，应用乳腺生物反应器生产的药用蛋白质属于纯生物制品，质量安全可靠，无污染。

３．４外源基因可稳定遗传，产品利润高

动物乳腺表

达的外源基因可以遗传给后代，因此一旦获得能生产

亲种有价值蛋白质的动物个体，就可以通过人工授精、

胚胎分割及克隆等胚胎工程方法来扩大个体数量，并可继续从其阳性后代获取巨额经济利润，如荷兰Ｇｅｎ．ｐｈ８ｒｍ公司用转基因牛生产乳铁蛋白，每年从乳汁中提炼的含乳铁蛋白奶粉的价值是５０亿美元。据经济学家预测，ｌＯ年后转基因动物生产的药物将会投放市

场，转基因动物生产的药物将占整个基因工程药物的

９０％以上，每种药物的销售可超过２５０亿美元，从而使转基因动物乳腺生物反应器产业成为具有高额利润的新型产业［１

４Ｉ。

４存在的主要问题

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方数据?３?

目前，生产实践中动物乳腺生物反应器的应用已崭露头角，但这项技术还存在着诸多问题。首先是研发周期长、前期投资大及技术难度高等，导致产品商品化较慢。其次，有关转基因动物的基础研究还比较薄弱。另外，乳腺生物反应器的异位表达和表达产物的泄露问题也需要各种新技术来解决。最后，人们对转基因产品安全性及转基因技术所涉及的伦理、道德问题的考虑［１５］，对转基因产品接受程度不高，这在一定程度上也会阻碍乳腺生物反应器的发展。５开发应用前景

动物乳腺生物反应器开创了现代生物制药产业的新途径，现已成为生物反应器技术中研究最为活跃、最具有商业化发展前景的领域之一。随着社会各界对转基因动物生产药用蛋白认识的不断深入，利用动物细胞核移植与基因打靶技术培育的动物乳腺生物反应器生产的药用蛋白必将投入市场，造福于人类社会。总之，转基因动物乳腺生物反应器用于药用蛋白的市场潜力是巨大的，具有广阔的开发应用前景！

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鱼类消化酶研究进展

陈进树

摘

（福建省漳州城市职业学院生物与环境工程系３６３０００）

要本文概述了当前国内外有关鱼类消化酶的研究进展。

关键词关键词鱼消化酶研究进展

消化酶是消化系统分泌的具有催化食物分解的一类酶，根据其消化对象的不同，大致可划分为蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶等几种。消化酶对鱼类的生长发育具有极其重要的作用，通过消化酶的消化作用，鱼类将摄人的食物消化分解成可被鱼类吸收的小分子物质，再经过循环系统运输到组织细胞里面，从而获得用于维持其自身生长发育和繁殖后代等生命活动的物质和能量。对消化酶的研究可极大地推动鱼类养殖业的发展，国内外已有大量的有关鱼类消化酶的研究报道。

ｌ

化过程。因此，水温对于鱼类的消化酶活性具有重要的影响。Ｈｏｆｅｒ等研究了拟鲤、红眼鱼的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性的季节变化；陈品健等Ｌ４］研究了真鲷幼鱼消化酶活性与饲养水温的关系；从他们的研究中可以看出水温对于鱼的消化酶活性的影响是巨大的。而消化酶活性的强弱，又直接影响到鱼类对于营养物质的消化吸收，从而对鱼类的生长起着至关重要的作用。

在鱼类生活的水体中还存在着许多化学物质，如各种金属离子等。这些物质在浓度较低时一般不会对鱼类的消化酶活性产生影响，但在人工养殖环境中这些物质的浓度可能会比较高，有可能会对鱼类的消化酶活性产生影响。鱼类的消化酶活性易受到其所生活的环境中的各种理化因子的作用，其确切的机理目前并不完全清楚。

３

鱼类食性和消化酶的关系

鱼类的食性与其他动物一样，常因种类不同而异，

即使是同一种类，在不同的环境条件下或不同的生长发育阶段也不尽相同，但它们的食性总是与其本身的消化酶组成状况密切相关。Ｈ０ｆｅｒ等［１】研究了６种鲤科鱼类和２种丽科鱼类食性与消化酶的关系，Ａｇｒａｗ－

ａｌ

鱼类消化酶酶促反应与酶动力学等方面的研究鱼类酶动力学是研究酶催化反应速度的问题，它

Ｌ２ｊ比较了肉食性、杂食性、革食性鱼类的淀粉酶和脂

肪酶的活性差异；黄耀桐等【３Ｊ研究了草鱼肠道和肝胰脏蛋白酶活性与饲料的关系；吴婷婷等研究了鳜鱼、青鱼、草鱼、鲤、鲫、鲢的消化酶活性；桂远明等研究了温度对草鱼、鲤、鲢、鳙主要消化酶活性的影响。这些研究显示：一般而言蛋白酶活性以肉食性鱼类为最高，杂食性鱼类次之，草食性鱼类最低；而淀粉酶活性则草食性鱼类最高，杂食性鱼类次之，肉食性鱼类最低；鱼类脂肪酶活性与食性的关系与蛋白酶活性与食性的关系相类似，即肉食性鱼类明显高于杂食性鱼类，而杂食性鱼类高于草食性鱼类。可见鱼类的食性与消化酶的组成有着密切。

２环境因素与消化酶的关系

消化酶是一类高效的生物催化荆，但它的催化作用易受外界环境因素的影响，影响鱼类消化酶活性的环境因素主要有水温、水体中的金属离子等。鱼类属变温动物，环境温度变化将直接影响鱼体内的生理生

［１１］Ｄ吼Ｉｌｉｎｇｃ。Ｂｕｄｓ，ＡｉｎｓＩｉｅ

３）ｇ曩ｌａｃｔ∞ｙｌ

主要是研究温度、ｐＨ值、酶浓度、离子浓度等因素对酶促反应速度的影响；酶的蛋白质本性决定了温度和ｐＨ值是酶促反应的两个最重要的因素。因此，对于鱼类酶动力学的研究，大多也是关于温度、ｐＨ值对酶反应速度的影响。这方面的研究，在鱼类的消化酶研究方面占有的比例最大。Ｂｉｎｅｒｌｉｃｈ等…研究了鳙鱼和鲢鱼消化酶酶促反应的最适ｐＨ值；陈品健等…研究了真鲷幼鱼消化酶活性与温度的关系；陈章宝等研究了活性微生物、ｐＨ值、温度对淡水白鲳主要消化酶活性的影响；倪寿文等对鲤、草、鲢、鳙、尼罗非鲫的肠和肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性及其最适ｐＨ值进行了研究；桂远明等比较研究了温度对草、鲤、鲢、鳙主要消化酶活性的影响。这些研究显示：对于不同的鱼类、或是同种鱼的不同器官、或是同一器官里不同的消化酶具有不同的最适温度和最适ｐＨ值，同时最适温度和最适ｐＨ值随不同的反应条件（时间、底物浓度

【１３］刘殿峰。刘秀霞，姚伟等．２００４．转基因动物乳腺反应器与生

物制药．黑龙江动物繁殖。１２（３）：１６一１８

［１４］李志勇．２０ｃｒ７．细胞工程．北京：科学出版社，”２—２８０【１５］杨雪峰，刘玉梅，张文娟．２００８．动物乳腺生物反应器在现代

生物制药中的应用．黑龙江畜牧兽医，１７（６）：２ｌ一２２◇

Ａ．ｅｔ曩Ｉ．２００１．Ｄｅｌｅｔｉ姐《由Ｉｌａ（１，

ｔｌＩｅ州∞ｐ删ｅｉｎ

ｈ蜘ｆｅｒ蛳（ＧＧｒＡｌ）妒∞ａｎｄ

（ＰｒＰ）铲∽ｉｎ８ｈ∞ｐ．ＮａｔＩｍｂｉａｔｅｃｈｎｏｌｏ盯，１９（６）：５５９—５６２［１２】王庆忠，李国荣。尹昆等．２００５．乳腺生物反应器的研究现

状和产业化前景．生命科学，１７（１）：７６—８ｌ

万方数据　

动物乳腺生物反应器

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：

刘静， Liu Jing

山东省济宁学院生命科学与工程系,273155生物学教学

BIOLOGY TEACHING2009,34(12)

参考文献(15条)

1.杨雪峰;刘玉梅;张文娟 动物乳腺生物反应器在现代生物制药中的应用[期刊论文]-黑龙江畜牧兽医 2008(06)2.李志勇 细胞工程 2007

3.Wiilmut I;Schnieke AE;Mcwhir J Viable off-spring derived from fetal adult mammalian cells[外文期刊] 1997(6619)

4.Velander WH;Johnson JL;Page RL High-level expression of a heterologous protein in the milk oftransgenic swine using the cDNA encoding human protein C 1992(24)

5.Wright G;Carver A;Cottom D High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milkof transgenic sheep 1991(09)

6.曾邦哲 转基因动物的基础与应用研究 1997(06)

7.Gordon K;Lee E;Vitale J Production of human tissue plaminogen activator in transgenic mouse milk1987(11)

8.Palmiter RD;Brinster RL;Hammer RE Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjectedwith metallothioneingrowth hormone fusion genes 1982(5893)

9.Gordon JW;Scangos GA;Plotkin DJ Genetic transformation of mouse embryos by microinjection ofpurified DNA 1980(12)

10.王洪岩;仲跻峰;刘文浩 动物乳腺生物反应器的研究进展[期刊论文]-山东农业科学 2004(03)11.刘殿峰;刘秀霞;姚 伟 转基因动物乳腺反应器与生物制药[期刊论文]-黑龙江动物繁殖 2004(03)12.王庆忠;李国荣;尹 昆 乳腺生物反应器的研究现状和产业化前景[期刊论文]-生命科学 2005(01)

13.Denning C;Burl S;Ainslie A Deletion of alpha (1,3) galactosyl transferase (GGTA1) gene and theprion protein (PrP) gene in sheep[外文期刊] 2001(06)

14.McCreath KJ;Howcroft J;Campbell KHS Production of gene-targeted sheep by nuclear transfer fromcultured somatic cells[外文期刊] 2000(6790)

15.朱小甫;渠敬峰;吴旭 转基因动物乳腺生物反应器研究进展[期刊论文]-畜牧兽医杂志 2007(03)

本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_swxjx200912001.aspx

范文三：动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器 ?

2?

动物乳腺生物反应器

生物学教学2009年(第34卷)第12期

刘静(山东省济宁学院生命科学与工程系273155) 摘要应用转基因动物乳腺生物反应器能够获得多种药用蛋白质,具有高效,经济,

安全等特点.本文就转基因动物乳腺生物

反应器的定义,研究发展简史,药用蛋白生产的特点及存在的主要问题作了简要综

述,并对其开发应用前景作了展望.

关键词动物乳腺生物反应器药用蛋白转基因动物 动物乳腺生物反应器(mammaryglandbioreactor)

的研究始于2O世纪9O年代初,是一项利用转基因动 物的乳房代替传统的生物发酵,进行大规模生产可供 治疗人类疾病或用于保健的活性蛋白质的现代生物技 术.动物乳腺反应器是生产外源蛋白质最有效的生物 反应器,也是目前国际上唯一证明可以达到商业化生 产水平的生物反应器.本文就动物乳腺生物反应器的 定义,发展简史,药用蛋白质的生产特点及其存在的主 要问题作简要综述.

1什么是动物乳腺生物反应器

动物乳腺生物反应器是指利用动物乳腺特异表达 的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体,来制作转基 因动物,指导特定外源基因在乳腺中特异,高效表达, 并能从乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器l_lj. 其原理是应用转基因技术,将目的基因转移到尚处于 原核阶段(或1或2细胞曲乡精卵)的动物胚胎中,经

胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体.外源基因在乳 腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控 区,即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因的表达序列,这 样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之 下,使其在乳腺中表达,再通过回收乳汁获得具有生物 活性的目的蛋白j.

2动物乳腺生物反应器的研究发展简史

转基因动物研究始于20世纪8O年代初期J. 1980年,Gordon等j将重组DNA用显微注射法导入 小鼠受精卵原核,首次获得了整合有外源基因的小鼠. 1982年,Palmiter等_4J将大鼠生长激素基因显微注射 到小鼠受精卵中,首次获得了体重为正常小鼠2倍以 上的"超级小鼠"并提出了从转基因动物中提取药物 蛋白的设想.然而,真正的动物乳腺生物反应器研究 则始于1987年Gordon等的研究j,他们将组织纤溶 酶原激活剂(tPA)与小鼠乳清酸蛋白(WAP)基因的启 动子构成重组基因_2J,成功地培育了37只能在乳汁 中表达tPA的转基因小鼠,该研究结果揭示了应用动 物乳腺生物反应器可能会生产出高附加值的药用蛋 白.同年,世界上首只能从乳汁中分泌1一抗胰蛋白 酶(AAT)的转基因绵羊在英国诞生.从此,应用乳腺 生物反应器生产药用蛋白成为各国竞相研究的热点. 1987年,Simons等J将带MT启动子的B一乳球 蛋白一凝血因子Ix(BLG—FIX),BLG—AAT等重组 DNA片段注射到绵羊受精卵中,获得了在乳汁中有外 源基因表达的转基因后代.1991年,wright等7-将绵 羊BLG基因调控区与人AAT基因相连,获得了4只转 基因绵羊.1992年,Velander等j利用WAP基因启 动子与人蛋白质C(hPC)eDNA重组基因获得的转基

因猪,使重组hPC的表达量(1g/L)比人血中hPC浓度 高出近200倍.1997年,Wilmut等J首创体细胞克隆 技术并成功构建了表达人源性蛋白的转基因克隆绵 羊,并用导人人凝血因子?和新霉素标记基因的绵羊 的胎儿成纤维细胞作为核供体,再选择细胞系进行细 胞核移植方法克隆出3只转基因绵羊.2000年,英国 PPL公司【l0j将人类AAT基因定点整合到羊胎儿成纤 维细胞的procollagen基因座,用转基因体细胞生产的

0rag,远高 克隆绵羊的每升乳中蛋白的含量达到了65于显微注射法构建的转基因绵羊的18mg的水平;2001 年,Denning等I1J又生产出一l,3一GT(半乳糖基转 移酶)和朊病毒双剔除的克隆绵羊.由此可见,乳腺生 物反应器研究从试验模型动物——小鼠的转基因开 始,逐步建立起了大型哺乳动物乳腺生物反应器制备 的技术平台.到2006年6月2El,由全球最着名的动 物乳腺生物反应器研发企业美国GTC研制成功的世 界上第1个利用转基因动物乳腺生物反应器生产的基 因工程蛋白药物——重组人抗凝血酶?(商品名为At— ryn,用于治疗先天性抗凝血酶缺失症)的上市许可申 请获得了欧洲医药评价署人用医药产品委员会肯定的 批准意见.目前,国内外已在动物乳腺生物反应器的 研究和开发方面投入了大量资金,该项技术也得到了 显着改进和提高,全世界已有二三十家公司致力于开 发动物乳腺生物反应器蛋白药物.迄今,已成功开发 了至少120种药物,可进行商业生产的药用蛋白近30 种,正在进行临床试验的蛋白有10余种,包括重组人 抗凝血酶III,人一抗胰蛋白酶(抗蛋白酶缺乏性肺气 肿药物),重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(抗栓 药)和人c1抑制剂(治疗血管神经性水肿的药物)等,

另外还有上百种重组蛋白正处在研发阶段L1. 3动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的特点 生物学教学2009年(第34卷)第12期

3.1生产成本低,周期短一头转基因动物相当于一 个制药车间,作为乳腺生物反应器的转基因动物如牛, 羊等草食性动物,产奶量高,饲养成本低,可通过繁殖 扩大数量,进行工厂化生产.有资料显示】,用哺乳 动物细胞培养等方法生产1克药物蛋白质,平均成本 约为100,1000美元,而利用转基因动物乳腺反应器 来生产则只需10—25美元;就管理和操作生产每克粗 蛋白的费用而言,细胞培养为800,5000美元,乳腺生 物反应器为0.02—5.O0美元;从药物生产开发周期来 看,种新药从研制开发,通过新药审批,直到上市需 要15—20年,而应用转基因动物乳腺生物反应器生产 药用蛋白,可使新药上市缩短到5年;以动物生命的周 期计算,转基因羊从显微注射到泌乳的周期是l8个 月,转基因牛也只需要25,29个月.

3.2产品产量高,易纯化动物乳腺是一种高度分化 的专门化腺体,也是天然的高效合成蛋白质的生物反 应器,有强大的合成蛋白质的能力,尤其是一些经过遗 传改良的优良乳用品种.一般一头奶牛一年可产奶 8000—10000kg,一只绵羊或山羊可产奶800,1000kg, 以最低表达量为1L的重组蛋白计算,一头奶牛一年就 可生产8—10kg重组蛋白,年产量相当于1000L的发 酵罐;乳腺生物反应器技术生产的药用蛋白纯化工艺 较简单,产品收率达99.7%以上j.

3.3产品活性高,无污染动物乳腺作为一个完善的 "分子农场"可对重组蛋白进行翻译后加工.用动物 乳腺生物反应器所生产的药物蛋白质在结构和生物活

性上与天然蛋白质一样优质,用乳汁生产药物蛋白的 过程也不会产生工业废料,不会对环境造成污染.另 外,乳腺细胞表达的外源蛋白不会进入血液,不会对动 物的健康及生理活动造成任何影响.可见,应用乳腺 生物反应器生产的药用蛋白质属于纯生物制品,质量 安全可靠,无污染.

3.4外源基因可稳定遗传,产品利润高动物乳腺表 达的外源基因可以遗传给后代,因此一旦获得能生产 某种有价值蛋白质的动物个体,就可以通过人工授精, 胚胎分割及克隆等胚胎工程方法来扩大个体数量,并 可继续从其阳性后代获取巨额经济利润,如荷兰Gen- pharm公司用转基因牛生产乳铁蛋白,每年从乳汁中 提炼的含乳铁蛋白奶粉的价值是5O亿美元.据经济 学家预测,1O年后转基因动物生产的药物将会投放市 场,转基因动物生产的药物将占整个基因工程药物的 90%以上,每种药物的销售可超过250亿美元,从而使 转基因动物乳腺生物反应器产业成为具有高额利润的 新型产业[引.

4存在的主要问题

?

3?

目前,生产实践中动物乳腺生物反应器的应用已 崭露头角,但这项技术还存在着诸多问题.首先是研 发周期长,前期投资大及技术难度高等,导致产品商品 化较慢.其次,有关转基因动物的基础研究还比较薄 弱.另外,乳腺生物反应器的异位表达和表达产物的 泄露问题也需要各种新技术来解决.最后,人们对转 基因产品安全性及转基因技术所涉及的伦理,道德问 题的考虑[],对转基因产品接受程度不高,这在一定

程度上也会阻碍乳腺生物反应器的发展.

5开发应用前景

动物乳腺生物反应器开创了现代生物制药产业的

新途径,现已成为生物反应器技术中研究最为活跃,最

具有商业化发展前景的领域之一.随着社会各界对转

基因动物生产药用蛋白认识的不断深入,利用动物细

胞核移植与基因打靶技术培育的动物乳腺生物反应器

生产的药用蛋白必将投入市场,造福于人类社会.总

之,转基因动物乳腺生物反应器用于药用蛋白的市场

潜力是巨大的,具有广阔的开发应用前景!

主要参考文献

[1]朱小甫,渠敬峰,吴旭等.2007.转基因动物乳腺生物反应器

研究进展.畜牧兽医杂志,26(3):50,52

[2]王洪岩,仲跻峰,刘文浩.2004.动物乳腺生物反应器的研究进

展.山东农业科学,14(3):76-78

[3]Gordonjw,ScangosGA,PlotkinDJ,eta1.1980.Genetictransfor- mationofmouseemb~osbymieroinjectionofpurifiedDNA.Pro- ceedingsoftheNationalAcademyofSciences(USA),77(12):7380 ,

7384

[4]PalmiterRD,BrinsterRI,HammerRE,eta1.1982.Dramatic growthofmicethatdevelopfromeggsmicroinjectedwithmetallothio—

neingrowthhormonefusiongenes.Nature,300(5893):611,615

[5]GordonK,LeeE,VitaleJ,eta1.1987.Productionofhumantissue plaminogenactivatorintransgenicmousemilk.Biotechnology,5 (11):1183一l187

[6]曾邦哲.1997.转基因动物的基础与应用研究.生物技术通报,

l3(6):3,17

[7]WrightG,CarverA,CoRomD,eta1.1991.Highlevelexpressionof

activehumanalpha—-1—-antitrypsininthemilkoftransgenicsheep.

Bioteehnology(NY),9(9):830,834

[8]VelanderWH,JohnsonJL,PageRL,eta1.1992.High—levelex- pressionofaheterologousproteininthemilkoftransgcnicswineU— singtheeDNAencodinghumanproteinC.ProceedingsoftheNation— alAcademyofSciences(USA),89(24):12003,12007

[9]WiilmutI,SchniekeAE,McwhirJ,eta1.1997.Viableoff—spring derivedfromfetaladultmammalianceHs.Nature,385(6619):810

,

813

[10]McCreathKJ,HowcroftJ,CampbellKHS,eta1.2000.Production

ofgene—?targetedsheepbynucleartransferfromculturedsomatic

cells.Nature,405(6790):1066,1069

?d?

鱼类消化酶研究进展

生物学教学2009年(第34卷)第12期

陈进树(福建省漳州城市职业学院生物与环境工程系363000) 摘要本文概述了当前国内外有关鱼类消化酶的研究进展. 关键词关键词鱼消化酶研究进展

消化酶是消化系统分泌的具有催化食物分解的一

类酶,根据其消化对象的不同,大致可划分为蛋白酶,

淀粉酶,脂肪酶和纤维素酶等几种.消化酶对鱼类的

生长发育具有极其重要的作用,通过消化酶的消化作

用,鱼类将摄人的食物消化分解成可被鱼类吸收的小

分子物质,再经过循环系统运输到组织细胞里面,从而

获得用于维持其自身生长发育和繁殖后代等生命活动

的物质和能量.对消化酶的研究可极大地推动鱼类养

殖业的发展,国内外已有大量的有关鱼类消化酶的研

究报道.

l鱼类食性和消化酶的关系

鱼类的食性与其他动物一样,常因种类不同而异, 即使是同一种类,在不同的环境条件下或不同的生长 发育阶段也不尽相同,但它们的食性总是与其本身的 消化酶组成状况密切相关.Hofer等…研究了6种鲤 科鱼类和2种丽科鱼类食性与消化酶的关系,Agraw. al1-比较了肉食性,杂食性,草食性鱼类的淀粉酶和脂 肪酶的活性差异;黄耀桐等_3J研究了草鱼肠道和肝胰 脏蛋白酶活性与饲料的关系;吴婷婷等研究了鳜鱼,青 鱼,草鱼,鲤,鲫,鲢的消化酶活性;桂远明等研究了温 度对草鱼,鲤,鲢,鳙主要消化酶活性的影响.这些研 究显示:一般而言蛋白酶活性以肉食性鱼类为最高,杂 食性鱼类次之,草食性鱼类最低;而淀粉酶活性则草食 性鱼类最高,杂食性鱼类次之,肉食性鱼类最低;鱼类 脂肪酶活性与食性的关系与蛋白酶活性与食性的关系 相类似,即肉食性鱼类明显高于杂食性鱼类,而杂食性 鱼类高于草食性鱼类.可见鱼类的食性与消化酶的组 成有着密切.

2环境因素与消化酶的关系

消化酶是一类高效的生物催化剂,但它的催化作 用易受外界环境因素的影响,影响鱼类消化酶活性的 环境闲索主要有水温,水体中的金属离子等.鱼类属 尘扛功物,环境温度变化将饩接影响鱼体内的生理生 }】~enningC,BurlS,AinslieA,el:a1.2001.Deletionofalpha(1,

3)galact.syltran4erase(GGI'AI)geneandtheprlonprotein

(I')geneinsheep.Naturebiotechnolo~v,19(6):559,562 [11j:J:厌忠.李蹦荣,尹昆等,2005.乳腺生物反应器的研究现 状昶I产业化前景.生命科学,17(1):76,81 化过程.因此,水温对于鱼类的消化酶活性具有重要

的影响.Hofer等研究了拟鲤,红眼鱼的蛋白酶,淀粉 酶和纤维素酶活性的季节变化;陈品健等J研究了真 鲷幼鱼消化酶活性与饲养水温的关系;从他们的研究 中可以看出水温对于鱼的消化酶活性的影响是巨大 的.而消化酶活性的强弱,又直接影响到鱼类对于营 养物质的消化吸收,从而对鱼类的生长起着至关重要 的作用.

在鱼类生活的水体中还存在着许多化学物质,如 各种金属离子等.这些物质在浓度较低时一般不会对 鱼类的消化酶活性产生影响,但在人工养殖环境中这 些物质的浓度可能会比较高,有可能会对鱼类的消化 酶活性产生影响.鱼类的消化酶活性易受到其所生活 的环境中的各种理化因子的作用,其确切的机理目前 并不完全清楚.

3鱼类消化酶酶促反应与酶动力学等方面的研究 鱼类酶动力学是研究酶催化反应速度的问题,它 主要是研究温度,pH值,酶浓度,离子浓度等因素对酶 促反应速度的影响;酶的蛋白质本性决定了温度和pH 值是酶促反应的两个最重要的因素.因此,对于鱼类 酶动力学的研究,大多也是关于温度,pH值对酶反应 速度的影响.这方面的研究,在鱼类的消化酶研究方 面占有的比例最大.Bitterlich等_5J研究了鳙鱼和鲢 鱼消化酶酶促反应的最适pH值;陈品健等J研究了 真鲷幼鱼消化酶活性与温度的关系;陈章宝等研究了 活性微生物,pH值,温度对淡水白鲳主要消化酶活性 的影响;倪寿文等对鲤,草,鲢,鳙,尼罗非鲫的肠和肝 胰脏的蛋白酶,淀粉酶,脂肪酶活性及其最适pH值进 行了研究;桂远明等比较研究了温度对草,鲤,鲢,鳙主 要消化酶活性的影响.这些研究显示:对于不同的鱼

类,或是同种鱼的不同器官,或是同一器官里不同的消 化酶具有不同的最适温度和最适pH值,同时最适温 度和最适pH值随不同的反应条件(时间,底物浓度 [13]刘殿峰,刘秀霞.姚伟等.2004.转基因动物乳腺反应器与生 物制药.黑龙江动物繁殖,12(3):16,18

[14]李志勇.2007.细胞工程.北京:科学出版社.272—280 [15]杨雪峰,刘玉梅,张文娟.2008.动物乳腺生物反应器在现代 生物制药中的应用.黑龙江畜牧兽医,17(6):21-22?

范文四：生物乳腺反应器的原理及进展

动物乳腺生物反应器的原理及进展

摘要： 动物乳腺生物反应器技术是转基因技术的应用，于上世纪 80 年 代提出，其目的是利用动物乳腺产生目的蛋白。利用该技术生产的蛋 白具有低成本，高活性，易提取纯化的优点。虽然该技术尚处于发展 时期，但具有广阔的应用前景和巨大地商业潜力，是许多公司大力发 展的对象。

关键词：动物乳腺生物反应器、原理、进展、优点

1

动物乳腺生物反应器（mammary gland reactor）是指利用动物 乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达， 并能 从转基因动物乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。1生物反应器 (bioreactor) 经历了3 个发展阶段： 细菌基因工程、 细胞基因工程、 转基因动物生物反应器。细菌基因工程产物往往不具备生物活性,必 须经过糖基化、羟基化等一系列修饰加工后, 才能成为有效的药物, 而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当苛刻,成本 太高,限制了规模生产。 动物生物反应器具有产品质量高,容易提纯的 特点，弥补了其它各类基因表达系统的缺陷。它是在转基因技术体系 基础上发展起来的。7自从上世纪80年代出现以来，已经取得了许多 突破，现己成为生物技术研究的热点。并向商业化阶段转变， 显示 了广阔的应用前景。 并且利用转基因动物乳腺生物反应器生产饮用奶， 以期望获得既能满足蛋白质需要，又能增加抵抗力的品质全面的奶， 为人类服务。2

1、动物乳腺生物反应器的原理

乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA 技术和转基因技术， 将目 的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中， 经胚胎移植得到转基因 乳腺表达的个体。1 外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一 个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列， 这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下， 使其在乳腺 中表达再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。 它是一个专门化 的分泌腺体，可以生产出具完全生物活性的药用重组蛋白质，其纯化

2

简单，生产投资及成本相对较少，而且对环境不具污染性，也被称为 “分子农场”。 2、动物乳腺生物反应器的主要研究内容 2、1 乳腺特异表达载体的构建 乳腺特异表达载体就是能够在动物的乳腺部位特异表达携带外 源目的基因的DNA片段。目前已克隆并用作构建载体的乳蛋白基因主 要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、酪蛋白基因、乳清酸 蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因。7乳腺特异表达载体的首先要具备乳 腺特异的启动子，目前所熟知的乳腺特异启动子有Beta-乳球蛋白基 因的启

动子， S1 /Beta 酪蛋白启动子( α S1 /Beta Casein， α CA) ， 乳清酸蛋白基因启动子，其中研究最多和效果较佳的是绵羊的BLG、 牛的α S1CA、山羊的Beta-CA、小鼠的WAP 等基因的启动子．如果得 用目的基因的DNA序列而不是cDNA,表达效果可能会更好。 不翻译的外 显子和内含子的掺入可能有利于转基因的表达。5 2． 2 乳腺生物反应器的基因介导方法9 1) 微注射法 微注射法是指直接将裸露的线形DNA 直接注射到胚胎原核中， 使 得目的DNA 整合到宿主基因组上。 这种方法基因整合效率低，在家 畜中尤其如此，家兔和猪为5% ～ 15%，山羊2%，绵羊1% ～ 5%，而 牛不超过0． 5%， 而且成本高; 基因只能加入， 不能剔除或原位修饰; 整合是随机的，由于插人位点的关系，转基因的表达不确定;随机整 合可能破坏重要的内源性DNA 序列或激活细胞的致癌基因; 产生的

3

转基因动物常常是嵌合体， 即并非所有细胞都整合有外源基因; 以及 不能在胚胎早期确定性别等。 2) 细胞转染与核移植 利用近年来发展起来的基因打靶技术， 可以将目的基因定点整合 至细胞染色体上的特定位置， 目前基因打靶的位置主要还集中在乳蛋 白基因座，因为乳蛋白的敲除对于宿主本身的影响不是很大。 目前 反刍动物的干细胞发展很缓慢，利用体细胞打靶在理论上是可行的， 但是体细胞基因打靶的效率比干细胞要低2 个数量级。 而且非同源 重组的效率特别高，需要提高多种途径提高打靶效率，目前核移植的 方法几乎就是整个转基因的关键步骤，也是限制转基因动物生产的 “限速步骤”，目前体细胞克隆技术也有很多有待完善的地方，如克 隆胎儿怀孕率低、易流产、出生后健康状况不好等，导致克隆技术效 率低下，平均不到10%的克隆胚胎会产生一个活的后代。 核移植技术 的常规化需要在众多方面加以改进， 特别是针对围产期胚胎死亡和细 胞体外长期培养对克隆胚胎造成的不利影响。 3) 精子载体法 该方法实验的重复性很差，且DNA 整合进基因组后，基因重排现 象严重。然而，最近有研究显示，通过体外受精或人工授精的方法， 目的DNA 与抗精子表面蛋白的抗体结合，能有效进入受精卵中，这个 方法目前已经成功地生产出转基因小鼠与猪， 外源基因以这种途径进 入动物体内整合效率高，没有基因重排现象，能表达且能传递给子 代． 这种方法似乎又给精子作为载体的转基因方法带来的曙光。

4

4) 逆转录病毒法 将外源基因替换病毒基因组的gag，pol 和env 等基因，通过顺 式元件的调控序列和感染成分重组病毒载体， 然后注射到第二次减数 分裂中期的卵母细胞，体外受精和筛选后，将胚胎

移人假孕母体的子 宫内，继续发育成转基因动物。 该方法整合稳定，拷贝数和插入位 点相对固定，转基因效率高。 然而转录病毒载体容量有限，只能转 移小于10kb 片段的DNA，而且基因是随机插入的，由于多处整合而产 生嵌合体; 虽然设计时缺失复制功能序列， 但复制大量载体所需的辅 助病毒基因组也可能与目的基因一起整合到同一细胞核中， 有可能产 生辅助病毒株，从而产生生物安全性问题。 5) 电穿孔法 电穿孔法是在外界高电压短脉冲的作用下改变了细胞膜的结构， 使细 胞膜产生可逆性电穿孔，使得外源DNA 通过细胞膜进入细胞，然后将 经过筛选的转基因细胞用显徽注射法， 注入去核的卵母细胞的卵周隙， 施加电脉冲使供体核与去核卵母细胞融合，获得转基因重构胚。 再 经过电激活或化学激活，使重构胚胎发育，然后在体外或通过中间受 体使其发育到囊胚，最后将胚胎移植到同期发情处理的受体中，适于 转染多种细胞。 6) 脂质体法 通过脂质体包埋、介导，将外源基因转染到培养的体细胞，然后 将此细胞与去核卵母细胞融合， 融合的重构胚胎经电激活后在体外培 养至囊胚，移入受体动物，最终获得转基因个体。脂质体法产生个体

5

的外源基因整合率为100%． 采用脂质体方法转染体细胞，相比较而 言，脂质体转染的效率要高于电穿孔法转染，且对细胞的损伤较小， 但对于有些类型的细胞，脂质体的转染效果要比电穿孔转染差。 7) 干细胞介导法 利用化学转染或电击法将目的基因导人为分化的胚胎干细胞 ( ES) 中，目的基因通过同源重组整合到细胞染色体基因组特定位点 上，然后将转基因ES 细胞注人同系动物胚胎的囊胚中，发育成携带 有目的基因的转基因动物个体。 该方法最大的优点是能在细胞水平 进行筛选和确定性别; 能随机整合和同源重组整合; 能加入、 剔除或 替换某个基因、进行小到一个或几个核苷酸修饰。 其局限性是目前 ES 细胞仅在小鼠、鸡和人的早期胚胎中分离出来，其它动物还没有 成功建立分离ES 细胞的技术; 并且ES 细胞的培养条件苛刻， 不同ES 细胞株的生殖系传代能力相差很大，而且ES 细胞介导的转基因需要 经过嵌合体这一中间步骤。

2．3

转基因动物模型的建立2 表达产物是否有生物活性、 对动物生长发育是否有副作用及其表

达水平能否达到商业化生产的需求等， 是衡量乳腺生物反应器是否成 功的重要标准，因此需要动物模型来检测效果。制作转基因动物模型 时要考虑研究周期、可操作性、成功率、成本及风险等诸多因素，跟 其他动物相比，小鼠是最理想的动物模型，它成本低、研究周期短

、 可操作性强， 因此大部分研究者将小鼠作为动物实验模型。 1987 年，

6

Gordon 等构建了由小鼠WAP 基因启动区驱动的人组织纤溶酶原激活 剂( t-PA) 重组表达载体，首建乳腺生物反应器小鼠模型。 3、动物乳腺生物反应器的历史及研究进展 3．１ 国外研究现状 自２０世纪８０年代末提出动物乳腺生物反应器的设想以来， 国 外在此方面的研究取得了突破性进展。1987年，Ｇｏｒｄｏｎ首次成 功地从转基因小鼠的乳汁中获得了人类组织型溶酶原激活剂， 此举开 创了新的研究领域，随后各国展开了大量的研究。1990年，美国获得 世界上第一头转基因公牛， 该公牛可与非转基因母牛生产转基因后代， 其１／４的后代母牛乳腺表达了人乳铁蛋白。 Ｐａｒｋ等于2006年通 过精子微注射受精卵获得了整合人重组促红细胞生成素的转基因猪， 对Ｆ１代和Ｆ２代母猪的乳样进行分析表明， 其氨基酸组成与商业化 的重组促红细胞生成素完全相同。美国GTC Biotherapeutics 公司利 用山羊乳腺生物反应器生产的重组人抗凝血酶Ⅲ( 商品名: ATryn) 已于2006 年获得欧洲药监局批准上市， 2009 年2 月该药获得美国 FDA 批准上市，标志着一场生物制药革命的开始。荷兰Genpharm公司 用转基因牛生产乳铁蛋白， 预计每年从乳汁中提炼出来的营养奶粉的 销售额是50亿美元。2、4

3．２ 国内研究现状 尽管我国在该项技术上取得了较大进展， 但仍处于探索研究阶段。 我国对动物乳腺生物反应器的研究起步较早，上世纪８０年代初，施

7

履吉院士就提出了乳腺生物反应器的构想， 并成功获得了表达乙肝病 毒表面抗原的转基因兔子。2005年，李宁等在国际上首次利用体细胞 克隆技术获得人乳铁蛋白基因和人——乳清白蛋白转基因克隆牛； 在 国际上首次获得人岩藻糖转移酶转基因奶牛， 并在其乳腺中实现了高 效表达Ｌｅｗｉｓ抗原， 还在世界上首次获得人溶菌酶转移酶转基因 奶牛， 这是我国第一次成功研制了具有商业开发前景的奶牛乳腺生物 反应器。 2007年， 周兴等用收获的病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺组织， 结果表明牛奶具有明显的纤溶活性， 即蚓激酶基因已经整合到奶牛乳 腺组织并能实现相对稳定的表达。2008年，吴湃等用筛选出活性最强 的重组β －酪蛋白启动子， 构建出了新型的高效重组奶牛乳腺定位表 达载体。2

4、动物乳腺生物反应器的优点 乳腺组织表达的重组蛋白与天然表达蛋白在结构、 功能上极其相 似甚至是相同。 动物乳腺生物反应器生产具有生物活性的多肽药物和 具有特殊营养意义的蛋白质,已成为一个新兴的转基因制药业,它的优 越性有如下几点。 4

.1 表达产物能充分修饰且具有稳定的生物活性利用。DNA 重组 技术的微生物发酵工程来生产的药用蛋白,由于细菌等微生物不能进 行蛋白质合成后的加工, 因而生物活性低, 需要对其进行复杂的加工 才能获得有活性的目的蛋白；并且具有免疫原性,而利用转基因动物 生产药用蛋白却免除这些问题。8

8

4.2 产品成本低,可以大规模生产。 据计算， 与生物发酵技术相比， 动物乳腺生物反应器生产成本只有其百分之一。 作为生物反应器的转 基因动物可无限扩繁,且饲养成本低,可进行大规模的药物生产。而动 物细胞生物反应器,虽然能生产具有完全生物活性的产品,但以商业生 产为目的的大规模的动物细胞培养,成本会极高且培养条件要求苛刻。 4.3 产品质量高,易提纯。 由动物生物反应器生产的药品为纯的生 物制品,避免了化学试剂及生物毒素的污染。目前,某些药用蛋白生产 已达每千克乳汁含几十克,生物活性与天然蛋白几乎完全一样。乳汁 中几乎不含有蛋白酶，如果在目的蛋白的 N 端或者 C 端加上 His 标 签（不影响蛋白质的结构与功能），利用亲和层析树脂柱能够很方便 将目的蛋白纯化出来。8 4.5 易于扩群，进行规模化生产：作为乳腺生物反应器的转基因 动物可通过繁殖或克隆技术扩大群体规模以获得最大的经济价值。4

5、结束语 动物乳腺生物反应器的研究在短短几十年的时同内， 已取得巨大 成就，某些产品虽已进入商业化生产， 但仍有一些问题需要解决。 目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题；转入 的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、 调节失控、 遗传不稳定、 表达率不高等问题； 转基因表达产物的分离与纯化也存在问题； 转 基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似， 人体是否对它

9

产生免疫反应。这些都需要做进深入研究。3、8、11 综上所述， 尽管动物乳腺生物反应器目前存在许多问题， 但前 景和经济效益是惊人的。 人们可以利用它来生产多种医药生物蛋白制 品、血液替代品等，展示了广阔的发展前景。利用动物乳腺生物反应 器生产珍贵药物必将成为一项极具发展前景的能够带来巨大经济 利益的高科技产业，必将成为世界科技发展的主流。我们有理由相信 后基因组计划的实施以及基础理论和实验技术的完善， 转基因动物乳 腺生物反应器也必将会取得更大的成绩。4、6

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10

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11.《基因打靶技术的研究进展》，张丽娜、刘国安、杨红《生物技术通报》2010 年第 9 期 51-55 页

11

范文五：动物乳腺生物反应器的研究概况

动物乳腺生物反应器的研究概况 摘 要：转基因动物乳腺生物反应器是利用动物乳腺特异性启动子调控元件指导外源基因在乳腺中特异性表达，并从转基因动物乳汁中获取重组蛋白。近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了该技术的蓬勃发展。本文简要概述了转基因动物乳腺生物反应器的基本概念、原理、特点及应用，并重点阐述了其研究现状及前景，从而探讨其存在的问题。

关键词：转基因动物；乳腺生物反应器；进展

Abstract：Mammary gland bioreactor of transgenic animals is a useful biological technology, which expresses foreign genes under the direction of special promoters of the mammary gland as regulating components in the mammary gland and produces functional pharmaceutical proteins in milk．In recent years，achievements of biology and molecular biology accelerate the development of this technology. This paper briefly reviews the basic concepts, principle, chara- cteristics and applications of the mammary gland bior- eactor of transgenic animals，especially summarizing its current research status and bright future，meanwhile discusses the problems existed．

Key words: transgenic animals；mammary gland bioreactor；

progress

前言 21世纪是生命科学突飞猛进的时代，生命科学在人类生活中占有极为重要的位置。一是生命科学的发展促进了其他学科的发展；二是生命科学发展带动的产业将推动世纪经济的发展。医学和药学是人类健康的有力保障，农牧生物学可以极大提高农业和畜牧业产品的数量和质量，为人类提供丰富的衣食之源。而转基因动物技术可以加快家畜品种的改良速度，提高肉、奶、蛋的产量和品质，又可生产珍贵的药用蛋白，为大量患者造福。而转基因动物最诱人的前景是作为生物反应器，利用它生产人类所需要的生物活性产品或药物，其常用方法是把目的基因在血液循环系统、唾液腺或乳腺等器官或组织中表达，从而获得人类所需要的目的产物。根据目的蛋白表达部位的不同可分为乳腺生物反应器、血液生物反应器、卵生物反应器、尿生物反应器、精囊腺生物反应器、唾液腺生物反应器等。其中，动物乳腺生物反应器是目前应用最为广泛的一类生物反应器，它是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。通过基因工程的方法改造乳腺的功能有利于我们进一步研究乳腺癌的机制，提高乳汁的营养成分，甚至可以合成药物。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍，是一种非常有潜力的高新技术。 1 乳腺生物反应器的原理

乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)技术是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体．制作转基因动物，指导外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达，以期从转基因动物乳汁中源源不断地获得外源活性蛋白。

乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区．即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列的控制之下，使其在乳腺中表达，然后再通过回收奶获得具有生物活性的目的蛋白。

2 乳腺生物反应器的特点

2.1 用动物乳房生产外源蛋白质，产量很高。目前在初乳中已经达到70g／L，在常乳中达到35g／L。

2.2 动物乳腺细胞可以使任何基因正确表达，并正确进行后加 工。因此，动物乳腺细胞所生产出来的蛋白质与天然产品在结构上没有区别，活性也没有区别。此外，乳房是一个相对独立的系统，血液中的蛋白质有时可以进入奶中，但奶中的蛋白质永远不会进入血液。因此，在乳房中生产的任何蛋白质，即使是生理功能很强的激素类蛋白质，也不会影响动物本身的健康。

2.3 乳中的蛋白质种类较少。因此，提纯重组基因在奶中表达的目标蛋白，相对要容易一些。

2.4 用乳房生产同类产品是一个农业过程，如果不考虑产品提纯，则不需要复杂设备，也不需要素质很高的操作人员。牛、羊吃的是草料，生产的是奶和奶中的珍贵蛋白，其生产成本之低没有其他系统可以相比。

2.5 用乳房生物反应器生产产品可以对市场做出灵活反应。由于牛、羊体内重组的外源基因是可以遗传给后代的，因此在市场对产品需求旺盛时可扩大畜群；市场缩小时可以减少畜群头数；需要等待市场时可以用保存精液或胚胎的方法保种，使所受经济损失不大。

2.6 乳房生物反应器系统除了可以用来生产药物外，也可以用来生产食品和保健品，其他系统则不行。

2.7 对转基因动物影响小。乳腺生物反应器的目的基因在乳腺中特异的表达，由于乳汁不进人体内循环，故表达的外源蛋白不会影响转基因动物本身的生理代谢过程，对动物内部组织器官影响不大，对动物生活力、繁殖力影响较小。

2.8 研发周期短：目前一种新药从研发到上市约需要15~20年，如果技术成熟后利用动物乳腺来生产，仅需五年左右，如以转基因动物研制的周期来计算，转基因羊从显微注射到秘乳的周期是18个月，即18个月就可以进入生产阶段。

3 腺生物反应器的研究

3.1 国外研究

1980年，Gordon等采用原核期受精卵显微注射法首次成功地

将疮疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，他们将这种转化小鼠称为转基因小鼠(transgenic mice)。1982年，Palmiter等 构建了用金属硫蛋白启动子驱动大鼠生长激素(GH)基因表达的载体，通过显微注射将此基因构件导入小鼠受精卵，获得的转基因小鼠的体重较正常小鼠几乎大一倍。这一研究成果至少具有两个方面的重要意义，一是形成了一套集分子、细胞和整体动物研究于一体的全新的综合研究体系。二是证明与适当启动子融合的目的基因可以在宿主体内进行有效表达，找到了一条可以按照人们意愿定向改造动物遗传性状的有效途径。

随着转基因小鼠研究的成功和相关技术的不断完善，研究者开始探索利用此项技术制备其它转基因动物的可能性，并相继获得了转基因家兔、山羊、绵羊、猪、牛以及家禽等。20年来，由于受到潜在的商业利润的驱动，研究的重点己经由原先基本理论和技术的探索转向转基因动物实际应用研究，目前已有数十种外源基因在上述动物中获得表达，以转基因动物作为生产活性蛋白的动物生物反应器已经从设想变为现实，并显示出巨大的经济潜力。在转基因动物生物反应器研究中，研究进展最快、开发前景最好的是乳腺生物反应器。动物乳腺生物反应器是指利用转基因动物的乳腺作为生产生物活性蛋白的工厂，其基本思路是选择合适的动物乳蛋白基因表达调控序列构建乳腺特异表达载体，通过显微注射等基因导入技术将含目的基因的重组载体转移到原核期受精卵中，将此重组胚移植到同步发情的受体动物后可以筛选

出乳腺中特异表达目的基因的转基因后代。

自20世纪80年代末提出动物乳腺生物反应器的设想以来，国外在动物乳腺生物反应器研究方面已经取得了突破性进展。1987年，Gordon等首次报道在小鼠的乳腺中表达了人的组织纤溶酶原激活剂(tPA)基因。在随后的几年中，陆续又有数种具有商业开发前景的转基因动物乳腺生物反应器的报道。1991年，Wright G等育成乳腺特异表达人抗胰蛋白酶转基因绵羊，表达水平高35g／L，在世界范围内引起了极大的轰动。同年，Brem等报道乳腺表达牛凝乳酶的转基因兔，表达水平达到1-10g／L。在1992年， Velande等报道了乳腺表达人C蛋白的转基因猪，表达水平达到1g／L以上。目前，从转基因动物乳汁中提取的抗人胰蛋白酶、抗凝血酶Ⅲ和人C蛋白等基因工程产品已进入临床试验阶段，并已初步形成以转基因动物乳腺为主要生产手段的医药产业。

3.2 国内研究

我国的转基因动物乳腺生物反应器研究的起步也较早。20世纪80年代初，我国资深科学家施履吉院士即提出利用动物乳腺作为生产重组蛋白的生物反应器的设想，并在“七五”计划期间开展“动物个体表达系统”研究，于1988年在国内率先获得转基因免。随后，国内不少单位相继开展与动物乳腺生物反应器相关的探索和研究，目前已获得表达20余种外源基因的转基因小鼠、兔、绵羊和山羊，但表达水平普遍不高，在相关产品的商业开发方面与国外的差距较大。其主要原因是经费投入力度小、急功近

利思想严重、组织联合攻关不够，以致难以开展系统延续的研究，难以形成通力协作的科研团队和研究基地，仅能依靠有限的经费进行孤立、断续、重复的研究。1996年．国家加大动物乳腺生物反应器研究投资的力度，并将其列入国家“九五”攻关计划和“863”研究计划，强化了组织管理。通过近年来的努力，我国乳腺生物反应器的研究和开发工作进入了一个新的快速发展时期。

4 生物反应器的应用

目前全世界从事乳腺生物反应器商业开发的公司已有30多家，表达水平达到可以进行商业生产的药物蛋白40余种，其中正在临床试验的蛋白有1O余种，如人hFⅧ 、人组织型纤溶酶原激活因子(htPA)等，有些已进入了3期临床阶段。由此可见。乳腺生物反应器的应用前景是非常广泛的，主要可概括为以下几个方面：

4.1 药物：例如胰岛素、干扰素、促红细胞生成素等。据美国生物工程杂志报道，在美国待批的多肽类药物已达100多种，今后每年还会增加40多种。多肽类药物已形成了相当大的市场。

4.2 工程疫苗：由于受基因工程载体的容量限制，目前所生产的基因工程疫苗都是以一小段病毒外壳蛋白或细菌膜蛋白作为抗原，其免疫性不如灭活的全病毒或细菌。如果使用乳房生物反应器，就可以生产病毒的完整外壳蛋白，或细菌的免疫决定蛋白质，其效果就会与常规疫苗相同。

4.3 生产抗体：前市场上销售的抗体，因产量很小，成本高，只能用于诊断。其实，如果能够大量生产抗体，许多疾病就可以用抗体治疗。用抗体治疗疾病可以真正做到对症下药，而不必担心造成体内微生物失衡或因大量使用抗生素而产生副作用。

4.4 生产酶制剂：酶制剂分为两大类，第一类是用量很大的工业用酶。工业用酶生产特点是需求量大且纯度要求不高，很适合使用乳牛生产。另一类酶是生命科学研究中使用的工具酶。如果用乳房生物反应器生产，1头年产1000 kg奶的乳用山羊，可以生产足够全国使用的某一种工具酶。

4.5 生产营养品：首先可以生产的一个产品是无乳糖奶，其次是在牛奶中增加人的转铁蛋白。研究证明，转铁蛋白有良好的营养保健功能，它能够抑制大部分有害的肠胃细菌，但对有益细菌如双歧杆菌起促进作用。第三个开发内容是生产人牛混合奶。人奶对人是最佳的营养品，分离出人奶蛋白基因并把它转移到奶牛中，牛奶中就会有30％～50％人奶的组分。

5 生物反应器存在的问题

尽管转基因动物乳腺生物反应器给人们展示了美好的前景，但要广泛应用于生产，还存在许多理论性和技术性上的问题。

5.1 外源基因在动物体内的位点整合问题：

由于目前人们尚未完全掌握关于乳蛋白基因表达调控规律，目的基因的整合位点以及整合的详细机理，因此，对于导入基因在动物体内的整合位点不能适宜选择，无法消除基因表达的位置

效应，故常常出现遗传性状不稳定、病理缺陷等问题，如繁殖力下降，甚至不育，畸形、隐性致死突变，胚胎早期死亡，生理功能紊乱等。

5.2 乳蛋白基因表达组织特异性问题：

家畜乳腺对外源基因的表达具有乳腺特异性，乳腺特异性表达载体一般是选择乳蛋白的基因表达调控元件，但同样的基因调控元件在不同的种系中差别很大。这可能与外源基因的类型，宿主的遗传背景以及各种启动子调控因子结合位点的突变等有关。

5.3 目的蛋白的翻译后修饰问题：

转基因动物能够对外源蛋白进行翻译后修饰，但用于制备动物乳腺生物反应器的大牲畜毕竟是自然界长期进化的结果，机体的保护系统会对一切外源性物质产生排斥作用。如可能出现蛋白水解过程，羧基化不充分，糖基化形式与人类不同等等。

5.4 转基因表达产物的分离和纯化问题：

表达的产物往往纯化的含量低，且要去除所有可能引起人类变态反应的蛋白质，否则，产品就会与人体产生的蛋白结构、功能和理化性质存在差异，产生免疫反应。

5.5 转基因的技术与方法问题：

显微注射是目前实验室生产转基因动物最常用的一种方法。但在反刍动物上成功率一般比较低，只有4%左右，且操作复杂，很难在短时间内生产出大量转基因动物。其它方法如脂质体转染电转化，精子载体法尚处于探索阶段。要想进行大规模转基因动

物实验还需建立一套更有效的转基因方法。

5.6 伦理道德问题：

此外，目前公众还不能完全接受基因在种间的转移的观念，很多人拒绝使用或食用转基因产品，加之对转基因动物会给现有物种造成威胁的忧虑都在不同程度上制约转基因技术的发展。据说转基因动物回归自然，对生态平衡将会造成严重的影响，这已引起科学家们的高度重视。转基因动物的表型可能发生改变，如生理节律性行为，对环境忍受力等，这些表型的改变必定破坏现有的良性生态平衡，所以投入商品生产存在一定难。 6 展望

转基因动物乳腺生物反应器经过多年研究，已取得了丰硕成果。虽然目前在基础理论、实验技术以及伦理道德等诸多方面存在很多问题，研究还处在初级阶段，但利用动物乳腺生物反应器生产珍贵药物的技术路线是可行的，而且必将成为一项极具发展前景的能够带来巨大经济利益的高科技产业，必将成为世界科技发展的主流。我们有理由相信随着人类基因组草图的绘制，后基因组计划的实施以及ESC技术、核移植技术与转基因技术相结合，生物反应器技术一定能取得更好的发展。

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