转化酶的测定_范文大全网

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g 样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml ，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

1 2 3 4 5 6 管号

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 葡萄糖原液量（ml ）

2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 加蒸馏水量（ml ）

0 100 200 300 400 500 葡萄糖浓度（μg/ml）

在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml ，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD 值。以OD 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml 反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm 波长下的OD 值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A ：转化酶的活性(mg/gfw/h) N ：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N ’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V ：酶反应液的总体积

T ：反应时间 W ：材料鲜重

转化酶的测定

2、酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中（以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照），加入pH6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即吸取2ml 加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm 波长下的OD 值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度：Y （μg/ml ）=744.63*OD值

3、结果计算：

A=Y*V/(T*W*1000)（一般范围14~40mg/g/fw//h）

A ：转化酶的活性(mg/gfw/h) Y：上式计算得酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)

V ：酶反应液的总体积100ml

T ：反应时间0.5h W：材料鲜重（fw ）

一个处理3次重复所需试验台仪器：容量瓶(100ml)

刻度试管（20mlx4，1个对照），移液管（5mlx1，2mlx1，1 ml x1），研钵试剂：10%(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g 加入用蒸馏水定容至100ml. 。

葡萄糖标准液（500μg/ml）： 80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml 。

PH=5.4,5%的磷酸缓冲液: Na2HPO 4·12.H 2O0.448125g, NaH2PO 4·2H2O 3.731125g,加水溶解定容至250ml..

（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l 或20.96gNaOH 溶液，加到500ml 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚（即苯酚）和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

预冷蒸馏水1000ml.

转化酶的测定

（一个处理，3次重复）

1g 左右样品1份，剪碎预冷的蒸馏水研磨成匀浆蒸馏水定容至100ml

3小时

混均，倒入4个离心管，在 4000转离心15分钟

分别吸2ml 上清液，放入4个试管

其中任选1个试管煮沸至少10分钟作对照，

此后（包括煮沸10分钟的对照试管）各试管加pH6.0的缓冲液5ml ，10%蔗糖溶液1m

37度水浴中保温30分钟

取出后分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟

取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温

20ml ，

540nm比色（读数即为OD 值）

转化酶的测定

10%(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g 加入用蒸馏水定容至100ml

葡萄糖标准液（500μg/ml）：葡萄糖标准液：80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml 。 PH=5.4,5%的磷酸缓冲液: Na2HPO 4·12.H 2O0.448125g, NaH2PO 4·2H2O 3.731125g,加水溶解定容至250ml..

（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l 或20.96gNaOH 溶液，加到500ml 左右含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚（即苯酚）和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

预冷蒸馏水1000ml.

植物体内转化酶活性的测定

实验五植物体内转化酶活性的测定

转化酶又称蔗糖酶(β—D —呋喃型果糖苷一果糖水解酶) ，是一种水解酶。植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶。它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆地水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖类贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量。所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用，植物细胞代谢及生长强度的指标。

【原理】

转化酶可将非还原性糖的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。将从植物组织中提取的酶液与蔗糖溶液保温作用一定时间后，测定产生的还原糖的量来表示转化酶活性的大小。

在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热，3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质) ，还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系，在540nm 波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线可求出样品中还原糖的含量。

通常，在测定过程中，溶液的pH 对酶活性影响很大。不同的酶及不同材料中同一种酶都有其最适的pH 值。转化酶有两个影响水解蔗糖能力的解离基团，一个PKa 约为7，另一个PKa 约为3。不同植物材料的转化酶中这两个基团的含量不同，它们的最适pH 也不同(最适pH 在7.0左右的为中性转化酶，最适pH 在7.0以下的为酸性转化酶) 。所以，在测定材料中转化酶的活性之前，首先要选择适宜的PH 值。如冀棉2号棉铃中纤维和种子部分的转化酶活性的最适pH 为3.5～4.0。

而本实验所选择的材料一棉花叶片中转化酶的最适pH 为 6.0。

【材料、仪器与试剂】

1．材料：棉花叶片

2．试剂，10％蔗糖溶液；葡萄糖标准液(500μg ／ml) ，0.05mol ／L pH6.0的磷酸缓冲液；3，5—二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262ml 2mol ／L NaOH 溶液，加到500ml 含有185 g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至l 000ml，贮于棕色瓶中备用。

3．设备

研钵﹑容量瓶(100ml) ﹑台式离心机﹑20ml 刻度试管﹑ 恒温水浴锅﹑分光光度计﹑移液管

【方法与步骤】

1．酶的提取：1 g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100m1，在冰箱中浸提3h ，4000rpm 离心15min(离心机型号LDZ 5—2) ，上清液即为酶的粗提液。

2．酶活性的测定：吸酶液2ml ，放入试管中，再加入pH 6.0的缓冲液5ml 及10%蔗糖溶液1ml ，在37℃水浴锅中保温0.5h ，取出后立即按3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖的含量(见下步) 。以煮沸酶液10min 钝化酶的试管作对照。

3．还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

（1）制作标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的

5min ，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml ，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD 值。以OD 值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（2）酶反应液中还原糖含量的测定；吸取2ml 反应液，加入1.5ml 3，5—二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5min ，冷却定容至20ml ，测定540nm 处的OD 值。查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

【结果与计算】

转化酶的活性用还原糖量(mg／g·fw·h)表示，计算公式如下：

A 表示转化酶的活性(mg／g·fw·h)，

N 表示酶反应液中还原糖的浓度(μg ／ml) ，

N ﹨表示钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg ／ml) ，

V 表示酶反应液的总体积，

T 表示反应时间，

W 表示材料鲜重。

转化酶的测定

试剂：

1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS ）3，5二硝基水杨酸：将6.3g 二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH 溶液，加到500ml 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml ，贮于棕色瓶中备用。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml 刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：葡萄糖原液量（ml ）

加蒸馏水量（ml ）

葡萄糖浓度（μ

g/ml） 0 2.0 0 0.4 1.6 100 0.8 1.2 200 1.2 0.8 300 1.6 0.4 400 2.0 0 500

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A ：转化酶的活性(mg/gfw/h) N ：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) N ’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V ：酶反应液的总体积

T ：反应时间 W ：材料鲜重

橡胶树蔗糖转化酶生理活性的测定

暑期社会实践论文

姓名：班级：学号：指导老师：

论文题目：橡胶树蔗糖转化酶的分离纯化和生理活性的测定实践单位：

橡胶树蔗糖转化酶的分离纯化和生理活性的测定

摘要：蔗糖转化酶在植物中能够不可逆地催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和

果糖。因在饱和硫酸铵溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质而进行分离。通过透析除盐后，再通过分子筛柱层析法和离子交换层析对其进一步纯化，得到比较纯的蔗糖转化酶。

关键词：蔗糖转化酶分离纯化生理活性硫酸铵分级沉淀分子筛柱层

析离子交换柱层析

正文：

橡胶是现代工业的重要原料, 也是国家重要的战略物资。世界上可以合成天然橡胶的植物至少有2000多种，其中巴西橡胶树优良品性而具有商业价值，热带地区广泛种植着天然橡胶。蔗糖转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。

蔗糖转化酶在植物中能够不可逆地催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和果糖。在植物中，根据其亚细胞定位，可以分为细胞壁蔗糖转化酶、液泡蔗糖转化酶以及细胞质蔗糖转化酶。根据其最适pH 可分为两大类；酸性蔗糖转化酶和碱性蔗糖转化酶(或中性蔗糖转化酶) 。碱性蔗糖转化酶存在于细胞质中。酸性蔗糖转化酶分为可溶性酸性蔗糖转化酶和细胞壁束缚蔗糖转化酶；可溶性酸性蔗糖转化酶是一种液泡酶, 存在于植物细胞的液泡中, 催化蔗糖水解成己糖, 起着调节植物组织中糖的积累和液泡中蔗糖利用的作用。细胞壁束缚的酸性主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解, 以保持库和源之间蔗糖的浓度梯度。在调控植物衰老及果实发育中起重要作用。

蔗糖转化酶在橡胶胶乳中含量很高，特别是在胶乳中的c-乳清，所以在求证蔗糖转化酶的生理活性时，首先得对这趟进行分离纯化。

一、分离胶乳中的C-乳清

在新鲜的胶乳中按1：9 加入2. 5%三氯乙酸, 4℃下20000×g 离心2 h,得中层澄清的物质即为c-乳清，取中层c-乳清再次离心，即为所得，保存在-80度下备用。

二、硫酸铵分级沉淀C-乳清及透析

1、原理：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 2、步骤：

1) 取270mlc-乳清+30ml饱和硫酸铵+0.6mlDTT+0.6mlEDTA，使硫酸铵

饱和度为10%，冰上磁力搅拌4小时。

2) 18000×g 离心30min, 上清液300ml+37.5ml饱和硫酸铵至饱和度为

20%，冰上磁力搅拌1.5小时。 3) 18000×g 离心30min ，收集沉淀。

4) 将沉淀溶解在330ml 无菌水中，加330 ml 饱和硫酸铵

+0.66mlDTT+0.66mlEDTA至饱和度为60%，冰上磁力搅拌5小时。 5) 16000×g 离心20min ，沉淀用150mlPBS 溶解。

6) 将样品加到透析袋中，置于PBS 中，冰上磁力搅拌透析过夜，期间更换透

析液。

7) 收集透析后样品，体积为183 ml

三、Sephacryl s-300 HR分子筛柱层析

1. 原理：按溶质分子量的大小，分别先后流出色谱柱，大分子先流出，小

分子后流出，当两种以上不同分子量的分子均能进入凝胶粒子内部时，则由于它们被排阻和扩散程度不同，在色谱柱柱内所经过的时间和路程长短不同，从而也得到分离。

2. 溶液（PH=7.6）：0.2M Na2HPO4（65ml ）+0.2M NaH2PO4（435ml ）

+5M NaCl （30ml ）+0.5M EDTA (2ml)+ddH2O (468ml)+0.5M DTT (2ml) 3. 步骤：

1) 装柱：柱子为1.6×60cm Sephracyl

s-30（见右图）2) 排气：排除机器和管道内的气泡 3) 上样：样品5ml

4) 层析：流速为0.2ml/min，压力为180psi ，每管收集3ml 5) 收集：3ml/管 6) 酶活的测定

7) 在酶活测定中有活性的样品在7100rpm,9min 低温条件下进行离

心。

四、DEAE-Sephacel 离子交换柱层析

1. 原理：离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电

荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH 条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH 值洗脱下来。 2. 溶液：缓冲液A ： pH7.6 磷酸缓冲液+0.02M NaCl 缓冲液D ： pH7.6 磷酸缓冲液+0.50M NaCl

3. 步骤同分子筛柱层析，只是在中间需要更换缓冲液

五、不同条件对蛋白酶活性的影响

用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)比色法

1试剂的配置：还原糖标准溶液、3，5-二硝基水杨酸试剂、蔗糖-NaF 混合液、柠檬酸-Na2HPO4缓冲液 2、标准曲线的绘制

3、蔗糖转化酶活性的测定：冰浴条件下，将50μL 样品、100μL ddH2O、50 μL 蔗糖(0. 4 mol/L)-氟化钠(0. 24 mol/L)混合液，和50μL 柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7. 2)加入1. 5 mL带螺旋盖的离心管中，混合均匀，将反应混合。物于45℃水浴中温育60min ；空白对照不作温育处理(置于冰上) ，立即加入

200μL 无水乙醇。

实验组加入200μL 无水乙醇，实验组

和对照组都在沸水浴5 min终止反应，加700μL ddH2O(终体积1mL) ，15000rpm 离心5 min ，取上清液加入到0. 3 mL3，5-二硝基水杨酸，混匀后沸水浴5 min ，冷却后加入4. 3 mL dH2O(终体积为5.0 mL) ，混匀测定520 nm 的光吸收值

4、设置不同条件进行酶活影响的测定，如不同底物浓度、不同产物浓度、不同浓度金属离子、温度等。

5、结果分析：如右图不同果糖浓度对酶活的影响

六、总结：蔗糖转化酶的最适温度是45℃，ph 值是7.6，随着底物浓度的增加，反应速度增大，担当增加到Km 值时不再增加，随着产物浓度的增加而降低。

参考文献：

1、黄德宝, 秦云霞, 唐朝荣，橡胶树三个品系(热研8-79、热研7-33-97和PR107) 胶乳生理参数的比较研究——热带亚热带植物学报 2010, 18(2): 170~175 2、刘慧英朱祝军，转化酶在高等植物蔗糖代谢中的作用研究进展——植物学通报 2002,19(6):666~674 3、热带农业科学报

4、热带亚热带植物学报 5、热带作物学报 6、江苏农业科学

高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制剂的活性

收稿日期 :2004-02-30

作者简介 :吴琼英 , 女 , 博士研究生 , 研究方向为生物资源有效成分的分离与提纯 . 通讯联系人 :马海乐 , 男 , 博士生导师 , 教授 , Tel :(0511) 5862362, E -mail :mhl @uj s . edu . cn . 基金资助 :江苏省高技术研究项目 (项目编号 :BG2003319) .

高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制剂的活性

吴琼英 , 　马海乐 , 　骆　琳 , 　吴守一

(江苏大学生物与环境工程学院 , 江苏镇江 212013)

摘要 :建立了体外直接测定血管紧张素转化酶抑制剂活性的高效液相色谱分析方法。以马尿酰 -组氨酰 -亮氨酸为

反应底物 , 血管紧张素转化酶为催化剂 , 反应所生成的马尿酸为测定指标 , 未加酶抑制剂的反应为空白对照。使用 ZORBAX SB -C 18色谱柱 (4. 6mm i . d . ×150mm , 填料粒径 5μm ) , 柱温 25℃, 流动相为乙腈 -超纯水 (体积比为 25∶ 75, 各含 0. 05%(体积分数 ) 三氟乙酸及 0. 1%(体积分数 ) 三乙胺 ) , 流速 0. 5m L /min , 检测波长 228nm 。在马尿酸浓度为 0. 005~1. 000mmol /L 时 , 马尿酸浓度与其峰面积呈良好的线性关系 (r =0. 9999) , 最小检测限为 0. 50μmol /L ; 该方法对马尿酸的回收率为 99. 48%~105. 64%, 相对标准偏差 (RSD ) 为 2. 20%(n =6) 。该方法可适用于血管紧张素转化酶抑制剂活性的体外测定 , 具有操作简便、精密度和准确性高的特点 , 为降血压药物的研制提供了方便可靠的检测手段。关键词 :高效液相色谱法 ; 血管紧张素转化酶抑制剂 ; 马尿酸

中图分类号 :O 658　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :1000-8713(2005) 01-0079-03

De te rmination of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor

Activity by High Pe rformance Liquid Chromatography

WU Qiongying , MA Haile , LUO Lin , WU Shouyi

(College of B iolog y and Environment Eng ineering , Jiang su University , Zhenjiang 212013, China )

Abstract :A high performance liquid chromatographic method to determine angiotensin -converting

enzyme inhibitor activity in vitro was established by using N -hippuryl -His -Leu tetrahydrate as the reaction substrate and hippuric acid as the reaction product . The chromatographic conditions were as follows :column , ZORBAX SB -C 18(4. 6mm i . d . ×150mm , 5μm ) ; column temperature , 25℃; mobile phase , acetonitrile -distilled water (25∶ 75, v /v , both containing 0. 05%(v /v ) trifluo -roacetic acid and 0. 1%(v /v ) triethylamine ) ; flow rate , 0. 5mL /min ; detection wavelength , 228nm . An excellent linearity over the range of 0. 005-1. 000mmol /L (r =0. 9999) was observed . The detection limit was 0. 50μmol /L . The recoveries of hippuric acid ware 99. 48%-105. 64%, with a relative standard deviation (RSD ) of 2. 20%(n =6) . It is a simple , precise and reliable as -say method for developing antihypertension drugs .

Ke y words :high performance liquid chromatography ; angiotensin -converting enzyme inhibitor ;

hippuric acid

　　血管紧张素转化酶 (angiotensin Ⅰ-converting enzyme , 简称 ACE ) 主要参与肾素 -血管紧张素 -醛固酮系统的调节。 ACE 催化血管紧张素 Ⅰ (an -giotensin Ⅰ) 能转变为具强效升高血压作用的物质血管紧张素 Ⅱ(angiotensin Ⅱ) ; 同时 , ACE 将具降压作用的物质 (bradykinin ) 降解 , 使之失去降压作用 [1, 2]

。 ACE 的这些性质在参与血压调节方面发挥着重要作用。目前用于降血压的药物 , 其降压原理主要是抑制 ACE 的活性。面对高血

压患者数量的不断增长 , 越来越多的工作者致力于血管紧张素转化酶抑制剂 (angiotensin Ⅰ-convert -ing enzyme inhibitor , 简称 ACEI ) 的开发研究 , 而在此过程中实现抑制剂降压效果体外检测的重要途径就是测试其对 ACE 活性的抑制作用。因此 , 建立一种快速、简便、准确度高的检测手段是提高降血压制

剂研究效率的保证。

　　目前 , 对于测定 ACEI 活性的研究主要采用 3

2005年 1月 January 2005

色谱 Chinese Journal of Chromatography

HT 〗

Vol . 23No . 1

79~81

种方法 :第一种是乙酸乙酯萃取法 [3], 这种方法是将反应体系的产物先用乙酸乙酯萃取 , 然后真空挥发去掉乙酸乙酯 , 再用蒸馏水溶解后在 228nm 处紫外扫描。该方法操作步骤多 , 而且由于反应所生

成的马尿酸和组氨酰 -亮氨酸均在 228nm 处有吸收 , 因而易使结果偏高 ; 第二种是高效毛细管电泳法 [4~6]

。第三种是高效液相色谱法 (HPLC ) [7]

。在初期的研究中 , HPLC 的检测样品是乙酸乙酯萃取物 ; 2002年 , Wu 等 [7]提出一种改进的直接用 HPLC 测定血管紧张素转化酶催化反应的方法 , 但采用的洗脱方式是梯度洗脱。本文以常用的治疗高血压药物卡托普利 (Captopril ) 作为 ACEI , 通过多次试验 , 得出一种直接进样、等度洗脱便能达到良好分析效果的 HPLC 测定 ACEI 活性的方法。

1　实验部分

1. 1　仪器、试剂与药品

　　 Agilent -1100高效液相色谱系统 , 配有自动进

样器、 Agilent -1100液相色谱工作站、二极管阵列检测器 (检测波长 190~700nm ) , 购自美国安捷伦公司 ; 生化培养箱、取液器 , 购自上海金林生化试剂仪器厂 ; 马尿酸 (hippuric acid , 简称 Hip ) , 购自中国医药集团上海化学试剂公司 ; 马尿酰 -组氨酰 -亮氨酸 (N -hippuryl -His -Leu tetrahydrate , 简称 HHL ) , 购自瑞士 Fluka 公司 ; 血管紧张素转化酶 (取自兔肺 , EC 3. 4. 15. 1) , 购自美国 Sigma 公司 ; 卡托普利 , 购自美国 Sigma 公司 ; 乙腈 , HPLC 级 ; 三乙胺、硼酸、硼砂、氯化钠均为分析纯。

1. 2　色谱条件

　　 ZORBAX SB -C 18分析用色谱柱 (4. 6mm i . d . ×150mm , 填料粒径为 5μm ) , 柱温 25℃, 流动相为乙腈 -超纯水 (体积比为 25∶ 75, 各含 0. 05%(体积分数 ) 三氟乙酸及 0. 1%(体积分数 ) 三乙胺 ) , 流速 0. 5mL /min , 检测波长 228nm , 自动进样 , 进样量 5μL 。 1. 3　样品制备

1. 3. 1　试剂的配制　　 Captopril 溶液 :按所需配制的浓度 , 称取适量 Captopril 样品 , 用 0. 1mol /L 硼酸缓冲液 (pH 8. 3, 含 0. 3mol /L NaCl ) 溶解 , 再用同种缓冲液配成所需浓度的 Captopril 溶液。

　　 ACE 溶液 :将 1U ACE 溶于 10mL 0. 1mol /L 硼酸缓冲液 (pH 8. 3, 含 0. 3mol /L NaCl ) 中即得。　　 HHL 溶液 :取 HHL 适量 , 以 0. 1mol /L 硼酸缓冲液 (pH 8. 3, 含 0. 3mol /L NaCl ) 溶解配成 6. 5mmol /L HHL 溶液。

, 双蒸水配制不同浓度的马尿酸标准液。 1. 3. 2　反应液的制备

　　取不同浓度的 Captopril 溶液 10μL , 加入 5μL ACE 溶液 , 在 37℃ 下保温 5min 后加入 50μL HHL

溶液开始反应 , 在 37℃ 条件下反应 30min 后加入 85μL 1. 0mol /L HCl 中止反应 , 得到反应液。 1. 3. 3　混合液及空白样品的制备　　在反应液中加入不同浓度的马尿酸标准液即得混合液。将该混合液用 0. 45μm 滤膜过滤后用于 HPLC 分析。同时用 10μL pH 8. 3的硼酸缓冲液替代 Captopril 溶液制备反应液 , 作为空白对照组。 1. 4　测定原理　　三肽 HHL 在 ACE 的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽 His -Leu (简称 HL ) 。当加入 ACEI 样品时 , ACE 的活性受到抑制 , 马尿酸和二肽的生成量减少 , 因此可通过 HPLC 测定马尿酸的生成量来评价 ACEI 对 ACE 活性的抑制率 [2~7]。计算公式为 :

R =A

×100%

(1)

式 (1) 中 , R 为 ACEI 样品对 ACE 的抑制率 (%) ; A 为空白对照组中马尿酸的峰面积 (mAU ·s ) ; B 为添

加 Captopril 组中马尿酸的峰面积 (mAU ·s ) 。

2　结果与讨论

2. 1　检测波长的确定　　用 0. 1mol /L 的磷酸缓冲液 (pH 8. 3) 配制 0. 5mmol /L 的 HHL 溶液 , 用双蒸水配制 1mmol /L 的 Hip , 然后在 190~300nm 波长处扫描 , Hip 和 HHL 的紫外吸收波谱见图 1。图 1表明 , 马尿酸在 228nm 波长处有最大吸收 , HHL 在 210~250nm 波长处有较宽的吸收峰 , 因此 HPLC 检测时可以采用 228nm 作为检测波长。

图 1　马尿酸 (1) 和 H HL (2) 的紫外吸收波谱 Fig . 1　 Ultraviole t absorbance spectra of

Hip (1) and HH L (2)

2. 2　色谱分析

·80·色谱

第 23卷

所示。由图 2可见 , 马尿酸、二肽和三肽能达到良好分离 , 但加 Captopril 组马尿酸的峰面积比空白组马

尿酸的峰面积减小。图 2还说明马尿酸的出峰时间保持稳定

。

图 2　 HP LC 测定 ACEI 活性的色谱图

Fig . 2　 The chromatograms of ACEI activity dete rmine d by HP LC

　　 a . stan dard ; b . blank sample ; c . blank sample spiked with C aptopril . Mob ile phase :aceto nitr ile -distilled water (25∶ 75, v /v ) , both co n -taining 0. 05%tr ifluo roacetic acid and 0. 1%triethylamine ; flow rate :0. 5mL /min ; temperatur e :25℃; detection wavelength :228nm .

1. Hip ; 2. HL ; 3. HHL .

2. 3　线性关系及检测限

　　取浓度为 1mmol /L 的马尿酸标准液 , 再用双蒸水分别稀释成 0. 5, 0. 1, 0. 05, 0. 01, 0. 005mmol /L 系列浓度 , 经 0. 45μm 滤膜过滤后进样分析。结果

马尿酸峰面积 S (mAU ·s ) 与浓度 C (mmol /L ) 的线性回归方程为 :S =1. 27231×104C +3. 59428, r =0. 9999, 表明马尿酸浓度与峰面积具有良好的线性关系 , 因而样品中马尿酸的峰面积能够反映样品中马尿酸的含量 , 进而反映 ACEI 的抑制活性。　　将标准马尿酸溶液进一步稀释发现 , 当其浓度为 0. 50μmol /L 时 , 其峰面积与浓度仍符合上述线性方程 , 而浓度继续降低 , 则所得的马尿酸峰面积逐步偏离标准曲线。因此 , 此法测定马尿酸的检测限为 0. 50μmol /L 。 2. 4　回收率及精密度试验

　　取 3种不同浓度 (见表 1中的表注 ) 的 Captopril 反应液 , 分别在 3种浓度的反应液中各自加入两种不同浓度 (见表 1) 的马尿酸标准液作为混合液。分别测定反应液、混合液、马尿酸标准液中马尿酸的浓度并据此计算回收率 , 结果见表 1。

　　表 1表明 , 不同浓度 Captopril 所制备的反应液中添加不同浓度的马尿酸标准液时 , 马尿酸的回收率为 99. 48%~105. 64%, 相对标准偏差 (RSD ) 为 2. 20%(n =6) 。

　　将 0. 02μmol /L Captopril 所制备的反应液中马尿酸的峰面积重复测定 5次 , 其 RSD 为 1. 25%, 方法的精密度良好。

表 1　 ACEI 样品 (Captopril ) 反应液中马尿酸的回收率 (n =6)

Table 1　 Recov eries of hippuric acid in reactions with

diff e re nt concentrations of Captopril (n =6) Reaction No . 1)

Original /(μmo l /L ) Added /

(μmol /L ) Fo und /(μmol /L ) Reco very /

%145. 051100

148. 118103. 067245. 0515095. 649101. 197311. 807100111. 28799. 480411. 8075064. 624105. 63554. 755100105. 061100. 3076

4. 755

56. 277

103. 044

　 1) Concentrations of the added Captop r il was 0. 02μmol /L in

reactio ns 1and 2, 0. 05μmol /L in r eactions 3an d 4, 0. 10μmol /L in reactio ns 5and 6.

3　结论

　　本法中反应液直接进样 , 只需等度洗脱便可使 Hip 、 HL 、 HHL 达到良好分离 , 具有简便、快捷、精密度和准确性高的特点 , 为降血压药物的药效提供了方便可靠的体外检测手段。参考文献 :

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125

81·　第 1期吴琼英等 :高效液相色谱法测定血管紧张素转化酶抑制剂的活性

血管紧张素转化酶抑制剂抑制率的测定方法

3. 食品科技

血管紧张素转化酶 (Angiotensin-converting enzyme , ACE , EC 3.4.15.1) 是人体血压调节过程中起重要作用的一种二肽羧酶,主要参与肾素 -血管紧张素 -醛固酮系统的调节。 ACE 催化水解血管紧张素 I 转变成具强升压作用的血管紧张素 Ⅱ ,同时将起血管舒张作用的舒缓激肽分解成失活片段,引起血压升高。因此抑制 ACE 的活性能减少血管紧张素 Ⅱ 的生成和舒缓激肽的失活,从而达到降低血压的目的。

目前血管紧张素转化酶抑制剂 (Angiotensincon verting enzyme inhibitor , ACEI) 主要有合成的药物如卡托普利 (Captopril) 、赖诺普利 (Lisinopril) 和依那普利 (Enalapril) 等 [1]和一些生物活性肽类特别是近年来的食源性的抑制肽类越来越受到人们的关注。虽然目前有很多学者对于这些抑制剂抑制率的测定方法进行了研究但却缺乏对不同方法的比较和分析。本文综述了对血管紧张素转化酶抑制剂抑制率测定方法的

收稿日期:2006-09-03

基金项目:广东省自然科学基金博士启动基金 (04300090) ;华南理工大学自然科学基金青年基金 (E5040970) 。作者简介:沈要林 (1983-) ,男,湖南岳阳人,硕士研究生,主要从事食品加工与保藏的研究工作。

血管紧张素转化酶抑制剂

抑制率的测定方法

沈要林,朱志伟,曾庆孝

(华南理工大学轻工与食品学院,广州 510640)

摘要:如何高效、简便、快速地测定血管紧张素转化酶抑制率有着重要意义。近年来,许多学者对血管紧张素转化酶抑制剂抑制率的测定方法开展了大量的研究工作。就血管紧张素转化酶抑制率的测定方法进行了分类和阐述,比较了不同测定方法的特点。关键词:血管紧张素转化酶;抑制率;测定方法中图分类号:TS202.3

文献标识码:B

文章编号:1005-9989(2007)03-0212-04

Analytical method for inhibitory activity of the angiotensin-converting enzyme inhibitor

SHEN Yao-lin, ZHU Zhi-wei, ZENG Qing-xiao

(College of Light Industry and Food Sciences, South China University

of Technology, Guangzhou 510640)

Abstract:It is very important to establish a efficient, simple and fast analytical method for activity of the an-giotesin-converting enzyme inhibitor. A lot of research work has been carried out about the analytical method for inhibitory activity of the angiotensin-converting enzyme in recent years. The analytical method for inhibitory activity of the angiotesin-converting enzyme was reviewed and the character of each method was compared in this paper.

Key words:angiotesin-converting enzyme; inhibitory activity; analytical method

分析检测

212

食品科技

研究,比较和分析了不同测定方法的特点。

1体外测定方法

体外测定方法原理是通过加入一些血管紧张素 Ⅰ 的模拟底物,在一定条件下通过与 ACE 作用产生具有特异吸收特性的物质。通过对加入 ACEI 前后这种物质吸收特性的差异变化计算出 ACEI 的抑制率的大小。按照主要测量仪器的不同可以分为:紫外分光光度计法、可见光分光光度计法、高效液相色谱法、高效液相色谱 -电喷雾质谱法和高效毛细管电泳法等。

1.1紫外分光光度计法

Cushman D W 和 Cheung H S 在 1971年提出了紫外分光光度法 [2]。其原理为:ACE 在 37℃ 、 pH8.3的条件下催化分解血管紧张素 I 的模拟物马尿酰组氨酰亮氨酸 (HHL) 产生马尿酸,该物质在 228nm 处具有特征吸收峰。当加入 ACEI 时, ACE 对 HHL 的催化分解作用受到抑制,马尿酸的生成量减少。通过测定加入抑制剂前后所生成马尿酸紫外吸收的大小差别即可算出抑制活性的大小。吴建平等 [3]在大豆蛋白酶解物试验中测定 ACE 抑制活性的方法为:在总体积为 0.35mL 的容器中加入 100mmol pH8.3的磷酸缓冲液, 300mmol NaCl , 5mmol HHL , 37℃ 恒温水浴 3min ,加入 0.15mL 的酶液启动反应,在恒温保持 40min 后,加入 0.25mL 1mol/L HCl 中止反应,再加入 1.5mL 乙酸乙酯用力混合 15s ,离心 15min 后取 1mL 酯层转入另一试管,在 120℃ 下经 30min 蒸干后溶于 1mL 的去离子水中,在 228nm 处测定吸光度值。在实际应用中,许多研究者根据自己的情况做了适当的改进。如在反应体系的大小、乙酸乙酯的萃取量、反应时间、离心时间和速度等方面不同。如黄艳春 [4]在酶解淡水鱼蛋白制取血管紧张素转化酶抑制肽的研究中就以马尿酸双甘肽 (Hip-Gly-Gly) 为反应基质,在 228nm 处测定吸光度值。

紫外分光光度法对试验仪器要求不高,是目前国内外采用最多的方法。但是具体操作上却要求很高,步骤比较繁琐,耗时较长。同时由于生成的马尿酸和组氨酰亮氨酸在 228nm 处都有吸收,容易产生误差,使结果偏高。本实验室在进行这种方法的实验时发现,保持反应体系在 pH8.3附近至关重要,如测定酸性条件下产物的抑制率时,需要保证缓冲体系能使反应体系保持在 pH8.3附近,否则会使结果产生很大偏差。

1.2可见光分光光度计法

Holmquist [5]等人 1979年建立了相对 Cushman 等人的方法较快的一种方法。利用呋喃丙烯酰三肽 (FA-Phe-Gly-Gly , FAPGG) 作为 ACE 作用的底物,将其水解成相应的氨基酸 (FA-Phe , FAP) 和二肽 (Gly-Gly , GG) 。这些肽类的释放会减少 FAPGG 在预期波长的吸光度。通过加入 ACE 的抑制剂前后吸光度的变化情况来计算对 ACE 抑制效率的大小。 Vanessa Vermeirssen [6]等人利用这种方法测定一些生物活性肽的 ACE 抑制效率时的方法为 :在存在稳定剂和缓冲溶液以及 0.005mmol 的 FAPGG 反应体系 (500μL) 中加入 500μL 的 ACE 抑制剂溶液混合,在 37℃ 下预保温培养 2min , 向此混合物中加入 100μL 的 ACE ,于 37℃ 下保温培养 5min ,整个反应体系保持 pH 值为 8.0~8.3,在 340nm 处测定保温前后吸光度的变化。将 ACE 抑制剂溶液改为同体积的去离子水进行试验得到空白值。这个可以去掉乙酸乙酯萃取这个繁琐的步骤,节省了时间。另外,试验的精度也提高了。 Vanessa Vermeirssen [6]利用此方法对已知抑制效率的几种 ACE 抑制剂进行验证试验表明和文献资料数据相符。

金化民等 [7]采用酶偶联法测定血清血管紧张素转化酶活性的研究。以 Hip -Gly -Gly 为反应底物 (pH8.0) ,生成马尿酸和双甘肽 (Gly-Gly) ,再加入 L-γ-谷氨酰 3-羧基 4-硝基苯胺 (GGCN , 1.0nmol/L) 和 γ-谷氨酰基转移酶 (GGT , 6.7kU/L) 催化 GGCN 与双甘肽偶联,结果表明产生的 3-羧基 4-硝基苯胺在 410nm 的吸收度与 ACE 活性有良好的线性关系。

Guan-Hong Li 等人 [8]研究了一种不需要萃取马尿酸而直接测定吸光度的方法。该方法原理为马尿酸在喹啉存在下与苯磺酰氯 (Benzene sulfonyl chlo-ride , BSC) 发生反应,反应生成的产物在 492nm 处的吸光度值与马尿酸的生成量有很大的相关性,通过对比标准曲线就可以得到实验所生成的马尿酸的量, 比较实验与空白样的差异即可求出 ACE 的抑制率。实验前段工序与紫外分光光度计法一样,只是在反应完成后加入一定量的硼酸钠缓冲液、喹啉、 BSC 和乙醇避光反应,将反应物在 492nm 处测定吸光度。该方法操作相对简单,避免了马尿酸萃取这一步,而且比传统的紫外分光光度法精确,但是耗时相对较长, 一个样品的测定大约要用到 1h 。

Bin-Wha Chang 等人 [9]研究从反应产物马尿酰 -组氨酸 (HL) 出发来测定 ACE 抑制率,研究表明 HL 在 pH12时与邻苯二醛 (OPA) 在 2-巯基乙醇存在下的反应产物在 390nm 处有特异性吸光值,通过测定 HL 的吸光度值反应出产物的生成量,从而比较得出 ACE 的抑制率。该方法操作简单,产物的稳定性好,检测限为 8μmol/L 。而且仪器设备要求低,但巯基乙醇的存在分析检测 213

2007

食品科技

是否会对 ACE 产生抑制作用,另外对于一些酶解多肽产物是否会发生不利的化学作用还有待于进一步的研究。

1.3高效液相色谱法

高效液相色谱法测定原理大都基于 Cushman 和 Cheung 的方法,只是利用高效液相色谱系统,通过特定的检测器来测定反应前后马尿酸在 228nm 处吸收值的变化。在初期利用高效液相色谱法的研究中,检测样品都是经过乙酸乙酯萃取后的样品,后来有研究去掉乙酸乙酯萃取这个步骤,也能得到很好的分析效果。随着研究的深入,人们发现利用高效液相色谱的方法来测定血管紧张素转化酶抑制效率可以达到检测效果好,分析速度快和样品用量少的特点。吴琼英等 [10]通过以马尿酰组氨酰亮氨酸 (HHL) 为反应底物,血管紧张素转化酶 (ACE) 为催化剂,反应所生成的马尿酸 (Hippuric acid) 为测定指标,利用直接进样和等度洗脱的方法测定治疗高血压药物卡托普利 (Captopril) 对 ACE 的抑制效率。使用色谱条件为: ZORBAX SB-C18色谱柱 (4.6mmid ×150mm , 5μm) ,柱温 25℃ ,流动相为乙腈 -超纯水 (体积比 25∶ 75,各含 0.05%(体积分数 ) 三氟乙酸和 0.1%(体积分数 ) 三乙胺 ) , 流量为 0.5mL/min ,检测器为二极管阵列检测器,波长为 228nm ,自动进样,进样量为 5μL 。其研究结果表明:当马尿酸浓度为 0.005~1.000mmol/L 时,马尿酸浓度与其峰面积呈良好的线性关系 (r=0.9999) ,最小检测限为 0.50μmol/L ,该方法对马尿酸的回收率为 99.48%~105.64%,试验的重复性和精密度较好。吴建平等 [11]通过对大豆蛋白水解肽的 ACE 抑制效率比较试验表明, Cushman 和 Cheung 的方法并不能很好地将 ACE 作用底物 HHL 从反应产物马尿酸 (HA) 中分离出来,因此会使马尿酸含量读数偏高。通过改进试验方法,不经过乙酸乙酯的萃取步骤,而是将反应后的混合物通过膜的过滤后直接进样进行反相液相色谱分析。色谱条件为:对称性 C18柱 (3.0×150mm , 5μm) ,采用 0.05%的三氟乙酸水溶液和 0.05%的三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱,流速为 0.5mL/min , 检测器为 DAD996二极管阵列检测器,试验结果表明用量少 (仅为 70μL) ,时间短,并且能很好地将 HHL 和 HA 分离。

1.4高效液相色谱 -电喷雾质谱法 (HPLC-ESI-MS) 最近的研究表明 [12],在传统的高效液相色谱法的基础上,连接电喷雾质谱测定 ACE 的抑制率能很好地将反应产物从混合物中分离出来,明显提高了实验结果的准确性和重复性。另外还可以降低底物浓度, 简化预处理过程。 1.5高效毛细管电泳法

高效毛细管电泳 (HPCE) 是一种发展迅猛的新型的分离分析技术,具有分析时间短、分离效率高、适应性广、检测限低、进样量小、溶剂消耗少、自动化程度高等优点。它作为高效液相色谱分析的补充, 近 10多年来在蛋白质、氨基酸、无机离子、有机化合物、药物的分离分析方面已经广泛应用。

辛志宏等 [13]研究利用高效毛细管电泳测定血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利的抑制活性,前期试验操作和 Cushman 相似,将反应后混合物采用熔融石英毛细柱 (57cm ×75μm ID) ,电泳缓冲液为 pH8.3的 50mmol/L 的磷酸盐缓冲液,电泳温度 25℃ ,进样压力 4.8kPa , 进样时间 3s ,分离电压 2kV ,检测波长 228nm 进行检测。结果在 7min 内使反应物和产物完全分离,并测定卡托普利的 IC50值为 0.019μmol/L 。

张玉忠等 [14]判断海洋蛋白酶解物抑制 ACE 活性的研究中,前期试验操作也和 Cushman 相似,将反应后混合物直接在毛细管电泳仪上进行检测,毛细管电泳仪为 Beckman CoulterP/ACEMDQ 装置,配备有 PDA 检测器,数据采集、分析、系统控制用 P/ACEMDQ 软件,进样压力为 1psi(约 6894.76Pa) ,时间为 5s ,电泳电压 20kV ,紫外吸收为 228nm ,电泳时间 5min ,电泳缓冲液为 pH9.18, 20mmol/L 的硼酸缓冲液,结果表明底物和产物马尿酸分别在 2.5min 和 3.5min 出峰,利用生成马尿酸的浓度来计算出对 ACE 的抑制效率。 Sigrid Van Dyck 等 [15]利用毛细管电泳测定血管紧张素转化酶抑制剂的抑制效果时,将底物 (含或不含抑制剂 ) 和 ACE 配置成一定浓度的溶液,按照酶 -底物 -酶的顺序注入毛细管中 (0.3psi , 5s) ,然后注入少量水。毛细管浸入缓冲溶液中,反应结束后通过 6kV 的电压对产物进行分离检测,在对反应混合物的电泳分离后,通过测定吸光度的方法测定产物马尿酸的生成量,从而计算出对 ACE 的抑制效率。

S Hillaert 等人 [16]利用毛细管电泳对利尿剂和几种常见 ACE 抑制剂的研究表明,缓冲溶液的 pH 值和浓度是影响出峰的关键因素。采用熔融石英毛细柱 (57cm ×75μm ID) ,电泳缓冲液为 pH7.25的 100mmol/L 的磷酸钠缓冲液,电泳温度 20℃ ,分离电压 20kV , 检测波长 214nm 进行检测时,能很好地将利尿剂和 ACE 抑制剂进行分离。

2体内检测方法

有研究表明,经体外检测具有较高 ACE 抑制率的抑制剂在体内并不一定具有较高抑制效率。这是因为经过消化道内酶的分解后,一些具有活性的物质

分析检测 214

食品科技

会被降解为失去活性的物质。因此再经过体内检测以确定其功效是 ACE 抑制剂评价的一个必要手段。体内检测方法主要是动物试验和临床试验。

2.1动物试验

目前原发性高血压老鼠 (Spontaneously Hyperten-sive Rats , SHR) 是应用最多的体内动物试验对象。根据试验需要购买一定数量的 SHR 适应环境饲养一周后将其分组进行试验。通过不同剂量的样品对其进行干预,其他饮食环境正常。在饲养一个月过程中对其进行血压和心率的测定。比较试验组之间以及试验组与对照组之间血压变化差异的显著性。以此来判断样品的 ACE 抑制效率大小。

Jiang-Ping Wu 等 [17]在对大豆蛋白酶解物的 ACE 抑制效率进行动物试验时,利用六周龄大的雌鼠进行试验。将试验动物按照对照组、高剂量组 (1000mg/kg of BW/day) 、中剂量组 (500mg/kg of BW/day) 、低剂量组 (100mg/kg of BW/day) 、药物组 (Captropril , 50mg/ kg of BW/day) 和正常老鼠组 (1000mg/kg of BW/day) 进行喂养。试验期间受试老鼠保持正常的饮食摄入和环境条件。采用尾套方法 (Tail-cuff method) 分别测定摄入前和摄入后 6d 、 12d 、 18d 、 24d 、 30d 测定血压情况。结果表明, 6d 后中、高剂量组能明显降低血压 (P<0.05) ,="" 12d="" 后低剂量组也能明显降低血压,而="">

动物试验持续时间较长,而且对试验环境要求较高,费用相对较高。针对不同的试验样品在剂量、测量间隔、时间、方法等方面不同。

2.2临床试验

临床试验的对象为血压超过标准血压 (收缩压 ≥ 130mmHg 或舒张压 ≤ 85mmHg 者为高血压 ) 的边界型或轻微型高血压患者。整个试验过程,试验受试对象保持正常的饮食和其他生理活动,通过测定试验前后血压变化差异对其分析。

Hiroyuki Fujita 等 [18]测定嗜热菌蛋白酶对日本柴鱼 (katsuobushi) 的水解物 Leu-Lys-Pro-Asn-Met(LKPNM) 进行超滤得到的强效型抑制剂 (S-type KO) 的 ACE 抑制活性临床试验时,对 65位边界型和轻微型高血压患者进行试验。试验前两周每天对血压进行测量取其平均值。然后随机分成两组进行 10周试验,一组以 5g/day 的剂量摄入样品,一组只是摄入安慰剂作为对照组,实验进行到一半时两组对调使用样品。每天早上 8点到 9点对患者进行血压测量。结果表明 S-type KO 能明显降低血压作用。

体内检测方法由于其成本较高和持续时间较长使其广泛应用受到一定的局限,对于开发一系列新的血管紧张素转化酶抑制剂来说,首先利用体外检测方法进行快速而准确地筛选是目前常采用的手段。但是体内检测方法尤其是临床试验是产品实现工业化的必经阶段。

3结语

综上所述,虽然目前对于 ACE 抑制率已经有很多不同的测定方法,但是不同的测定方法有不同的特点和应用范围,紫外分光光度和可见光分光光度法对设备要求不高,应用广泛可以作为初步筛选的方法。色谱法灵敏度高和重现性好,但对设备要求较高可以作为合成抑制剂和经初步筛选后的测定。而体内检测方法是最客观、也是最具有说服力的方法。因此,对于不同的实验要求可以采用不同的测定方法以提高效率。同时,建立快速、高效的测定方法还有待于进一步的研究。

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固体食品中亚硫酸盐

测定样品处理方法的探讨

王丽丽,纪淑娟 *,马明慧

(沈阳农业大学食品学院,沈阳 110161)

摘要:通过对测定食品中亚硫酸盐过程进行研究,根据样品的特性不同对所采集的样品采用浸泡、超声和蒸馏三种前处理方法。通过实验得出数据,进行分析,确定了超声法为最适宜样品前处理方法。该方法操作简便快速,避免了样品颜色的干扰和汞污染,测定结果与国标法测定结果一致,差异无统计学意义,适用于固体食品中亚硫酸盐残留量的快速测定。

关键词:盐酸副玫瑰苯胺法;亚硫酸盐;超声法;固体食品

中图分类号:TS207.3文献标识码:A 文章编号:1005-9989(2007)03-0216-05

Discussion of sample treatment for determination of sulfite in foods WANG Li-li, JI Shu-juan *, MA Ming-hui

(Shenyang Agriculture University, College of Food, Shenyang 110161)

Abstract:To study the determination of sulfite in food by pararosaniline hydrochloric spectrophotometry, then

收稿日期:2006-09-20*通讯作者

作者简介:王丽丽 (1982-) , 女, 山东牟平人, 硕士研究生, 主要从事食品检验分析的研究。

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