范文一：吞噬细胞和巨噬细胞

张美英 (江苏省计划生育学校 215500)

吞噬细胞和巨噬细胞的形态结构、生理特性和功能特点即有区别又有联系。

(一)? 从形态结构上来看

吞噬细胞主要是指中性粒细胞和单核细胞。中性粒细胞呈圆形，直径为10一12μm。染色质呈块状。核一般分为2一5叶，小叶之间由染色质细丝相连。质中有大量染成红紫色的细小颗粒含酸性水解酶、过氧化物酶、溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、氮基肽酶等。单核细胞呈圆形，体积大，直径约为14一20μm，核不分叶，呈肾形或马蹄形，染色质呈细颗粒网状。细胞质中常见细小的颗粒，内含过氧化物酶、酸性磷酸酶、溶菌酶等。

巨噬细胞数量多，分布广，细胞形状不规则，体积较大，直径达50一80μm。在静止状态下，细胞呈圆或卵圆形，常具有突起。核小呈卵圆形。细胞质中含有较多的酸性磷酸酶、葡萄糖苷酸酶、组织蛋白酶、溶菌酶等。

(二)? 从发生过程上来看

中性粒细胞和单核细胞由造血器官(主要是红骨髓)中的造血干细胞通过进一步的增殖分化而形成的。单核细胞未完全成熟，可继续分裂增殖，当它在血液中3一4天后即进入肝、肺、脾、骨髓、淋巴结、浆膜腔等组织部位，并转变为巨噬细胞。据估计，巨噬细胞中90%以上来自单核细胞。在转变过程中，细胞体积增大，直径达50一80μm，溶酶体颗粒也增大、增多，其中的酸性磷酸酶、葡萄糖苷酸酶、组织蛋白酶、溶菌酶等含量也增多，但增殖能力减少，到成熟后不再进行分裂。

(三)从功能特点上来看

中性粒细胞的主要作用是通过吞噬、消化细菌而对机体起防御作用。中性粒细胞在血管内停留时间不长，进入组织中起作用，一旦进入组织不再回到血液中。当细菌入侵机体时会发生炎症反应，炎症组织中的降解产物等可吸引中性粒细胞，按其化学趋向性作变形运动，从毛细血管和微静脉内皮细胞间隙穿出，向病灶集中，进行吞噬活动。一般在吞噬5一25个细菌后死亡，其中的溶酶体破裂而释放出各种酶将中性粒细胞本身及其坏死组织分解。

单核细胞也有活跃的变形运动和吞噬活动，它能穿出血管而进入组织转变为巨噬细胞。单核细胞、幼稚单核细胞、巨噬细胞可组成单核吞噬细胞系统。巨噬细胞能吞噬较大的颗粒，如整个红细胞、症原虫等。通过吞噬和吞饮的方式消灭进入机体细胞内的致病物，如病毒、

疟原虫、结核杆菌、麻风杆菌等，并能识别和杀伤肿瘤细胞。在免疫反应的初期，巨噬细胞表面的受体能与抗体或补体结合，吞噬抗原物质传递给淋巴细胞，使淋巴细胞发挥免疫活性作用。巨噬细胞对机体的铁代谢也起着重要作用，当衰老的红细胞、血小板被吞噬后，被溶酶体的水解酶解体，逸出血红蛋白可再参与机体内铁代谢。

范文二：M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析

收稿日期 :2008-02-15基金项目 :新缰医科

作者简介 :李 康 (1983-) , 男 , 硕 士 , 主要从 事巨噬 细胞免 疫调 节方面的研究。

通讯作者 :熊思东 (E-mail:sdxiongfd@126. com) ;

#

共同通讯作者

M1和 M2型巨噬细胞表型的比较分析

李 康 , 郭 强 , 王翠妮 , 陈 敏 , 徐 薇 #

, 熊思东

(复旦大学免疫生物学研究所 , 复旦大学上海 医学院免疫学系 上海 200032)

摘要 :通过对 M 1和 M 2型巨噬细胞表型相关指标的比较分析 , 评价各鉴定 巨噬细胞类 型的表型 指标及 其意义。按 常规方 法以 IFN -C 及 L PS 将骨髓来源巨噬细胞诱导成 M 1型巨噬细胞 , 以 IL -4诱导出 M 2型巨噬细胞。分别以 RT-PCR 和酶活性 定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性 ; 以 EL ISA 检测 IL -12和 IL -10的分泌 ; 以 F ACS 检测 巨噬细胞 膜分子的表 达。结果显示 :M 1型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶 (inducible nitr ic o x ide synthase, iNO S) 表达和活性水平较未刺激组明显 升高 , IL -12产生显著增加 , CD16/32表达上调 ; 而 M 2型巨噬细胞 I 型精氨酸 酶 (arg inase 1, Ar g -1) 的表达水 平和酶活性 较未刺激巨噬细胞显著提高 , IL -10分泌轻度增加 , 并且表达高水平 的 CD206和 DECT IN -1。 表型比较分 析结果表 明 , iN -O S 表达和活性、 IL -12的分泌和膜蛋白 CD16/32可用 于鉴定 M 1型巨 噬细胞 , 而 A r g -1、 CD206和 DECT IN -1是鉴定 M 2型巨噬细胞较为理想的表型指标。

关键词 :M 1型巨噬细胞 ; M 2型巨噬细胞 ; 表型分析 中图分类号 :R392. 12

文献标识码 :A

文章编号 :1001-2478(2008) 03-0177-07

巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞 群体 , 在体内外不同的微环境影响下 , 表现出明显 的功能差异 [1, 2]。目前根据活化状态和发挥功能的 不同 , 巨噬细胞主要可分为 M 1型即经典活化的巨 噬细胞 (classically activated m acrophag e) , 和 M 2型即替代性活化的巨噬细胞 (alternativ ely activ ated macro phage) [3, 4]。在体外培养条件下 , 通过 IFN -C 及脂多糖 (lipo po lysaccharides, LPS) 诱导产生 M 1型巨噬细胞和通过 T h2型细胞因子 (如 IL -4、 IL -13等 ) 诱导产生 M 2型巨噬细胞 , 具有与体内极化 的巨噬细胞相似的表型和功能 , 已成为研究巨噬细 胞异质性的重要手段。

在机体不同生理和疾病状态下 , 巨噬细胞表现 出不同的类型 , 通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已 成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。已有文 献主 要从精氨酸代谢途径 [5, 6]、细胞因子分泌 [7, 8]

和表面分子的表达 [9, 10]等方面区分 M 1型与 M2型 巨噬细胞。然而 , 到目前为止 , 关于 M1和 M2型 巨噬细胞的表型特征尚未统一。为了评价各种表型

指标及其意义 , 我们参照公认的经典的方法在体外 诱导了 M 1型和 M2型巨噬细胞 , 对 M1和 M 2表 型相关指标进行检测 , 进而相对量化地比较各表型 指标 , 以期为体内外鉴定巨噬细胞类型时表型指标 的选择提供实验依据。

1 材料与方法

1. 1 材料

1. 1. 1 实验动物 C57BL/6小鼠 (H -2b 、 4~6周 龄 , 雌性 ) , 体重 16~20g, 购自上海斯莱克实验 动物有限公司。清洁级饲养于复旦大学实验动物科 学部。

1. 1. 2 主要试剂 细胞培养基 RPMI 1640(Gibco BRL 公司 ) , 小牛血清 (Gibco BRL 公司 ) , L -谷氨 酰胺 (L -Glutamine) (政翔化学试剂研究所 ) , 双抗 (氨卞青霉素钠、硫酸链霉素 ) (上海第四制药厂 ) , 胰酶 (华美生物工程公司 ) ; 小鼠重组 IFN -C (Pep -rotech 公司 ) , LPS(Sigma 公司 ) , 小 鼠重组 IL -4(Peprotech 公司 ) ; T aq DNA 多 聚酶、 dNT P 等 PCR 试剂 (Biostar 公司 ) , T RIzo l(北京鼎国生物公 司 ) , DEPC(Genetimes 公司 ) , M -M uLV Rev erse T ranscriptase(M BI 公 司 ) ; A -异亚硝基苯 丙酮 (A -iso nitrosopr opiophenone) (Sig ma 公司 ) , Ar ginine (鼎国生物技术 有限责任 公司 ) , NO 检测试 剂盒 ) #

177#5现代免疫学 62008年第 28卷第 3期

(eBioscience 公司 ) , 小鼠 IL -12ELISA 检测试 剂 盒 (eBioscience 公司 ) ; FITC 标记 的大 鼠抗 小 鼠 F4/80抗体 (CALTA G Laborato ries 公司 ) , PE 标 记的驴抗 大 鼠 Ig G (H +L) 抗 体 (eBioscience 公 司 ) , PE 标记的抗小鼠 CD16/32(Fc C III /Fc C II 受 体 , 2. 4G2) 抗体 (BD Phar ming en 公司 ) , 未标 记 大鼠抗小鼠 CD206抗体 (Ser otec 公司 ) , 未标记大

鼠抗小鼠 M GL 抗体由荷兰 Erasm us 医学中心 P-i eter Leenen 教授 惠赠 , 未标记 大鼠抗 小鼠 DEC -TIN -1抗体由南非 Cape Tow n 大学 Gordon Brow n 教授惠赠。

1. 1. 3 引物 由北京赛百盛公司合成 , 本实验所 用引物见表 1。

表 1 引物序列

基因 引物序列 (F:正义链

R:反义链 )

PCR 片段 (bp)

退火温度 (e )

iNOS

F:5-CTG CAG CAC TT G GAT CAG GAA CCT G R:5-GGA GT A GCC TGT GT G CAC CTG GAA 311

59

Arg -1F:5-CAG AAG AAT GGA AGA GTC AG R:5-CAG ATA T GC AGG GAG T CA CC 25059

GAPDH F:5-CTG CAC CAC CAA CTG CT T AG R:5-GT C T GG GAT GGA AAT T GT GA

66056

1. 2 方法

1. 2. 1 骨 髓来源巨噬细 胞的诱导 改进的 Vats

等 [11]的方法 , 将小鼠颈椎脱 臼处死后 , 无菌 分离 股骨和胫骨 , 用无菌 2. 5m l 注射器吸入 L929条件 培养基 (含有 20%小鼠成纤维细胞株 L929培养 3d 的上清、 20%小牛血 清、 100U/ml 青霉素、 100mg/ml 链霉素和 2mmo l/L 谷氨酰胺的 DM EM 培 养液 ) , 吹下骨髓内容物入一无菌平皿 , 并将细胞 充分吹匀 , 在 L929条件培养 基中培养 , 7d 后去 除非贴壁细胞 , 再培养于完全 RPM I 1640培养基 (含 10%小牛血清、 1000U/ml 青霉素、 100mg /ml 链霉素和 2mmo l/L 谷氨酰胺 ) 中 , 1d 后收集 的贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞。

1. 2. 2 巨噬细胞的体外刺激 以 0. 25%胰蛋白酶 消化收集诱导成熟的巨噬细胞 , 根据各实验要求铺 于 24孔或 6孔细胞培养板中 , 参照 Vats 等 [11]

的 方法 , 以 IFN -C (100U/ml) 和 LPS (5ng/m l) 共同 刺激培养 24~96h, 诱导出 M1型巨噬细胞 ; 参照 Odegaar d 等 [10]

的方法 , 以 IL -4(10ng /ml) 刺 激 培养 24~96h 诱导出 M2型巨噬细胞。

1. 2. 3 总 RNA 抽提及 RT -PCR 提取方法 参照 试剂盒说明书进 行 , 向刺激 24h 的细 胞 (约 1@106

) 中加入 1000L l T RIzol, 立即用 1ml 注射器 抽打 5次 ; 然后加入 200L l 氯仿 , 混匀 , 室 温静 置 15min 后 12000@g 高速低温离心 20min; 小 心将上层水相移至 1. 5ml 离心管中加入 500L l 异 丙醇 , 振荡混匀。 -20e 放置 30min 沉淀 RN A, 12g ,

再在离心管中加入 1ml 75%乙醇 , 振荡片刻 , 8000@g 低温离心 5min; 小心弃去上清 , 室温静置

5~10min 使 RNA 沉淀恰好干燥 , 加水溶解。将 T RIzol 抽提的细胞总 RNA, 以逆转录进行 cDNA 第一链的合成 :1~5L g 总 RNA 中加 1L l Oligo (dT) 15, 70e 5m in, 于 冰上加 入 5@缓 冲液 3L l, dNT P 2L l, RNasin 0. 5L l, 逆 转录 酶 200U, 加水至总体积 15L l, 42e 延伸 60min 后 , 70e 10m in 。然后以 cDNA 为模板扩增 iNOS 和 Ar g -1的基因编码片段 , 以鼠 GAPDH 为内参照 , 扩增 条件如下 :94e 预变性 5min; 94e 变性 30s, 59e 退火 30s, 72e 延伸 30s, 30个循环 ; 72e 延伸 10m in 。

1. 2. 4 iNOS 活性测定 收集刺激后 24h 的培养 上清 , 按照 NO 检测试剂盒 (硝酸还原酶法 ) 操作说 明 , 取 200L l 培养上清 , 加入 100L l Griess Rea -gent R1, 再加入等体积 Griess Reag ent R2, 混匀 室温静置 10min, 于 540nm 处检测各样品吸光度 (D 值 ) , 以亚硝酸钠 (NaNO 2) 建立标准曲线。 1. 2. 5 Arg -1活性测定 参照 Lum eng 等 [8]的方 法 , 以 100L l 0. 1%Triton X -100裂解刺激 48h 后的细胞 , 加入 100L l 50mmo l/L T ris -H Cl 和 10mm ol/L MnCl 2, 56e 温育 10min, 加入 100L l 0. 5mo l/L Arginine, 37e 温育 30m in, 加入 800L l H 2SO 4/H 3PO 4终止。随后加入 50L l 9%A -异亚 硝基苯丙酮 (A -isonitrosopropio phenone) , 95e 温 育 30m in; 540nm 波长检测吸光度 (D 值 ) , 以尿 (#

178#5现代免疫学 62008年第 28卷第 3期

1. 2. 6ELISA 检测细胞因子分泌 分别收集刺激 后 24h(IL -12) 和 48h(IL -10) 的培养上清。按照试 剂盒说明操作 , 1B 250稀释包被抗体 200L l, 4e 包被过夜 , 洗板 3次 , 加入培养上清 100L l, 室温 孵育 1h 后洗板 3次 , 加入 1B 250稀释的生物素 标记检测抗体 100L l, 室温孵育 1h 后洗板 3次 , 加入 1B 200亲和素标记辣根过氧化物酶 100L l, 室 温孵育 30min 后洗板 7次 , 加入底物液 100L l, 室温避光 15min 后加 入 2mol/L H 2SO 4终止 , 450nm 波长检测吸光度 (D 值 ) 。

1. 2. 7流式细胞术检测细胞膜蛋白表达 按上述 方法诱导培养 7d 的骨髓细胞或刺激后的细胞 , 胰 酶消 化计 数 , 5@105/管 , PBS 洗 1次 , 100L l PBS 重悬 , 加入 1L g FITC 标记的大鼠抗小鼠 F4/ 80抗体和 1L g PE 标记的抗小鼠 CD16/32抗体 , 4 e 共育 30min, 用 PBS 洗去游离的抗体 , 用 0. 3 ml PBS 重悬后 , 用流式细胞仪 FACSCalibur (BD 公司 ) 检 测 细胞 表 面 F4/80和 CD16/32的 表达。 CD206、 MGL 和 DECTIN -1采用间接免疫荧光染 色方法 , 取 5@105刺激后的巨噬 细胞 , PBS 洗 1次 , 100L l PBS 重悬 , 分别加入 0. 5L g 未标记的 大鼠抗小鼠 CD206抗体、 1L g 未标记的大鼠抗小 鼠 MGL 抗体或 0. 5L g 未标记的大鼠抗小鼠 DEC -T IN -1抗体 , 4e 共育 30min, 用 PBS 洗去游离的 抗体 , 100L l PBS 重悬后 , 加入 0. 25L g PE 标记 的驴抗大鼠 Ig G (H +L) 抗体 , 4e 共育 30min, 用 PBS 洗 2次 , 用 0. 3ml PBS 重悬后用流式细胞 仪 FACSCalibur 检 测。根据实验 组抗体的荧光 标 记 , 分 别 选 择 FIT C 标 记 和 PE 标 记 的 抗 小 鼠 Ig G2b 同型抗体作为阴性对照 , 未与抗体作用的巨 噬细胞作为空白对照。

1. 3统计学分析 采用 GraphPad Prism 4. 0软件 或 SPSS11. 5软件对数据进行统计分析 , 两组间差 异比较采用 Student p s t 检验 , 多组间差异比 较采 用单因素方差分析 , P <0. 05视="" 为差异具有显="" 著="" 性="" ,="" p=""><0.>

2结果

2. 1原代巨噬细胞的诱导和鉴定 首先在体外诱 导骨髓细胞分化成熟为巨噬细胞。采集骨髓细胞 , 利用小鼠成纤维细胞系 L929自发分泌单核巨噬细 胞定向分化所需的巨噬细胞集落刺激因子 (macro -phage -colony stimulating factor , M -CSF) , 加 入 L929培养上清培养 7d 后 , 发 现诱导分化的巨噬 细胞的纯度高达 92%, 适用于后续实验 (图 1)

。

图 1骨髓来源巨噬细胞 F4/80的表达

2. 2M1和 M2型巨噬细胞精氨酸代谢关键酶表达 和活性的变化 在体外培养条件下 , 参照经典方法 以 IFN -C 及 LPS 将骨髓来源巨噬细 胞诱导成 M1型巨噬细胞 , 以 IL -4诱导将其诱导成 M2型巨噬 细胞 [10, 11]。不同类型巨噬 细胞的功能差 异与精氨 酸代谢有关 , 两种代谢途径关键酶 iNOS 和 Arg -1相互竞争 , 分别介导抗感染和损伤修复的功能。因 此首先通过 RT -PCR 研究了 iNOS 和 Arg -1的表达 水平 , 而后通过二者的活性功能来评价 M 1和 M2型巨噬细胞。结果发现 :M 1型巨噬细胞 iNOS 的 表达 (图 2A ) 和活性 (图 2B) 较未刺激 M 0型巨噬细 胞显著增加 (P <0. 01)="" ,="" 而="" m2型巨噬细胞高表达="" arg="" -1(图="" 2a="" )="" 且="" 酶="" 活="" 性="" (图="" 2b)="" 显="" 著="" 升="" 高="" (p="">< 0.="" 01)="">

2. 3M1和 M2型巨噬细胞细胞因子分泌水平的检 测 M 1和 M2型巨噬细胞可通过分泌不同细胞因 子 , 发挥免疫调节的作用 , 其中 IL -12和 IL -10分 别介导了正向和负向调节功能 , 因此我们检测了巨 噬细胞这两种细胞因子的分泌水平 , 结果如图 3所 示 , IFN -C 和 LPS 刺激巨噬细胞分化 为 M 1后其 IL -12水平显著上升 , 其 IL -10的分泌略有增加 (P >0. 05) ; IL -4使巨噬细胞分化为 M 2后其 IL -10分泌水平 明显增加 (P <0. 05)="" ,="" 而="" il="" -12水="" 平很="">

2. 4M1和 M2型巨噬细胞表面分子表达的检测 巨噬细胞膜蛋白表达的差异是鉴定不同类型巨噬细 胞的重要方法。我们也对已报道 M 1型巨噬细胞的 (

# 179 #

M 1和 M 2型巨噬细胞表型的比较分析

噬细胞的标志 CD206(m annose receptor ) 、 M GL (macr ophage lectin specific fo r g alactose/N -acety-l

g alactosamine ) 、 DECT IN -1(B -g lucan receptor ) 的表达 进行了 FACS 检测 (图 4A ) 。在 IFN -C 和 LPS 刺激下 , 巨噬细胞表面 CD16/32的阳性率未 见明显改变 , 但平均荧光 强度 (mean fluorescence intensity, MFI) 较 M0型巨噬细胞明显增加 (P <0. 01)="" (图="" 4c)="" ,="" cd206、="" m="" gl="" 和="" dect="" in="" -1的阳="" 性率和="" cd206的平="" 均荧="" 光="" 强度="" 较="" m0都略="" 有="" 增="" 加="" ,="" 但没有统计学意义="" (p="">0. 05) (图 4B 和 C) ; 在 IL -4刺激分化为 M 2后 , CD16/32阳性率 和平 均荧光强度均无显著改变 (P >0. 05) (图 4C) , 而 CD206和 DECTIN -1表达阳性 率较 M0显著增 多 (P <0. 01)="" (图="" 4b)="" ,="" 其中="" dect="" in="" -1平均荧="" 光强="" 度明显上升="" (p=""><0. 01)="" ,="" (图="" 4c)="" ;="" m="" gl="">

和平均荧光强度均未见明显变化。

图 2 M1和 M2型巨噬细胞精氨酸代谢关键酶表达和活性的差异 A. 基因表达水平 ; B. 酶活性水平 (1. 未刺激组 ; 2. IFN -C +LPS ; 3.

IL

*0. *<图 3="" m="" 1和="">

1. 未刺激组 ; 2. IFN -C +LPS; 3. IL -4(*P <0.>

**

P <0.>

2. 5 M1和 M2型巨噬细胞表型的比较分析 我们 对 M 1和 M2型巨噬细胞表型指标量化后进行了比 较分析 , 以评价这些表型指标及其意义。结果如表 2所示 , 精氨酸代谢相关酶在表达和活性水平都能 较好的区分 M 1和 M2型巨噬细胞 ; IL -12的高分 泌只见于 M1型巨噬细胞 , 而 IL -10分泌在两种巨 噬细胞中的差异不明显 ; CD16/32在 M 1型巨噬细 胞中的表达要显著高于 M2, M2与 M1型巨噬细 胞相比 , CD206和 DECTIN -1表 达明显上 调。以 上结果提示 :IL -12的分泌、 iNOS 表达 和活性以 及膜蛋白 CD16/32的表达可用于鉴定 M1型巨噬 细胞 ; A rg -1表达和活性、 CD206以及 DECT IN -1的表达 , 可用于鉴定 M 2型巨噬细胞。

#

180#5现代免疫学 62008年第 28卷第 3期

图 4M1和 M2巨噬细胞膜分子的表达

1. 未刺激组 ; 2. IFN -C +LPS; 3. IL -4(*P <0. 05、="" **p=""><0.>

3讨论

巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体 , 在体 内复 杂 的 微 环 境 中 , 表 现 出 独 特 的 表 型 和 功 能 [1, 3, 12]。 Mantovani 等 [12]认为巨噬细胞存在 一系 列连续的功能状态 , 而 M 1型和 M 2型巨噬细胞是 这一连续状态两个极端。 M1型巨噬细胞通过分泌 促炎性细胞因子和趋化因子 , 并专职提呈抗原 , 参 与正向免疫应答 , 发挥免疫监视的功能 ; M 2型巨 噬细胞仅有较弱抗原提呈能力 , 并通过分泌抑制性 细胞因子 IL -10和 /或 T GF -B 等下调免疫应答 , 在 免疫调节中发挥重要作用 [13]。通过表型鉴定 巨噬 细胞的类型 , 在研究巨噬细胞在不同生理和病理条 件下所发挥的功能具有重要的意义 [14]。然而 , 至 今仍没有公认的表型标志来鉴定和区分不同类型的 巨噬细胞 , M 1型和 M 2型巨噬细胞的表型特征尚 无定论。因此 , 我们在体外按照 常规方法诱导 了 M1和 M 2型巨噬细胞 , 分别对已报道的多个表型 指标进行了检测 , 相对量化后比较分析发现 :M 1型巨噬细胞 iNOS 表 达和酶 活性水平 较未刺激 与 加 , CD16/32显示了高表达 ; M 2型巨噬细胞 Ar g -1的表达水平和酶活性较未刺激和 M 1型巨噬细胞 显著提高 , IL -10分泌只轻度增加 , 并且表达高水 平的 CD206和 DECTIN -1, 而 M GL 的表达没有明 显变化。比较分析结果表明 :IL -12的分泌、 iNOS 表达和活性以及膜蛋白 CD16/32的表达可用于鉴 定 M 1型巨噬细胞 ; 而 Arg -1表达和活性、 CD206以及 DECT IN -1的表达 , 是鉴定 M 2型巨噬细胞较 为理想的表型指标。

正常情况下 , iNOS 与 Arg -1的表达和活性在 巨噬细胞中受到严格调控 , 两者的动态平衡在维持 巨噬细胞的功能稳定中发挥重要作用。 Rauh 等 [5]发现 SH IP(Src hom olog y 2-containing inosito-l 5. -pho sphatase) 缺陷小鼠巨噬细胞 Arg -1的表达显著 增加 , 并且证实该模型中具有高 Ar g -1活性的 M2型巨噬细胞可导致小鼠发生肺实变和纤维化以及结 晶形成 , 介导了肺损伤 , 同时这种巨噬细胞 NO 产 生受损 , 从而不能有效地抑制肿瘤生长。而 H er -bert 等 [6]利用巨噬细胞 /中性粒细胞特异性 IL -4受 体缺陷小 鼠 (Ly sM Cre IL -4R A -/flox ) 证实 M 2型巨噬 # 181 #

M 1和 M 2型巨噬细胞表型的比较分析

模型中起保护作用 , 因为 Ly sM Cre IL -4R A

-f/lox

小鼠 体内巨噬细胞无法接受 T h2细胞因子 (IL -4和 IL -13) 的刺激信号 , 使 M 2型巨噬细胞产生障碍 , 表 现为 iNOS 高表达和 Arg -1低活性 , 介导肝脏和肠 道的免疫病理 损伤。 Anthony 等

[15]

在线虫感染 模

型中也证实记 忆性 T h2细胞可诱导 M 2型巨 噬细

胞发挥清除病原体的作用 , 是免疫记忆反应重要的 效应细胞 , 而这种保护效应与 Arg -1的活性有关。 因此 , iNOS 与 Ar g -1不仅可以用于鉴定 M1型和 M2型巨噬细胞 , 同时也是重要的功能表型。 IL -10高表达和 IL -12产生减少被认为是广义的 M 2型巨 噬细胞共同的表型标志 , 此表型与 M 2型巨噬细胞 的免疫调节功能有关。 W eber 等

[16]

发现 g latiramer

acetate 可诱导单核细胞高分泌 IL -10, 而 IL -12的 产生减少 , 证实这种具有 M 2表型的单核细胞可通 过诱导调节性 T 细胞减轻 EAE 的发病 , Denning 等

[17]

发现肠道黏膜固有层巨噬细胞抑制性细 胞因

子 IL -10等表达明显上调 , 也可诱导调节性 T 细胞 维持局部免疫自稳。我们的实验结果显示 IL -4刺 激巨噬细胞 后 IL -10分泌只有轻 度增加 , 并且 与 M1型巨噬细胞无显著性差异 , 这可能与不同疾病 模型中诱导 M2的因素不同有关 , IL -10对于 Th2性细胞因子诱导的 M 2模型中并不是有意义的表型 指标。我们还 鉴定出不同类型巨 噬细胞的表面 标 志 , 这在 已 有文 献 中 已有 报 道 , Stratis 等

[18]

以

CD16/32为表型证实牛皮癣模型中皮肤局部 M 1型 巨噬细 胞 的 存 在 , 可 能 与 局 部 炎 症 有 关 ; Luo 等

[19]

和 Anthony 等

[15]

将 CD206作为小鼠 M2型巨

噬细胞的表型标志 , 最近 T iem essen 等 [20]

还发 现

CD4+CD25+Fox p3+调 节性 T 细 胞可使人类巨 噬 细胞 CD206等表面分子上调表达 ; Odeg aard 等 [10]和 Vats 等

[11]

以 DECT IN -1作为 M 2型巨噬细胞的

膜分子表型 , 发现了氧化代谢和过氧化物酶体增殖 体活化受体 -C (PPAR -C , perox isom e proliferator -activated receptor -C ) 在调控 M2型巨噬细胞产生过 程中起关键作用。然而 , 与 Bisw as 等 [9]的报道不 同 , 我们的体外模型并未检测到 MGL 表达的明显 变化 , 推测 MGL 可能是肿瘤局部微环境赋予肿瘤 相关 巨 噬 细 胞 (tumo r associated macrophag es, TAM ) 特有的表型。

本研究在体外诱导实验数据基础上 , 采用比较 分析的方法 , 评价了各种鉴定巨噬细胞类型的表型 , 三个方面提出了有意义的表型鉴定指标 , 对巨噬细 胞的异质性研究具有重要的实验指导意义 , 同时为

淋巴细胞亚群的表型鉴定方法提供了新的思路 , 具 有一定的理论指导意义。 参考文献

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Comparative analysis of phenotypes of classically (M1) and alternatively (M2) activated macrophages

LI Kang, GUO Qiang, WANG Cu-i ni, CH EN M in, XU Wei #, XIONG S-i dong (I nstitute f or I mmu -nobiology &Dep ar tment of I mmunology , S hanghai M edical Colleg e, Fudan Univer sity , Shanghai 200032, China)

Abstract :T o w ell identif y and evaluate the pheno typic cha racterist ics o f M 1and M 2macrophages by quantitative co mpar ativ e analysis, bone marr ow der ived macrophages w ere stimulated w ith mur ine I FN -C plus LP S o r IL -4fo r inductio n o f M 1and M 2macr ophages respect ively. T he ex pression of inducible nitr ic ox ide synthase (iN OS) and arg inase 1(Ar g -1) w as measur ed by RT -P CR. T he iN O S and Ar g -1activ ity w as analyzed by Gr iess assay and arg inase assay , r espectively. IL -12and I L -10levels wer e quant ified by EL ISA assay. Surface ma rkers wer e determined by F ACS analysis. It show ed that IFN -C plus LP S r emark -ably induced N O release and iNO S mRN A expressio n in macrophages, w hich also produced hig her abundances of IL -12com -pared to untreated macrophages. CD16/32expr essio n was upreg ulated abo ut 5-fo ld in the presence o f IF N -C and L PS. A fter st imulatio n w ith IL -4, macr ophages sho wed high levels of A r g -1ex pression and enzyme activ ity. FA CS analysis revealed hig h ex pression o f CD206and DECT I N -1on M 2macrophages. Comparative analysis indicated that pheno types including iNO S, IL -12and CD16/32could be w ell used fo r identification o f M 1macro phag es, w hereas Ar g -1, CD206and DECT IN -1for identif-i catio n of M 2macr ophages.

Key words :M 1macrophages; M 2macr ophages; phenoty pic analysis

#

183#M 1和 M 2型巨噬细胞表型的比较分析

范文三：M1和M2型巨噬细胞表型的比较分析

《现代免疫学》２００８年第２８卷第３期

Ｍ

李

１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析

康，郭

强，王翠妮，陈

敏，徐

薇４，熊思东

（复旦大学免疫生物学研究所，复旦大学上海医学院免疫学系上海２０００３２）

摘要：通过对Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型相关指标的比较分析。评价各鉴定巨噬细胞类型的表型指标及其意义。按常规方法以ＩＦＮ一７及ＬＰＳ将骨髓来源巨噬细胞诱导成Ｍ１型巨噬细胞，以ＩＩ．－４诱导出Ｍ２型巨噬细胞。分别以ＲＴ－ＰＣＲ和酶活性定量方法检测精氨酸代谢相关酶的表达和活性；以ＥＬＩＳＡ检测ＩＬ－１２和ＩＬ一１０的分泌；以ＦＡＣＳ检测巨噬细胞膜分子的表达。结果显示：Ｍ１型巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ

ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ

ｓｙｎｔｈａｓｅ，ｉＮｏＳ）表达和活性水平较未刺激组明显

升高，ＩＬ一１２产生显著增加，ＣＤｌ６／３２表达上调；而Ｍ２型巨噬细胞Ｉ型精氨酸酶（ａｒｇｉｎａｓｅ１，Ａｒｇ一１）的表达水平和酶活性较未刺激巨噬细胞显著提高，ＩＬ－１０分泌轻度增加。并且表达高水平的ＣＤ２０６和ＤＥＣＴＩＮ一１。表型比较分析结果表明，ｉＮ—ｏｓ表达和活性、ＩＩ。一１２的分泌和膜蛋白ＣＤｌ６／３２可用于鉴定Ｍ１型巨噬细胞，而Ａｒｇ一１、ＣＤ２０６和ＤＥＣＴＩＮ一１是鉴定Ｍ２型巨噬细胞较为理想的表型指标。

关键词：Ｍ１型巨噬细胞；Ｍ２型巨噬细胞；表型分析

中图分类号：Ｒ３９２．１２

文献标识码：Ａ文章编号：１００１—２４７８（２００８）０３—０１７７－０７

巨噬细胞作为一种具有可塑性和多能性的细胞群体，在体内外不同的微环境影响下，表现出明显的功能差异［１’２］。目前根据活化状态和发挥功能的不同，巨噬细胞主要可分为Ｍ１型即经典活化的巨噬细胞（ｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ

ａｃｔｉｖａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅ），和Ｍ２

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

指标及其意义，我们参照公认的经典的方法在体外诱导了ＭＩ型和Ｍ２型巨噬细胞，对ＭＩ和Ｍ２表型相关指标进行检测，进而相对量化地比较各表型指标，以期为体内外鉴定巨噬细胞类型时表型指标的选择提供实验依据。

型即替代性活化的巨噬细胞（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）［３“］。在体外培养条件下，通过ＩＦＮ一７及脂多糖（１ｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｉ。ＰＳ）诱导产生Ｍ１型巨噬细胞和通过Ｔｈ２型细胞因子（如ＩＩ。－４、ＩＬ－１３等）诱导产生Ｍ２型巨噬细胞，具有与体内极化的巨噬细胞相似的表型和功能，已成为研究巨噬细胞异质性的重要手段。

在机体不同生理和疾病状态下，巨噬细胞表现出不同的类型，通过表型分析鉴定巨噬细胞类型已成为研究巨噬细胞功能多样性的主要方法。已有文献主要从精氨酸代谢途径［５一］、细胞因子分泌［７’８］和表面分子的表达［９’１０］等方面区分Ｍ１型与Ｍ２型巨噬细胞。然而，到目前为止，关于Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞的表型特征尚未统一。为了评价各种表型

１材料与方法

１．１１．１．１

材料实验动物

Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（Ｈ一２６、４～６周

龄，雌性），体重１６～２０ｇ，购自上海斯莱克实验动物有限公司。清洁级饲养于复旦大学实验动物科学部。

１．１．２

主要试剂细胞培养基ＲＰＭＩ

１６４０（Ｇｉｂｃｏ

ＢＲＬ公司），小牛血清（ＧｉｂｃｏＢＲＩ，公司），Ｉ．－谷氨酰胺（Ｌ—Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）（政翔化学试剂研究所），双抗（氨卞青霉素钠、硫酸链霉素）（上海第四制药厂），胰酶（华美生物工程公司）；小鼠重组ＩＦＮ一７（Ｐｅｐ－ｒｏｔｅｃｈ公司），ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ公司），小鼠重组ＩＬ一４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ公司）；ＴａｑＤＮＡ多聚酶、ｄＮＴＰ等ＰＣＲ试剂（Ｂｉｏｓｔａｒ公司），ＴＲＩｚｏｌ（北京鼎国生物公司），ＤＥＰＣ（Ｇｅｎｅｔｉｍｅｓ公司）。Ｍ—ＭｕＬＶ

收稿日期：２００８—０２—１５

Ｒｅｖｅｒｓｅ

基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０７７２０２０）Ｉ上海市医学领军人才基金资助项目（ＬＪ０６０１１）

作者简介：李康（１９８３一），男，硕士，主要从事巨噬细胞免疫调节方面的研究。

通讯作者：熊思东（Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｄｘｉｏｎｇｆｄ＠１２６．ｃｏｒｎ）｝’共同通讯作者

Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＭＢＩ公司）；ａ一异亚硝基苯丙酮（ａ—ｉｓｏｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ）（Ｓｉｇｍａ公司），

Ａｒｇｉｎｉｎｅ

（鼎国生物技术有限责任公司），ＮＯ检测试剂盒（Ｃａｙｍａｎ公司）；小鼠ＩＬ－１０ＥＬＩＳＡ检测试剂盒

《现代免疫学））２００８年第２８卷第３期

（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），小鼠ＩＬ－１２ＥＬＩＳＡ检测试剂盒（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司）；ＦＩＴＣ标记的大鼠抗小鼠Ｆ４／８０抗体（ＣＡＬＴＡＧＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ公司），ＰＥ标记的驴抗大鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｉ。）抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ公司），ＰＥ标记的抗小鼠ＣＤｌ６／３２（ＦｃＴＩＩＩ／ＦｃＴＩＩ受体，２．４Ｇ２）抗体（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司），未标记大鼠抗小鼠ＣＤ２０６抗体（Ｓｅｒｏｔｅｃ公司），未标记大

鼠抗小鼠ＭＧＩ。抗体由荷兰Ｅｒａｓｍｕｓ医学中心Ｐｉ～

ｅｔｅｒ

Ｌｅｅｎｅｎ教授惠赠，未标记大鼠抗小鼠ＤＥＣ－

Ｂｒｏｗｎ

ＴＩＮ一１抗体由南非ＣａｐｅＴｏｗｎ大学Ｇｏｒｄｏｎ教授惠赠。

１．１．３

引物

由北京赛百盛公司合成，本实验所

用引物见表ｌ。

表１引物序列

Ｉ．２１．２．１

方法

骨髓来源巨噬细胞的诱导

改进的Ｖａｔｓ

再在离心管中加入１ｍｌ７５％乙醇，振荡片刻，８０００×ｇ低温离心５ｍｉｎ；小心弃去上清，室温静置

５～１０ｍｉｎ使ＲＮＡ沉淀恰好干燥，加水溶解。将

等ｒ１¨的方法，将小鼠颈椎脱臼处死后，无菌分离股骨和胫骨，用无菌２．５ｍ１注射器吸入Ｌ９２９条件培养基（含有２０％小鼠成纤维细胞株Ｌ９２９培养３

ｄ

ＴＲＩｚｏｌ抽提的细胞总ＲＮＡ，以逆转录进行ｃＤＮＡ第一链的合成：１～５弘ｇ总ＲＮＡ中加１

弘ｌ，ｄＮＴＰ２肛ｌ，ＲＮａｓｉｎ０．５

ｐｌＯｌｉｇｏ

的上清、２０％小牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青霉素、１００ｍｇ／ｍｌ链霉素和２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺的ＤＭＥＭ培养液），吹下骨髓内容物入一无菌平皿，并将细胞充分吹匀，在Ｌ９２９条件培养基中培养，７ｄ后去除非贴壁细胞，再培养于完全ＲＰＭＩ１６４０培养基（含１０％小牛血清、１

０００

（ｄＴ）”７０℃５ｍｉｎ，于冰上加入５×缓冲液３

ｔＡ，逆转录酶２００

Ｕ，加水至总体积１５“ｌ，４２℃延伸６０ｒａｉｎ后，７０

℃１０

ｒａｉｎ。然后以ｃＤＮＡ为模板扩增ｉＮＯＳ和Ａｒｇ－

１的基因编码片段，以鼠ＧＡＰＤＨ为内参照，扩增条件如下：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性３０

Ｓ，

Ｕ／ｍｌ青霉素、１００ｍｇ／

ｍｌ链霉素和２ｍｍｏｌ／ｌ。谷氨酰胺）中，１ｄ后收集的贴壁细胞即为骨髓来源的巨噬细胞。

１．２．２

５９℃退火３０８，７２℃延伸３０Ｓ，３０个循环；７２℃

延伸１０ｍｉｎ。

１．２．４

巨噬细胞的体外刺激以０．２５％胰蛋白酶ｉＮＯＳ活性测定收集刺激后２４ｈ的培养

消化收集诱导成熟的巨噬细胞，根据各实验要求铺于２４孔或６孑Ｌ细胞培养板中，参照Ｖａｔｓ等Ｅ１１］的方法，以ＩＦＮ一７（１００Ｕ／ｍ１）和ＬＰＳ（５ｎｇ／ｍ１）共同刺激培养２４～９６ｈ，诱导出Ｍ１型巨噬细胞；参照Ｏｄｅｇａａｒｄ等ｎｏ］的方法，以ＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍ１）刺激培养２４～９６ｈ诱导出Ｍ２型巨噬细胞。

１．２．３

上清，按照ＮＯ检ｉ贝０试剂盒（硝酸还原酶法）操作说明，取２００ｐ．１培养上清，加入１００肚１

ｇｅｎｔ

ＧｒｉｅｓｓＲｅａ—

Ｒ１，再加入等体积Ｇｒｉｅｓｓ

Ｒｅａｇｅｎｔ

Ｒ２，混匀

室温静置１０ｒａｉｎ，于５４０ｎｍ处检测各样品吸光度（Ｄ值），以亚硝酸钠（ＮａＮＯ：）建立标准曲线。

１．２．５

Ａｒｇ一１活性测定参照Ｌｕｍｅｎｇ等１８１的方

ｈ

总ＲＮＡ抽提及ＲＴ—ＰＣＲ提取方法参照

法，以１００ｔＡ０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ—１００裂解刺激４８后的细胞，加入１００“ｌ

试剂盒说明书进行，向刺激２４ｈ的细胞（约１×１０６）中加入１

０００肚ｌ

５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ和１０

ＴＲｈｏｌ，立即用１ｍｌ注射器

ｍｍｏｌ／ＬＭｎＣｌ２，５６℃温育１０ｒａｉｎ，加入１００ｕｌ

０．５

抽打５次；然后加入２００“ｌ氯仿，混匀，室温静置１５ｒａｉｎ后１２０００×ｇ高速低温离心２０ｒａｉｎ；小心将上层水相移至１．５ｍｌ离心管中加入５００“ｌ异丙醇，振荡混匀。一２０℃放置３０ｍｉｎ沉淀ＲＮＡ，

１２

ｍｏｌ／ＬＡｒｇｉｎｉｎｅ，３７℃温育３０ｒａｉｎ，加入８００

弘ｌ

Ｈ：ＳＯ。／Ｈ。ＰＯ。终止。随后加入５０肛ｌ９％ａ一异亚

ｎｍ波长检测吸光度（Ｄ值），以尿

硝基苯丙酮（ａ—ｉｓｏｎｉｔｒｏｓｏｐｒｏｐｉｏｐｈｅｎｏｎｅ），９５℃温育３０

ｒａｉｎ；５４０

０００×ｇ高速低温离心１０ｒａｉｎ；小心弃去上清，

素（Ｕｒｅａ）建立标准曲线。

Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析

１．２．６

ＥＬＩＳＡ检测细胞因子分泌分别收集刺激

后２４ｈ（ＩＬ－１２）和４８ｈ（ＩＬ一１０）的培养上清。按照试

剂盒说明操作，１：２５０稀释包被抗体２００弘ｌ，４℃包被过夜，洗板３次，加入培养上清１００ｐｌ，室温孵育１ｈ后洗板３次，加入１：２５０稀释的生物素标记检测抗体１００“ｌ，室温孵育１ｈ后洗板３次，加入ｌ：２００亲和素标记辣根过氧化物酶１００扯１，室温孵育３０ｒａｉｎ后洗板７次，加入底物液１００ｔｄ，室温避光１５ｒａｉｎ后加入２ｍｏｌ／Ｌ

Ｈ２

ＳＯ。终止，

４５０

ｎｍ波长检测吸光度（Ｄ值）。

１．２．７

流式细胞术检测细胞膜蛋白表达

按上述

方法诱导培养７ｄ的骨髓细胞或刺激后的细胞，胰酶消化计数，５×１０５／管，ＰＢＳ洗１次，１００肚ｌＰＢＳ重悬，加入１弘ｇＦＩＴＣ标记的大鼠抗小鼠Ｆ４／８０抗体和１肚ｇＰＥ标记的抗小鼠ＣＤｌ６／３２抗体，４℃共育３０ｒａｉｎ，用ＰＢＳ洗去游离的抗体，用０．３

ｍｌ

ＰＢＳ重悬后，用流式细胞仪ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ

公司）检测细胞表面Ｆ４／８０和ＣＤｌ６／３２的表达。ＣＤ２０６、ＭＧＬ和ＤＥＣＴＩＮ—ｌ采用间接免疫荧光染色方法，取５×１０５刺激后的巨噬细胞，ＰＢＳ洗１次，１００肛１ＰＢＳ重悬，分别加入０．５肛ｇ未标记的大鼠抗小鼠ＣＤ２０６抗体、１弘ｇ未标记的大鼠抗小鼠ＭＧＬ抗体或０．５扯ｇ未标记的大鼠抗小鼠ＤＥＣ—ＴＩＮ一１抗体，４℃共育３０ｒａｉｎ，用ＰＢＳ洗去游离的抗体，１００弘ｌＰＢＳ重悬后，加入０．２５弘ｇＰＥ标记的驴抗大鼠ＩｇＧ（Ｈ＋Ｉ。）抗体，４℃共育３０ｍｉｎ，用ＰＢＳ洗２次，用０．３

ｍｌ

ＰＢＳ重悬后用流式细胞

仪ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ检测。根据实验组抗体的荧光标记，分别选择ＦＩＴＣ标记和ＰＥ标记的抗小鼠ＩｇＧ２ｂ同型抗体作为阴性对照，未与抗体作用的巨噬细胞作为空白对照。

１．３统计学分析采用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ４．０软件或ＳＰＳＳｌｌ．５软件对数据进行统计分析，两组问差异比较采用Ｓｔｕｄｅｎｔ’Ｓｔ检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，尸ｏ．０５）；ＩＩ。一４使巨噬细胞分化为Ｍ２后其１Ｌ—ｌｏ分泌水平明显增加（Ｐ０．０５）（图４Ｂ和Ｃ）；在ＩＬ一４刺激分化为Ｍ２后，ＣＤｌ６／３２阳性率和平均荧光强度均无显著改变（Ｐ＞０．０５）（图４Ｃ），而

ＣＤ２０６和ＤＥＣＴＩＮ一１表达阳性率较Ｍ０显著增多（Ｐ＜ｏ．０１）（图４Ｂ），其中ＤＥＣＴＩＮ一１平均荧光强度明显上升（Ｐ＜Ｏ．０１），（图４Ｃ）；ＭＧＬ的阳性率和平均荧光强度均未见明显变化。

Ａ

ＩｉＮＯＳ

ｒ————苎———１。Ａｒｇ一１

●★

０ＯＯ

蚓Ｏ懈０

舞器

Ｏ

Ｏ０

ＯＯ

Ｂ

＿亚磷酸钠

ｒ————————］

：

ｒ－ｑ尿素一…

２０

ｏ

｛

１５

弓

龟

３

昌

ｉ

据

１０谴

镪匮

翟

５

高

Ｏ

２

３

图２

Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞精氨酸代谢关键酶表达和活性的差异

Ａ．基因表达水平；Ｂ．酶活性水平（１．未刺激组；２．１ＦＮ一丫＋

ＬＰＳ；３．ＩＩ．－４）（’Ｐ＜２０．０１、。’尸＜０．０５）

《现代免疫学》２００８年第２８卷第３期

——一ＩＬ一１２

ｒ－－＇ｎ

ＩＬ一１０

２

３５０３００

口ｌ

｛

２５０台

笈ｉ２００甚

Ｊ

１１５０

●

２

１００已

５００

１

２

３

图３

Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞细胞因子分泌水平的变化

１．未刺激组；２．ＩＦ忖７＋ＬＰＳ，３．１Ｉ；４（’Ｐｄ０．０５；～Ｐｄ０．０１）

２．５

Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析我们

对Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型指标量化后进行了比较分析，以评价这些表型指标及其意义。结果如表２所示。精氨酸代谢相关酶在表达和活性水平都能较好的区分Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞；ＩＬ一１２的高分

泌只见于Ｍ１型巨噬细胞，而ＩＬ一１０分泌在两种巨噬细胞中的差异不明显；ＣＤｌ６／３２在Ｍ１型巨噬细胞中的表达要显著高于Ｍ２，Ｍ２与ＭＩ型巨噬细胞相比，ＣＤ２０６和ＤＥＣＴＩＮ一１表达明显上调。以上结果提示：ＩＬ一１２的分泌、ｉＮＯＳ表达和活性以及膜蛋白ＣＤｌ６／３２的表达可用于鉴定Ｍ１型巨噬细胞；Ａｒｇ一１表达和活性、ＣＤ２０６以及ＤＥＣＴＩＮ一１的表达，可用于鉴定Ｍ２型巨噬细胞。

表２Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析’

表型

指标

Ｍ１Ｍ２

ＩＬ—１２

蛋白分泌

十十＋一

ｉＮｏＳ基因表达

ｌ｝

一

酶活性

．４－＋

：＋／一ＣＤｌ６／３２

平均荧光强度

．

＋十＋／一陬毽晕

＋｛－七ｊ－ＭＧＬ

阳性率＋／一

＋／一平均荧光强度

一

＋／一ＩＩ，１０

蛋白分泌＋／一＋ＣＤ２０６

平均荧光强度

＋／～＋阳性率

＋／一ｕＩ＋＋

！

Ａｒｇ一１

基冈表达＋／～

十十

、

酶活性

一

ｊ

?｝＿卜？

ＤＥＣＴＩＮ一１

平均荧光强度

＋／－

十＋

阳性率＋／～＋＋＋＋

＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ｏ?＿＿－＿＿－＿?＿＿＿＿－＿＿＿＿＿－＿＿＿＿＿＿＿’－＿＿＿＿?－＿＿＿＿＿＿’＿＿＿＿＿＿＿＿＿?＿＿＿’＿－?＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿’＿＿＿?＿－＿－＿●●ｏ＿’?－＿＿－＿＿－一ｉ

ｉｉ。

’削断标准：根据Ｍ１型和Ｍ２型巨噬细胞表型指标的测定值与Ｍ０型巨噬细胞（未刺激巨噬细胞）测定值的比值Ｒａｔｉｏ（Ｒ），“一”表示Ｒ＜１；“＋／一”表示１≥Ｒ＜２；“＋”表示２－％Ｒ＜５；“＋十”表示５≤Ｒ＜１０；“ｑ－＋＋”表示Ｒ≥１０；阴影表示该表型指标在Ｍｌ型与Ｍ２犁巨噬细胞间差异具有显著性（Ｐ＜Ｏ．０１）

Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析

Ａ

未刺激组ＬＰＳ＋ＩＦＮ－Ｙ

～

ＩＬ＿－４

田盒８品孕曰高金

ｌ誊

品

蓦

品

曼

Ｖｌｏｏ

１０ｌ

一，孰Ｎ。孰

８国鲁宥离

宜

ｌ酽１０３∥ｃｌｏｏ１０ｌ

ｌ酽ｌ矿１６．气Ｉ，１０１Ｉ旷世如

ＣＤｌ６／３２

图４Ｍ１和Ｍ２巨噬细胞膜分子的表达

１．未刺激组；２．ＩＦＮ一７＋ＬＰＳ；３．ＩＬ－４（’Ｐ＜０．０５、～Ｐ＜０．０１）

３讨论

巨噬细胞是一种极具异质性的细胞群体，在体内复杂的微环境中，表现出独特的表型和功能『－ｋ３’１２］。Ｍａｎｔｏｖａｎｉ等［１２］认为巨噬细胞存在一系列连续的功能状态，而Ｍ１型和Ｍ２型巨噬细胞是这＿连续状态两个极端。Ｍ１型巨噬细胞通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子，并专职提呈抗原，参与正向免疫应答，发挥免疫监视的功能；Ｍ２型巨噬细胞仅有较弱抗原提呈能力，并通过分泌抑制性细胞因子ＩＩ。一１０和／或ＴＧＦ—Ｂ等下调免疫应答，在免疫调节中发挥重要作用『１引。通过表型鉴定巨噬细胞的类型，在研究巨噬细胞在不同生理和病理条件下所发挥的功能具有重要的意义［１引。然而，至今仍没有公认的表型标志来鉴定和区分不同类型的巨噬细胞，Ｍ１型和Ｍ２型巨噬细胞的表型特征尚无定论。因此，我们在体外按照常规方法诱导了Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞，分别对已报道的多个表型指标进行了检测，相对量化后比较分析发现：Ｍ１型巨噬细胞ｉＮＯＳ表达和酶活性水平较未刺激与Ｍ２型巨噬细胞均明显升高，ＩＬ－１２产生显著增

加，ＣＤｌ６／３２显示了高表达；Ｍ２型巨噬细胞Ａｒｇ－ｌ的表达水平和酶活性较未刺激和Ｍ１型巨噬细胞显著提高，ＩＬ－ＩＯ分泌只轻度增加，并且表达高水平的ＣＤ２０６和ＤＥＣＴＩＮ一１，而ＭＧＬ的表达没有明显变化。比较分析结果表明：ＩＬ＿１２的分泌、ｉＮＯＳ表达和活性以及膜蛋白ＣＤｌ６／３２的表达可用于鉴定Ｍ１型巨噬细胞；而Ａｒｇ一１表达和活性、ＣＤ２０６以及ＤＥＣＴＩＮ一１的表达，足鉴定Ｍ２型巨噬细胞较为理想的表型指标。

正常情况下，ｉＮＯＳ与Ａｒｇ＿１的表达和活性在巨噬细胞中受到严格调控，两者的动态平衡在维持巨噬细胞的功能稳定中发挥重要作用。Ｒａｕｈ等［５］发现ＳＨＩＰ（Ｓｒｃｈｏｍｏｌｏｇｙ

２一ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｉｎｏｓｉｔｏｌ－５，－

ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）缺陷小鼠巨噬细胞Ａｒｇ－１的表达显著增加，并且证实该模型中具有高Ａｒｇ一１活性的Ｍ２型巨噬细胞可导致小鼠发生肺实变和纤维化以及结晶形成，介导了肺损伤，同时这种巨噬细胞ＮＯ产生受损，从而不能有效地抑制肿瘤生长。而Ｈｅｒ－ｂｅｒｔ等叩３利用巨噬细胞／中性粒细胞特异性ＩＬ一４受体缺陷小鼠（ＬｙｓＭ‰ＩＬ一４Ｒａ叫““）证实Ｍ２型巨噬

细胞通过下调Ｔｈｌ反应和免疫炎症在血吸虫感染

模型中起保护作用，因为ＬｙｓＭ∞ＩＬ－４Ｒａ叫１０‘小鼠体内巨噬细胞无法接受Ｔｈ２细胞因子（ＩＬ～４和ＩＬ－１３）的刺激信号，使Ｍ２型巨噬细胞产生障碍，表现为ｉＮＯＳ高表达和Ａｒｇ一１低活性，介导肝脏和肠道的免疫病理损伤。Ａｎｔｈｏｎｙ等［１５］在线虫感染模型中也证实记忆性Ｔｈ２细胞可诱导Ｍ２型巨噬细胞发挥清除病原体的作用，是免疫记忆反应重要的效应细胞，而这种保护效应与Ａｒｇ一１的活性有关。因此，ｉＮ０ｓ与Ａｒｇ一１不仅可以用于鉴定Ｍ１型和Ｍ２型巨噬细胞，同时也是重要的功能表型。ＩＬ－１０高表达和ＩＩ。一１２产生减少被认为是广义的Ｍ２型巨噬细胞共同的表型标志，此表型与Ｍ２型巨噬细胞的免疫调节功能有关。Ｗｅｂｅｒ等ｒ１６１发现ｇｌａｔｉｒａｍｅｒａｃｅｔａｔｅ可诱导单核细胞高分泌ＩＬ一１０，而ＩＬ－１２的产生减少，证实这种具有Ｍ２表型的单核细胞可通过诱导调节性Ｔ细胞减轻ＥＡＥ的发病，Ｄｅｎｎｉｎｇ等［１７１发现肠道黏膜固有层巨噬细胞抑制性细胞因子ＩＬ－１０等表达明显上调，也可诱导调节性Ｔ细胞维持局部免疫自稳。我们的实验结果显示ＩＬ一４刺激巨噬细胞后ＩＬ－１０分泌只有轻度增加，并且与Ｍ１型巨噬细胞无显著性差异，这可能与不同疾病模型中诱导Ｍ２的因素不同有关，ＩＬ—ｌＯ对于Ｔｈ２

性细胞因子诱导的Ｍ２模型中并不是有意义的表型指标。我们还鉴定出不同类型巨噬细胞的表面标志，这在已有文献中已有报道，Ｓｔｒａｔｉｓ等ｕ８１以ｃＤｌ６／３２为衷型证实牛皮癣模型中皮肤局部Ｍ１型巨噬细胞的存在，可能与局部炎症有关；Ｌｕｏ等ｆ１鲴和Ａｎｔｈｏｎｙ等ｎ朝将ＣＤ２０６作为小鼠Ｍ２型巨噬细胞的表型标志，最近Ｔｉｅｍｅｓｓｅｎ等［２叩还发现ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋调节性Ｔ细胞可使人类巨噬细胞ＣＤ２０６等表面分子上调表达；Ｏｄｅｇａａｒｄ等Ｌｌ叫

和Ｖａｔｓ等［１门以ＤＥＣＴＩＮ—ｌ作为Ｍ２型巨噬细胞的膜分子表型，发现了氧化代谢和过氧化物酶体增殖体活化受体一７（ＰＰＡＲ一７，ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ

ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ－

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｒｅｃｅｐｔｏｒ一－／）在调控Ｍ２型巨噬细胞产生过

程中起关键作用。然而，与Ｂｉｓｗａｓ等『９】的报道不同，我们的体外模型并未检测到ＭＧＬ表达的明显变化，推测ＭＧＬ可能是肿瘤局部微环境赋予肿瘤相关巨噬细胞（ｔｕｍｏｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，

ＴＡＭ）特有的表型。

本研究在体外诱导实验数据基础上，采用比较分析的方法，评价了各种鉴定巨噬细胞类型的表型指标，并从精氨酸代谢途径、细胞囚子和表面标志

《现代免疫学｝２００８年第２８卷第３期

三个方面提出了有意义的表型鉴定指标，对巨噬细胞的异质性研究具有重要的实验指导意义，同时为淋巴细胞亚群的表型鉴定方法提供了新的思路，具有一定的理论指导意义。参考文献

Ｉ二Ｊ

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Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞表型的比较分析

?１８３?

ｃｅｌｌｓ

ｉｎｄｕｃｅ

ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ

ａｃｔｉｖａｔｅｄ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ

ｔｏ

ｍｅｄｉａｔｅ

ｆｏｒｓｋｉｎｍａｅｒｏｐｈａｇｅｓ

ｉｎａｒ／ｌｏｕｓｅ

ｍｏｄｅｌｏｆｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ－ｉｎ

ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｎｅｍａｔｏｄｅ

ｐａｒａｓｉｔｅｓ口］．ＮａｔＭｅｄ，２００６，

ｄｕｅｅｄ

ｐｓｏｒｉａｓｉｓ－ｌｉｋｅ

ｓｋｉｎ

ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎ

Ｉｎｖｅｓｔ，

１２：９５５－９６０．

２００６，１１６：２０９４—２１０４．

［１６３

ＷｅｂｅｒＭＳ，Ｐｒｏｄ’ｈｏｍｍｅ

Ｔ．Ｙｏｕｓｓｅｆ

Ｓ，ｅｔ

ａ１．Ｔｙｐｅ

１１

［１９］ＬｕｏＹ，ＺｈｏｕＨ，ＫｒｕｅｇｅｒＪ

ｅｔ

ａ１．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｅｉａｔ—

ｍｏｎｏｃｙｔｅｓｍｏｄｕｌａｔｅＴ

ｃｅｌｌ—ｍｅｄｉａｔｅｄｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓ

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ｍａｅｒｏｐｈａｇｅｓ

ａｓａ

ｎｏｖｅｌｓｔｒａｔｅｇｙ

ａｇａｉｎｓｔ

ｂｒｅａｓｔ

ｃａｎｃｅｒ

ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ

ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＮａｔＭｅｄ，２００７，１３：９３５—９４３．

口］．ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，２００６，１１６：２１３２—２１４１．

［１７］

Ｄｅｎｎｉｎｇ

ＴＬ，Ｗａｎｇ

ＹＣ．Ｐａｔｅｌ

ＳＲ，ｅｔ

ａ１．Ｌａｍｉｎａ

ｐｒｏｐｒｉａ

［２０］ＴｉｅｍｅｓｓｅｎＭＭ，ＪａｇｇｅｒＡＬ，ＥｖａｎｓＨＧ，ｅｔ

ａ１．ＣＤ４＋

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄ

ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ

ｃｅｌｌｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｉｎｄｕｃｅｒｅｇｕｌａ—

ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙＴｃｅｌｌｓ

ｉｎｄｕｃｅａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ

ａｃｔｉｖａ＋

ｔｏｒｙａｎｄ

ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１７－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＴｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．ＮａｔＩｍ—ｔｉｏｎ

ｏｆｈｕｍａｎｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｉ－Ｊ］．Ｐｒｏｃ

ＮａｔｌＡｃａｄ

ｍｕｎｏｌ，２００７，８：１０８６—１０９４．

ＳｃｉＵＳＡ，２００７，１０４：１９４４６—１９４５１．

［１８３

Ｓｔｒａｔｉｓ

Ａ，ＰａｓｐａｒａｋｉｓＭ，ＲｕｐｅｅＲＡ，ｅｔａ１．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ

ｒｏｌｅ

Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ

ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｏｆｃｌａｓｓｉｃａｌｌｙ（Ｍ１）ａｎｄａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ

（Ｍ２）ａｃｔｉｖａｔｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ

ＬＩＫａｎｇ，ＧＵＯ

Ｑｉａｎｇ，ＷＡＮＧ

Ｃｕｉ—ｎｉ，ＣＨＥＮＭｉｎ，ＸＵＷｅｉ８，ＸＩＯＮＧＳｉ—ｄｏｎｇ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＩｍｍｕ—

ｎｏｂｉｏｌｏｇｙ＆ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｎｇｈａｉＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ

２０００３２，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｗｅｌｌｉｄｅｎｔｉｆｙａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆ

Ｍ１ａｎｄＭ２ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐａｒａｔｉｖｅ

ａｎａｌｙｓｉｓ，ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｗｅｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｍｕｒｉｎｅＩＦＮ一７ｐｌｕｓＬＰＳ

ｏｒ

ＩＬ－４ｆｏｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆＭ１ａｎｄＭ２

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅｓｙｎｔｈａｓｅ（ｉＮＯＳ）ａｎｄａｒｇｉｎａｓｅ１（Ａｒｇ－１）ｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙ

ＲＴ—ＰＣＲ．ＴｈｅｉＮＯＳａｎｄＡｒｇ一１

ａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＧｒｉｅｓｓ

ａｓｓａｙ

ａｎｄａｒｇｉｎａｓｅａｓｓａｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＩＬ－１２ａｎｄＩＬ－１０ｌｅｖｅｌｓ

ｗｅｒｅｑｕａｎｔｉｆｉｅｄｂｙＥＩ。ＩＳＡａｓｓａｙ．Ｓｕｒｆａｃｅ

ｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＦＡＣＳａｎａｌｙｓｉｓ．ＩｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＩＦＮ一７ｐｌｕｓＬＰＳｒｅｍａｒｋ—

ａｂｌｙｉｎｄｕｃｅｄＮＯｒｅｌｅａｓｅａｎｄｉＮＯＳｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｗｈｉｃｈ

ａｌｓｏｐｒｏｄｕｃｅｄ

ｈｉｇｈｅｒａｂｕｎｄａｎｃｅｓｏｆＩＬ－１２ｅｏｍ—

ｐａｒｅｄ

ｔｏ

ｕｎｔｒｅａｔｅｄ

ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＣＤｌ６／３２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄａｂｏｕｔ５－ｆｏｌｄｉｎｔｈｅ

ｐｒｅｓｅｎｃｅ

ｏｆＩＦＮ＋７ａｎｄＬＰＳ．Ａｆｔｅｒ

ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｗｉｔｈＩＩ。一４，ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆＡｒｇ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＦＡＣＳａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＣＤ２０６ａｎｄＤＥＣＴＩＮ一１ｏｎ

Ｍ２ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．ＣｏｍｐａｒａｔｉｖｅａｎａｌｙｓｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉＮＯＳ，ＩＬ－

１２ａｎｄ

ＣＤｌ６／３２ｃｏｕｌｄｂｅｗｅｌｌｕｓｅｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭ１ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｗｈｅｒｅａｓＡｒｇ一１，ＣＤ２０６ａｎｄＤＥＣＴＩＮ一１ｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｉ—ｃａｔｉｏｎｏｆＭ２ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．

Ｋｅｙ

ｗｏｒｄｓ：Ｍ１ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；Ｍ２ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ

ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｎａｌｙｓｉｓ

范文四：巨噬细胞的分离和纯化_细胞成分提取

巨噬细胞的分离和纯化

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞

1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化

1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。以下过程注意无菌操作。小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。使肺组织通过00目的钢丝网，分离单个细胞。

4．以下过程均在4℃中进行。分别处理肺泡巨噬细胞和肺组织中的巨噬细胞：离心200×g 10分钟，去上清液。轻弹试管，悬浮细胞，加入10ml低渗液（20mmol/L Tris, 0.75%氯化铵，pH7.4），37℃处理3～5分钟，溶解红细胞。红细胞通常分别占肺泡巨噬细胞和组织巨噬细胞的1％和10％。也可以不用低渗处理，直接在淋巴细胞分离液上分离巨噬细胞。

5．离心200×g 10分钟，去上清液。用RPMI-1640培养液洗涤细胞一次。将细胞悬液加在淋巴细胞分离液（比重1.077）上，离心400×g 20分钟，收集交界面的巨噬细胞。弃去沉淀的死细胞和红细胞。

6．用RPMI-1640培养液洗涤巨噬细胞2次。台盼蓝染色检测细胞活力和细胞数，将细胞配成所需浓度。此时巨噬细胞活力可达90％以上，巨噬细胞占全部细胞的90％以上。

三、从小鼠脾脏、胸腺和骨髓中分离巨噬细胞

1．用外科方法无菌摘取小鼠脾脏和胸腺，置于盛有预冷RPMI-1640培养液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去结缔组织和脂肪。用无菌注射器芯将脾脏或胸腺挤压通过200目的钢丝网，获得单个细胞。

2．离心200×g 10分钟，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成约1×108～5×108/ml。

范文五：巨噬细胞增殖和凋亡与动脉粥样硬化_陈孔

[收稿日期 ]2014-

04-28[基金项目 ]国家自然科学基金资助项目 (81170278、

8107022、 81370377); 湖南省自然科学衡阳联合基金 (10JJ9019) [作者简介 ]陈孔 ,

硕士研究生 , 研究方向为动脉粥样硬化防治 , E-mail 为 642556937@qq．com 。 通讯作者曾高峰 , 博士 , 主任 医师 , 教授 , 硕士研究生导师 , E-mail 为 qichingnudou@tom．com 。 通讯作者唐朝克 , 博士 , 教授 , 博士研究生导师 , 研究方向为动 脉粥样硬化防治 ,

E-mail 为 tangchaoke@qq．com 。 [文章编号 ]1007-

3949(2014) 22-09-0965-05·文献综述 ·

巨噬细胞增殖和凋亡与动脉粥样硬化

陈 孔

1, 2

综述 , 曾高峰 2, 唐朝克

1

审校

(1．南华大学心血管疾病研究所 动脉硬化学湖南省重点实验室 生命科学研究中心 ,

2．南华大学附属第二医院心内科 , 湖南省衡阳市 421001)

[关键词 ]巨噬细胞增殖 ; 细胞凋亡 ;

动脉粥样硬化

[摘

要 ]动脉粥样硬化 (As ) 是一种由动脉壁脂质沉积所引发的一种病理生理过程 , 与巨噬细胞介导的慢性炎

性反应高度相关 。 As 早期 , 巨噬细胞通过吞噬作用清除斑块中修饰脂蛋白 、 细胞碎片和死亡细胞 , 限制斑块生长 。 随着病程进展 , 斑块中巨噬细胞凋亡增多且清除功能下降 , 引起继发性细胞坏死和炎性反应 , 促成不稳定斑块形 成 。 巨噬细胞增殖和凋亡与 As 发生发展密切相关 。 本文主要针对巨噬细胞增殖和凋亡对 As 发生发展的影响做 一综述 , 为 As 防治提供理论依据 。 [中图分类号 ]Ｒ363

[文献标识码 ]

A

Macrophage Proliferation and Apoptosis on Atherosclerosis

CHEN Kong 1, 2

, ZENG Gao-Feng 2, and TANG Chao-Ke 1

(1．Institute of Cardiovascular Ｒesearch, Key Laboratory for Atherosclerology of Hunan Province , Life Science ＲesearchCen-ter , University of South China , 2．Department of Cardiology , the Second Affiliated Hospital , University of South China , Hengyang , Hunan 421001, China )

[KEY WOＲDS]Macrophage Proliferation ;

Apoptosis ;

Atherosclerosis

[ABSTＲACT]Atherosclerosis (As ) is a pathological and physiological process triggered by lipid deposition in arterial wall , and is highly correlated with chronic inflammatory reaction mediated by macrophages．

In early stage of atherosclero-sis , macrophage limits disease progression by phagocytizing modified lipoproteins , cellular debris and dead cells．As the

disease progresses , macrophages apoptosis increases and efferocytosis defective causes the secondary necrosis and inflam-matory reaction , thus promotes the formation of unstable plaques．Macrophage proliferation and apoptosis are closely relat-ed to atherosclerosis．

Therefore , this article focuses on macrophage proliferation and apoptosis on atherosclerosis , provi-

ding the theoretical basis for atherosclerosis prevention and control．

动脉粥样硬化性心血管疾病是目前世界范围 内人类发病和死亡的主要原因之一 。 血脂异常 、 高 血压 、 胰岛素抵抗和吸烟等危险因素损伤血管内 皮 , 导致内皮功能障碍 , 为动脉粥样硬化 (atheroscle-rosis , As ) 发生始动环节 。 受损血管内皮细胞募集单 核细胞至内膜下 , 单核细胞浸润并分化为巨噬细 胞 , 通过清道夫受体吞噬过多氧化型低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein , ox-LDL ), 转变为泡 沫细胞 , 形成最早的 As 病变脂质条纹 。 荷脂的巨噬 细胞能分泌许多生长因子及炎症介质 , 促进斑块生

长及炎症反应 ; 因此巨噬细胞对 As 发生发展起重要 作用 。 众多因素控制斑块中巨噬细胞数量 , 包括单 核细胞浸润 、 巨噬细胞增殖和凋亡 、 单核细胞 /巨噬 细胞迁移 。 传统观点认为粥样斑块中巨噬细胞主 要来源于血液 , 但有新近研究表明 , 巨噬细胞局部 增殖是斑块巨噬细胞主要来源

[1]

, 提示巨噬细胞增

殖和凋亡与 As 发生发展密切相关 。 本文主要针对 巨噬细胞增殖和凋亡对 As 发生发展的影响作一综 述 , 以期为 As 防治提供新的靶点及作用途径 。

5

69CN 43-1262/Ｒ中国动脉硬化杂志 2014年第 22卷第 9期

1巨噬细胞活化与动脉粥样硬化

巨噬细胞受内膜下局部微环境信号刺激 , 活化 为具有不同功能表型的亚型 , 包括经典活化巨噬细 胞 (classically activated macrophage , CAM ; 即 M1型 巨噬细胞 ) 和选择性活化巨噬细胞 (alternatively ac-tivated macrophage , AAM ; 即 M2型 巨 噬 细 胞 ) [2]。 M1型巨噬细胞由干扰素 γ以及脂多糖等诱导 , 以 分泌促炎因子为主 , 发挥促炎功能 ; M2型巨噬细胞 由白细胞介素 4以及白细胞介素 13等诱导 , 以修复 组织 、 抗炎作用为主 。 在特殊信号诱导下 , 巨噬细 胞两种细胞表型可以相互转化 。 两种巨噬细胞亚 型功能各 异 , 对 As 的 影 响 在 不 同 阶 段 各 自 占 优 势 [3]。 As 起始阶段 , 斑块中巨噬细胞以 M2型为 主 , 通过增加甘露糖受体 、 转化生长因子 β、 白细胞 介素 10和精氨酸酶表达及分泌 , 抑制炎症反应 , 限 制斑块生长 。 随着病程进展 , 斑块中 M1型巨噬细 胞占主导 , 分泌大量肿瘤坏死因子 α、 白细胞介素 1β和白细胞介素 6等炎性因子 , 参与炎症反应 , 促 进 As 发展 [4]。 M1型巨噬细胞还可以分泌大量基 质金属蛋白酶 , 降解细胞外基质 , 降低斑块稳定性 。 同时有实验表明易损斑块肩部聚集有大量巨噬细 胞且主要为 M1型 [5]。 诱导巨噬细胞抗炎表型能降 低斑块炎症程度 , 抑制 As [6]。 本课题组实验发现肝 X 受体激动剂可以明显抑制巨噬细胞肿瘤坏死因子 α、 白细胞介素 6和白细胞介素 1β的分泌 , 降低斑 块炎症 , 为肝 X 受体 激 动 剂 抗 As 提 供 了 理 论 依 据 [7]。 越来越多实验证据表明巨噬细胞数量及炎 症表型能影响斑块发生发展 [8]。 上述结果提示巨 噬细胞既受局部微环境作用 , 同时也能影响局部炎 症状态 , 对于调节粥样斑块发生发展及斑块稳定性 有重要作用 。

2巨噬细胞增殖与动脉粥样硬化

人 、 兔和鼠粥样斑块中 , 早已证实巨噬细胞明 显增殖 。 新近研究表明动脉粥样斑块中巨噬细胞 并非完全来源于单核细胞 , 而是主要依靠自身局部 增殖 。 细胞增殖受多种因素调节 , 我们在此主要就 抑癌基因 、 生长抑制基因和骨髓生长因子对巨噬细 胞增殖及 As 的影响予以介绍 , 阐述巨噬细胞增殖与 As 的联系 。

2. 1抑癌基因 、 生长抑制基因对巨噬细胞增殖与动 脉粥样硬化的影响

通过研究基因敲除鼠 , 观察巨噬细胞增殖对 As 的影响 。 载脂蛋白 E 敲除 (apolipoprotein E knock-out , ApoE-KO ) 鼠 p27kip1失活 , 增加斑块内巨噬细 胞增殖 , 促进 As [9]。 ApoE-KO 鼠巨噬细胞特异性视 网膜母细胞瘤蛋白 (retinoblastoma protein , pＲb) 缺 乏 , 斑块内巨噬细胞增殖增加 , 促进斑块生长 [10]。 ApoE-KO 鼠促凋亡蛋白 p53失活增加内膜下巨噬 细胞增殖 , As 斑块面积变大 , 而 p53正常骨髓植入 p53和 ApoE 双敲除鼠 , 内膜下巨噬细胞增殖减少 , 抑制斑块形成 [11]。 将 p53敲除骨髓植入低密度脂 蛋白受体敲除 (low density lipoprotein receptor knock-out , LDLＲ-KO ) 鼠 , 巨噬细胞增殖及斑块脆性增加 , 促进 As [12]。 上述实验结果提示 p27kip1、 pＲb、 p53抑癌基因缺乏 , 巨噬细胞增殖增多 , 促进 As 发生 发展 。

研究表明人类 As 发生风险与染色体 9p21靠近 Ink4/Arf区域的许多单核苷酸多态性 (single nucleo-tide polymorphism , SNP ) 相关 。 Ink4/Arf区域含有生 长抑制基因 CDKN2A (编码 p16Ink4a ; AＲF:编码人 p14Arf 、 鼠 p19Arf ) 和 CDKN2B (编码 p15Ink4b ) 。 有 研究证明 , 在白细胞中 , 染色体 9p21上与 As 风险相 关的 SNP 和 Ink4/Arf表达之间存在相关性 [13], 提 示 Ink4/Arf表达可 能 与 As 发 生 相 关 。 实 验 证 明 CDKN2B 表达下调增加 As 斑块面积 [14]。 Kuo 等 [15]把 p16Ink4a /p19Arf单 倍 缺 失 表 达 的 骨 髓 移 植 到 LDLＲ-KO 鼠 , 斑块内巨噬细胞增殖增多 , 促进 As , 提示 p16Ink4a /p19Arf缺乏促进巨噬细胞增殖及 As 发展 。

2. 2骨髓生长因子对巨噬细胞增殖与动脉粥样硬 化的影响

机体中 , 骨髓生长因子包括巨噬细胞集落刺激 因子 (macrophage colony stimulating factor , M-CSF ) 和 粒细胞 -巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macro-phage colony stimulating factor , GM-CSF ) 等 , 它们对 骨髓细胞增殖起重要作用 [16]。 M-CSF 能促进巨噬 细胞增殖 、 分化 、 存活 。 动物 As 斑块中 , M-CSF 表 达增多 , 提示 M-CSF 参与 As 。 有实验发现 ApoE-KO 鼠 M-CSF 缺乏 , As 受抑制 [17]。 另外 , M-CSF 处 理股动脉内膜受损 ApoE-KO 鼠 , 促进内膜斑块形 成 , 且斑块内细胞主要来源骨髓 [18]。 以上实验结果 提示 M-CSF 可能通过刺激巨噬细胞增殖 , 促进 As 发展 。 然而也有实验证明 M-CSF 能减少高胆固醇 血症兔主动脉壁胆固醇沉积 , 抑制 As 发生发展 , 可 能是由于 M-CSF 能促进荷脂巨噬细胞胆固醇流出 , 提示 M-CSF 对巨噬细胞及 As 作用的复杂性 。 GM-CSF 在 As 中的作用目前尚无定论 。 实验

显示 LDLＲ-KO 鼠注射 GM-CSF 显著增加新生粥样 斑块中巨噬细胞增殖 , 且增殖能被抗 GM-CSF 抗体 所抑制 [19]。 另有实验表明 LDLＲ-KO 鼠缺乏 GM-CSF 能降低粥样斑块面积 [20]。 还有体外实验证明 ox-LDL 诱导巨噬细胞增殖依赖于 GM-CSF 的产生 , 抑制 GM-CSF 能 阻 断 ox-LDL 诱 导 的 巨 噬 细 胞 增 殖 [21]。 Yano 等 [22]实验发现曲格列酮能通过抑制 GM-CSF 从而抑制巨噬细胞增殖 , 部分解释了该药 抗 As 的机制 。 上述实验结果提示 GM-CSF 能增加 巨噬细胞增殖 , 促进 As , 抑制 GM-CSF , 能阻断巨噬 细胞增殖 , 有抗 As 作用 。 但在 ApoE-KO 鼠 , 实验发 现无论 GM-CSF 缺乏 [23]或补充 GM-CSF 都能促进 As [24]。 在高脂血症兔 , GM-CSF 能减少 As 发生 [25]。 出现以上不同实验结果 , 或许是因实验模型及实验 方法不同所致 。 为了阐明 As 中 GM-CSF 的作用 , 需 要更深入的研究 。

3巨噬细胞凋亡与动脉粥样硬化

巨噬细胞凋亡贯穿 As 发生发展始终 。 Gautier 等 [26]证明巨噬细胞凋亡在病变早期抑制 As , 晚期 则促进 As 。 As 早期 , 吞噬细胞 (以 M2型巨噬细胞 为主 ) 能通过胞葬作用 (efferocytosis ) 快速将凋亡细 胞清除 , 阻止继发性细胞坏死及炎症反应 , 抑制斑 块生长 。 随着病变发展 , 胞葬作用逐渐缺失 , 凋亡 的巨噬细胞 、 血管平滑肌细胞不能得到有效清除 , 继发坏死 , 释放细胞内各种蛋白酶和其它有毒物 质 , 促成斑块坏死核心形成 。 因此 , As 晚期大量巨 噬细胞凋亡将导致不稳定斑块形成 。 胞葬作用缺 失的原因 , 有实验表明与斑块 CDKN2B 表达下调有 关 [14], 也有证据提示与 M2型巨噬细胞对 ox-LDL 的 脂毒性较敏感导致细胞凋亡增多相关 [27]。 总之 , 巨 噬细胞凋亡对 As 有重要影响 。

3．1巨噬细胞凋亡对动脉粥样硬化的影响

利用不同动物模型研究巨噬细胞凋亡对 As 的 影响 。 p53敲 除 骨 髓 植 入 ApoE *3-Leiden 转 基 因 鼠 , 巨 噬 细 胞 凋 亡 降 低 , 斑 块 面 积 显 著 增 加 [28]。 p21Cip1是一种重要的细胞周期负调控蛋白 , 作为 p53一个作用靶点 , 它参与细胞生长 、 分化 、 衰老及 死亡过程 。 实验证明 ApoE-KO 鼠敲除 p21Cip1, 巨 噬细胞凋亡增多 , As 受抑制 [29]。 以上实验结果提 示巨噬细胞凋亡可能有抑制 As 发生发展的作用 。 但另有实验表明 ApoE-KO 鼠敲除 p21Cip1促进 As 进展 [30], 这或许是 As 不同时期 , 巨噬细胞凋亡所起 作用不同的表现 。 Shaposhnik 等 [31]实验发现 , 动脉 壁源性 M-CSF 缺乏促进巨噬细胞凋亡 , 减少斑块巨 噬细胞数量 , 抑制 As , 提示巨噬细胞凋亡或许要影 响到巨噬细胞数量才能表现出抑制 As 作用 。

据 Gautier 等 [26]实验结果 , 提示巨噬细胞凋亡 在 As 不同阶段所产生的影响不同 。 实验表明将促 凋亡蛋白 Bax 敲除骨髓植入 LDLＲ-KO 鼠 , 早期斑块 中巨噬细胞凋亡减少 , 增加斑块面积 [32]。 另有报 道 [33]指出 , 抗凋亡蛋白 Fortilin 能抑制 Bax 诱导的 巨噬细胞凋亡 , 促进巨噬细胞增殖 , 加速 As 发展 。 还有实验发现 ApoE-KO 鼠 p19Arf 缺乏 , 早期斑块 巨噬细胞及血管平滑肌细胞凋亡减少 , 粥样斑块面 积增加 [34]。 Arai 等 [35]实验证明 ApoE-KO 鼠凋亡抑 制因子 6失活 , 早期斑块中巨噬细胞凋亡增加 , 显著 抑制 As 进展 。 以上实验结果均提示早期病变中巨 噬细胞凋亡能抑制 As 。 实验证明 ApoE-KO 鼠脂肪 细胞型脂肪酸结合蛋白失活 , 晚期斑块中巨噬细胞 凋亡减少 , 粥样斑块变小 [36]。 也有实验表明 ApoE-KO 鼠 CHOP /GADD153(growth arrest and DNA dam-age 153) 失活 , 晚期斑块巨噬细胞凋亡减少 , 斑块坏 死程度减轻 , As 受抑制 [37]。 上述实验提示 , As 晚期 巨噬细胞凋亡降低斑块稳定性 , 促进 As 发展 。 巨噬细胞凋亡促使晚期粥样斑块坏死核心形 成 , 增加斑块脆性及血栓性事件风险 , 但巨噬细胞 凋亡的具体机制尚未被阐明 。 有研究表明内质网 应激 (endoplasmic reticulum stress , EＲS) 与自噬 (au-tophagy , AP ) 功能紊乱参与巨噬细胞凋亡 。

3．2内质网应激对巨噬细胞凋亡及动脉粥样硬化 的影响

As 发生发展中 , EＲS介导血管炎症反应和内皮 功能障碍 , 诱导巨噬细胞和血管平滑肌细胞凋亡 , 促使脂质核心形成 。 EＲS有两个主要特征 , 即内质 网腔内未折叠或错误折叠蛋白聚集和钙离子平衡 紊乱 。 持续 EＲS导致一些相关蛋白活化 , 包括活化 转录因子 6、 肌醇依赖酶 1和蛋白质激酶 Ｒ样内质 网激酶 , 这些蛋白激活导致内质网未折叠蛋白累 积 , 内质网功能开始出现障碍 。 为恢复内质网正常 功能 , 未 折 叠 蛋 白 反 应 (unfolded protein response , UPＲ) 开始启动 。 EＲS持续过长 , 或适应性反应失 效 , 细胞凋亡随之发生 。 UPＲ失效导致细胞凋亡的 一个关键物质是转录因子 CHOP , 它促使内质网释 放钙离子和半胱氨酸蛋白酶 , 同时激活钙 /钙调蛋 白依赖性蛋白激酶 Ⅱ (calcium /calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ , CaMK Ⅱ ) 。 CaMK Ⅱ 激活将诱导细 胞表面死亡受体 Fas 表达增多 , 同时活化线粒体死

亡途径 、 信号转导与转录激活因子 1和还原型辅酶 Ⅱ 氧化酶 , 促进细胞凋亡 [38]。 As 模型鼠 CHOP 缺 乏 , 巨噬细胞凋亡减少 , 斑块坏死减轻 , As 受抑制 。 EＲS特 异 性 阻 断 剂 4-苯 基 丁 酸 钠 能 够 显 著 抑 制 As [36]。 综上所述 , 持续过长的 EＲS导致巨噬细胞 凋亡增多 , 促进 As , 而阻断 EＲS能减少巨噬细胞凋 亡 , 抑制 As 。

3. 3自噬对巨噬细胞凋亡及动脉粥样硬化影响 近年研究发现 , 巨噬细胞 AP 对 As 发生发展有 重要影响 。 AP 是一种保守进化的分解代谢通路 , 将 长半衰期蛋白以及受损细胞器运送至溶酶体系统 降解 , 是维持细胞结构 、 功能的重要机制 。 哺乳动 物中 , AP 可以分为 3种方式 :巨自噬 (macro AP ) 、 微 自噬 (micro AP ) 和分子伴侣介导的自噬 (chaperone-mediated AP ) 。 巨自噬通 常 简 称 为 AP , 是 指 在 饥 饿 、 细胞分化及正常生长调节等因素刺激下 , 胞质 内形成直径为 300 900nm 、 由双层脂膜围绕被降 解物的自噬体 , 然后自噬体与溶酶体融合 , 降解其 内容物的过程 。 在 As 早期 , 基础水平巨噬细胞 AP 具有抗 As 作用 , As 晚期巨噬细胞 AP 功能失调或缺 失 促 进 血 管 炎 症 、 氧 化 应 激 、 斑 块 坏 死 [39]。 Liao 等 [40]实验发现 , 巨噬细胞自噬相关基因 5(autoph-agy-related gene 5, ATG5) 缺失 , 增加晚期斑块巨噬 细胞凋亡 、 氧化应激和斑块坏死 , 促进 As 。 另有实 验表明巨噬细胞 ATG5缺失 , 斑块白细胞介素 1β表 达明显升高 , 斑块面积增大 。 提示巨噬细胞 AP 功 能紊乱可诱导巨噬细胞凋亡 , 加剧血管炎症 , 促进 As 发展 。

4小 结

针对斑块巨噬细胞的探讨是目前 As 研究领域 的焦点 [41]。 新近研究表明巨噬细胞局部增殖是 As 病变中巨噬细胞的主要来源 , 巨噬细胞增殖与凋亡 对 As 发生发展起重要作用 , 但巨噬细胞调节 As 发 生发展的具体机制尚未阐明 。 有证据表明早期巨 噬细胞吞噬凋亡细胞 , 阻止继发性细胞坏死 , 能限 制局部炎症反应和斑块进展 。 然而 , 巨噬细胞吞噬 脂蛋白 、 凋亡细胞和细胞碎片也会降低斑块稳定 性 。 目前尚不清楚巨噬细胞增殖及凋亡在 As 各个 阶段所起的作用孰好孰坏 , 也许增殖与凋亡影响到 巨噬细胞数量与功能才是决定结果的关键 。 有实 验显示 , 巨噬细胞虽在早期有限制 As 作用 , 但晚期 巨噬细胞大量凋亡则加剧 As 。 再者 , 巨噬细胞本身 是一种炎症细胞 , 它的参与或许加剧了血管炎症反 应 , 因此巨噬细胞的净效应可能是促进 As 。 显然 , 要确定调节斑块中巨噬细胞增殖与凋亡是否有治 疗价值 , 需要更深入了解 As 中巨噬细胞增殖与凋亡 所起的作用及其作用机制 , 为 As 防治提供理论突破 点 。

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CN 43-1262/Ｒ中国动脉硬化杂志 2014年第 22卷第 9期

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