细胞生物学研究热点

1细胞通讯和细胞信号转导

近年来人们对信号分子受体跨膜信信号转导的机制对生命活动将有着重要意义.

号转导系统及胞内信号转导途径等方面有了深人的认识，并认为细胞内存在着多种信号转导方式和途径，各种方式和途径间又有各个层次的交叉调控，是一个十分复杂的网络系统.研究结果将成为疾病机制研究(如肿瘤、药物中毒)、药物的筛选及毒副作用研究的基础.

2细胞增殖与细胞周期的调控

细胞正常的分裂、增殖、分化与衰老维持着机体自身的稳定，细胞周期的异常会导致这一系列过程的紊乱，细胞的增殖是通过细胞周期来实现的，所以研究细胞增殖的基本规律及细胞周期的调控机制，不仅是控制机体生长发育的基础，也是研究细胞癌变发生及控制的重要途径.到目前为止，已有三类细胞周期调控因子被发现，分别是细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制物，它们之间的相互作用调节着细胞周期的进程随着研究的深人，将会发现更多的调控因子，并对调控机制有深人的了解，继而有可能人工促进不再分裂的细胞(神经元)增殖，障碍细胞(再生障碍性贫血)及增殖失控细胞(癌细胞)恢复正常有序的增殖，这方面的研究将具有重大的理论及实际意义.

3细胞的生长和分化

使原有的细胞长大与生成更多的新细胞，是细胞生长和增殖的两个概念，也是两个不同的过程.

白质和核酸的生物合成是细胞生长的分子生物学基础，最近美国科学家发现一种名为"}}3"的蛋白质，在控制细胞生长速度方面起着关键作用，这种调节分子本身可以作为一种独特的药靶，破坏它就可以终止癌细胞的生长.另外}}3的活跃程度可反映出全身细胞的生长速度，所以斑州3可作为开发高灵敏度抗癌方法的生物标志物，这种蛋白质在引导生长信号的传递途径中的真正机制还需进一步探讨.细胞生长是细胞分化的签础，细胞分化贯穿于多细胞生命的整个过程，随着研究的深人，科学家们将分化和去分化的机制，从基因水平上进行研究，并发现在大多数生物中，其分化机制是类似的，即由基因直接控制各细胞的合成，承担起细胞分化的"开关"和"管理者"功能.在对细胞分化与癌变关系的深人研究中，许多研究证明癌细胞的诱导分化是可能的，但是，要癌细胞的逆转问题还需对细胞分化及其调控的详细机制以及分化和恶性变的关系做大量深人的研究工作，才有助于了解细胞正常分化与癌变机制.

近年来的体细胞动物克隆技术取得突破，给人们带来很大变化，即高度分化的体细胞在一定条件下可以再分化，由此产生的动物克隆技术将应用于医药领域.由于它所蕴藏的商业和社会价值，将会有很大的发展前景.

4细胞的衰老和死亡

在细胞成熟与行使功能后，即走向衰老，细胞总体的衰老导致个体的老化细胞衰老有诸多因素调控当前多集中于分子水平上的研究，如探索衰老相关基因，癌基因或抑癌基因等癌肿相关基因与细胞衰老的关系，染色体端.粒与衰老的关系，以及一些与疾病有关的物质在衰老中的作用.近十余年来，随着细胞生物学、分子遗传学以及免疾学等学科的发展，对于衰老的研究已经发展成为一门新型独立的学科-老年学.随着人类寿命的延长，社会老龄化，迫切需要研究衰老过程的本质、老年病的发病机制及老年人的保健问题，为预防老年病的发病和有效治疗提供理论依据.

细胞终末分化与衰老最终导致细胞死亡.细胞死亡有两种类型:细胞程序性死亡和细胞坏死前者又称细胞凋亡.多年来的研究表明细胞凋亡与个体生长、发

育以及疾病发生与防治有着密切的关系.所以找出细胞凋亡的关键调控基因及其作用机制将是研究细胞死亡的重点工作

5干细胞及其应用

干细胞是机体内最原始的细胞，它具有较强的再生能力，在一定条件下可分化扩增出各类细胞，这一特性引起科学家的极大关注.由于干细胞的数童极少，因此分离、保存并在体外大量培养使之成长为各种组织和器官，便成为干细胞

当前干细胞的分离和培养技术获得了重大的进展，多集中在造研究的首要课题.

血干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞上.

干细胞的研究在医学领域内将有十分重大的贡献.如造血干细胞的移植对更多的血液系统疾病、包括恶性肿瘤的患者带来福音.胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一胚胎干细胞可以像普通的细胞那样，进行体外培养传代，遗传操作和冻存，但不失其多能性适当条件下可被诱导分化为多种细胞.因此胚胎干细胞是进行哺乳动物早期胚胎发生、细胞分化、基因功能、基因表达调控等发育生物学基础研究的理想模型和有效工具.在应用研究领域，胚胎干细胞尤其是人的胚胎干细胞的获得，打开了细胞治疗和组织工程的大门、对神经千细胞研究起步较晚，目前神经干细胞的研究仍处于初级阶段、由于脑和血屏障的存在，神经干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，使之在临床上有较大的应用前景.干细胞是生物个体发育和组织再生的基础.对干细胞生物学的研究必将极大地推进人类对生命的本质问题之一、即发育问题的理解.因此，该领域的研究必然会对人类重大疾病的治疗产生深远的影响.到目前为止，人们对干细胞的了解仍存在着许多盲区，说明对于干细胞的研究还需要不断地向深度和广度扩展.

6细胞工程

单一类型的分化细胞.利用遗传操作对ES细胞导人特定分化专一的转录因子，分化细胞专一标志基因或调控基因，并结合报告基因和诱导条件选择等手段，是探索ES细胞定向诱导分化的重要途径.各国科学家正借鉴小鼠F}细胞体外诱导分化的成功经验，致力于将人细胞改造成以临床基因、细胞和组织治疗为目的各种定向诱导分化细胞研究，ES细胞工程正发展成为动物细胞工程中最为活跃的分支.

细胞生物学研究的部分热点

细胞生物学研究热点---1 细胞通讯信号转导增殖调控生长分化衰老死亡干细胞细胞工程

1 细胞通讯和细胞信号转导

高等生物所处的环境无时无刻不在变化，机体功能上的协调统一要求有一个完善的在细胞间进行反映和相互作用的机制，称为细胞通讯.在通讯过程中，细胞作为一个生命的基本单位，一个相对独立的系统，如何识别周围环境中存在的各种信号，并将其转变成细胞内各种分子功能上的变化，从而改变细胞内的某些代谢过程，影响细胞的生长速度，甚至诱导细胞的死亡.所以 I}1 明细胞信号转导的机制对生命活动将有着重要意义.近年来人们对信号分子受体跨膜信号转导系统及胞内信号转导途径等方面有了深人的认识，并认为细胞内存在着多种信号转导方式和途径，各种方式和途径间又有各个层次的交叉调控，是一个十分复杂的网络系统.研究结果将成为疾病机制研究(如肿瘤、药物中毒)、药物的筛选及毒副作用研究的基础.

2 细胞增殖与细胞周期的调控

3 细胞的生长和分化

使原有的细胞长大与生成更多的新细胞，是细胞生长和增殖的两个概念，也是两个不同的过程. 白质和核酸的生物合成是细胞生长的分子生物学基础，最近美国科学家发现一种名为 “}}3”的蛋白质，在控制细胞生长速度方面起着关键作用，这种调节分子本身可以作为一种独特的药靶，破坏它就可以终止癌细胞的生长.另外}}3 的活跃程度可反映出全身细胞的生长速度，所以斑州 3 可作为开发高灵敏度抗癌方法的生物标志物，这种蛋白质在引导生长信号的传递途径中的真正机制还需进一步探讨.细胞生长是细胞分化的签础，细胞分化贯穿于多细胞生命的整个过程，随着研究的深人，科学家们将分化和去分化的机制，从基因水平上进行研究，并发现在大多数生物中，其分化机制是类似的，即由基因直接控制各细胞的合成，承担起细胞分化的“开关”和“管理者”功能.在对细胞分化与癌变关系的深人研究中，许多研究证明癌细胞的诱导分化是可能的，但是，要癌细胞的逆转问题还需对细胞分化及其调控的详细机制以及分化和恶性变的关系做大量深人的研究工作，才有助于了解细胞正常分化与癌变机制. 近年来的体细胞动物克隆技术取得突破，给人们带来很大变化，即高度分化的体细胞在一定条件下可以再分化，由此产生的动物克隆技术将应用于医药领域.由于它所蕴藏的商业和社会价值，将会有很大的发展前景.

4 细胞的衰老和死亡

老的研究已经发展成为一门新型独立的学科—老年学.随着人类寿命的延长，社会老龄化，迫切需要研究衰老过程的本质、老年病的发病机制及老年人的保健问题，为预防老年病的发病和有效治疗提供理论依据. 细胞终末分化与衰老最终导致细胞死亡.细胞死亡有两种类型:细胞程序性死亡和细胞坏死前者又称细胞凋亡.多年来的研究表明细胞凋亡与个体生长、发育以及疾病发生与防治有着密切的关系.所以找出细胞凋亡的关键调控基因及其作用机制将是研究细胞死亡的重点工作

5 干细胞及其应用

干细胞是机体内最原始的细胞，它具有较强的再生能力，在一定条件下可分化扩增出各类细胞，这一特性引起科学家的极大关注.由于干细胞的数童极少，因此分离、保存并在体外大量培养使之成长为各种组织和器官，便成为干细胞研究的首要课题.当前干细胞的分离和培养技术获得了重大的进展，多集中在造血干细胞、胚胎干细胞和神经干细胞上. 干细胞的研究在医学领域内将有十分重大的贡献.如造血干细胞的移植对更多的血液系统疾病、包括恶性肿瘤的患者带来福音.胚胎干细胞是当前生物工程领域的核心问题之一胚胎干细胞可以像普通的细胞那样，进行体外培养传代，遗传操作和冻存，但不失其多能性适当条件下可被诱导分化为多种细胞.因此胚胎干细胞是进行哺乳动物早期胚胎发生、细胞分化、基因功能、基因表达调控等发育生物学基础研究的理想模型和有效工具.在应用研究领域，胚胎干细胞尤其是人的胚胎干细胞的获得，打开了细胞治疗和组织工程的大门、对神经千细胞研究起步较晚，目前神经干细胞的研究仍处于初级阶段、由于脑和血屏障的存在，神经干细胞移植到中枢神经系统后不会产生免疫排斥反应，使之在临床上有较大的应用前景. 干细胞是生物个体发育和组织再生的基础.对干细胞生物学的研究必将极大地推进人类对生命的本质问题之一、即发育问题的理解.因此，该领域的研究必然会对人类重大疾病的治疗产生深远的影响.到目前为止，人们对干细胞的了解仍存在着许多盲区，说明对于干细胞的研究还需要不断地向深度和广度扩展.

6 细胞工程

细胞工程即应用细胞生物学和分子生物学方法，在细胞水平上进行遗传操作，它是改变细胞的遗传性和生物学特性，以获得具有特定生物学特性的细胞和生物个体的技术.动物细胞工程是在细胞培养、细胞融合和细胞拆合技术基础上发展起来的.随着基因工程技术、基因转移技术和干细胞工程技术的发展，动物细胞工程在理论和应用两方面获得了快速发展. 胚胎干细胞(ES)定向诱导分化则是干细胞工程中最重要的难题.所谓定向诱导分化是导向控制 ES 细胞分化成单一类型的分化细胞.利用遗传操作对 ES 细胞导人特定分化专一的转录因子，分化细胞专一标志基因或调控基因，并结合报告基因和诱导条件选择等手段，是探索 ES 细胞定向诱导分化的重要途径.各国科学家正借鉴小鼠 F}细胞体外诱导分化的成功经验，致力于将人细胞改造成以临床基因、细胞和组织治疗为目的各种定向诱导分化细胞研究， ES 细胞工程正发展成为动物细胞工程中最为活跃的分支.

[讲解]细胞生物学研究的部分热点

细胞生物学研究的部分热点

细胞生物学研究热点---1 细胞通讯信号转导增殖调控生长分化衰老死亡干细胞细胞工程

1 细胞通讯和细胞信号转导

2 细胞增殖与细胞周期的调控

3 细胞的生长和分化

4 细胞的衰老和死亡

在细胞成熟与行使功能后，即走向衰老，细胞总体的衰老导致个体的老化细胞衰老有诸多因素调控当前多集中于分子水平上的研究，如探索衰老相关基因，癌基因或抑癌基因等癌肿相关基因与细胞衰老的关系，染色体端.粒与衰老的关系，以及一些与疾病有关的物质在衰老中的作用.近十余年来，随着细胞生物学、分子遗传学以及免疾学等学科的发展，对于衰老的研究已经发展成为一门新型独立的学科—老年学.随着人类寿命的延长，社会老龄化，

迫切需要研究衰老过程的本质、老年病的发病机制及老年人的保健问题，为预防老年病的发病和有效治疗提供理论依据. 细胞终末分

化与衰老最终导致细胞死亡.细胞死亡有两种类型:细胞程序性死亡和细胞坏死前者又称细胞凋亡.多年来的研究表明细胞凋亡与个体生长、发育以及疾病发生与防治有着密切的关系.所以找出细胞凋亡的关键调控基因及其作用机制将是研究细胞死亡的重点工作

5 干细胞及其应用

6 细胞工程

细胞工程即应用细胞生物学和分子生物学方法，在细胞水平上进行

遗传操作，它是改变细胞的遗传性和生物学特性，以获得具有特定生物学特性的细胞和生物个体的技术.动物细胞工程是在细胞培养、细胞融合和细胞拆合技术基础上发展起来的.随着基因工程技术、基因转移技术和干细胞工程技术的发展，动物细胞工程在理论和应用两方面获得了快速发展. 胚胎干细胞(ES)定向诱导分化则是干细胞工程中最重要的难题.所谓定向诱导分化是导向控制 ES 细胞分化成单一类型的分化细胞.利用遗传操作对 ES 细胞导人特定分化专一的转录因子，分化细胞专一标志基因或调控基因，并结合报告基因和诱导条件选择等手段，是探索 ES 细胞定向诱导分化的重要途径.各国科学家正借鉴小鼠 F}细胞体外诱导分化的成功经验，致力于将人细胞改造成以临床基因、细胞和组织治疗为目的各种定向诱导分化细胞研究， ES 细胞工程正发展成为动物细胞工程中最为活跃的分支.

2013年细胞生物学考研热点话题

2011年细胞生物学考研热点话题

诱导性多能干细胞

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)最初是日本人山中申弥 (Shinya Yamanaka)于 2006年利用病毒载体将四个转录因子 (Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc )的组合转入分化的体细胞中,使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型 [1]。随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。

IPS 细胞是由一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中制造而成。在制造过程中,研究人员使用了 4种遗传基因,同时加入了 7种包括可阻碍特定蛋白质合成的物质和酶在内的化合物,以研究其各自的制造效率。研究结果显示, 没有添加化合物时, 遗传基因的导入效率为 0.01%-0.05%, 而加入了一种叫 “巴尔普罗酸” 的蛋白质合成阻碍剂之后, 导入效率竟升至 9.6%-14%。如果从这 4种遗传基因中排除导致细胞癌化的遗传基因,只使用 3种基因,过去的导入效率只有 0.001%甚至更低,而加入 “巴尔普罗酸”之后,其效率也提高了约 50倍。研究人员认为,这很可能是因为“巴尔普罗酸”可以促进多能遗传基因的活性。今后,研究人员将就添加化合物是否会使遗传基因产生变异展开研究,以在提高制造效率的同时保证安全性。

将成熟的体细胞与多潜能的细胞(ES 细胞、胚胎癌细胞等)融合,或者用胚胎干细胞提取物来处理体细胞,也可以在一定程度上使体细胞发生重编程。

1. 利用这两种方法,可以实现某些多功能性标志分子的重新表达和多种分化潜能的获得。

2. 但是,体细胞与多能性细胞的融合率较低,融合之后的细胞具有两套染色体,并且在移植后会发生排斥现象,这就制约了细胞融合的临床应用。

2006年 11月 20日,日本京都大学的山中伸弥(Shinya Yamanaka) 和美国威斯康星大学的詹姆斯·汤姆森(James Thomson ) 分别在《细胞》和《科学》杂志上发表重量级论文,宣布他们用基因改造的手段,将人类体细胞改造成了类胚胎干细胞,在功能上几乎可以和胚胎干细胞相媲美。

诱导产生的多功能性干细胞

2006年, Takahashi 和 Yamnaka 将几个转录因子导入已分化的小鼠皮肤成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞的多能性干细胞,称之为“诱导产生的多功能性干细胞”(induced pluripotent stem cells,iPS细胞) 。这一研究明确地证实了分化的细胞可以通过少数几个因子的外源导入而被重编程到具有多能性的状态,因而受到了整个生命科学领域的广泛关注

成体细胞核的重编程

1. 核重编程:核移植后供体核停止本身的基因表达程序,恢复为胚胎发育所必需的胚胎化基因表达程序状态。此过程包括:染色体结构重建、 DNA 甲基化、组蛋白乙酰化、印记基因表达、端粒长度恢复、 X 染色体失活等。

2. 重塑核结构

主要有包括核纤层 A 、 B 、 C 三种核纤层蛋白的重塑

3. 细胞质重编程— miRNA

miRNA 是决定细胞分化方向的因子。

细胞中 miRNA 成分的改变能提高细胞对调节基因表达重编程。

1.Oct3/4

Oct-4(也称 Oct-3)属于 POU 转录因子家族的一员 [1~3] 。是哺乳动物胚胎发育的一个关键的调控因子。是全能性的标志, 它能够促使 ICM 形成、维持胚胎干细胞未分化前状态并促进其增殖。

2.SOX2基因

SOX2基因是编码转录因子的主控基因(master genes)家族的一个成员。转录因子是些与 DNA 结合并调节其他基因表达的蛋白质

3. 癌症基因 c-MYC

癌症基因 c-MYC , 是一种最容易过渡表现于人类的致癌基因, 它对某些成体干细胞的自我更新起一定的作用, 并可以抑制 ES 细胞的分化。

4.Klf4

Krueppel-like factor 4, KLF4上皮锌指转录因子 Klf4 (旧称 GKLF) 调节体外细胞的增生与分化

Ips 细胞的研究概况(研究方法)

这是一种具有很强创新性的研究方法:通过外源导入与多功能相关并且能使重组细胞恢复全能性的转录基因来诱导体细胞核发生重新编程,从而使体细胞转变成多能性干细胞

这种方法所受的启示来源于“ ES细胞 -体细胞融合实验”。细胞的多能性收到许多因子精密而又复杂的调控。 ES 细胞和体细胞融合后能诱导体细胞核的重新编程, ES 细胞中存在着一些因子,这些因子对于多能性的建立可能至关重要。

Ips 细胞的研究概况(两个相关实验 )

?Ips 细胞首先由科学家 Takahashi 和 Yamanaka 在 2006年建立的。实验原理如下:利用逆转录病毒载体在小鼠成纤维细胞中导入了 4个与多功能性有关的基因:Oct4,Sox2,c-myc 和 Klf4。利用多能性标志分子 Fbx15的表达对转染后的细胞进行了筛选,最终的到了 ips 细胞,这种细胞的功能和性能几乎和胚胎干细胞一样。

?另一个实验的对象是人类皮肤成纤维细胞的重编程,而实验的过程和上一个实验基本相同; 。只是对所筛选的转录基因做了一下修饰:去掉了肿瘤相关因子 c-Myc ,使 ips 细胞的生产更加安全

1、利用 iPS 细胞作为实验模型,只操纵几个因子的表达,加速对多能性调控机理的深入研究。

2、获得的方法相对简单稳定,不涉及胚胎的破坏,无伦理道德限制。

3、对于疾病机理研究和新药开发等方面将有很大贡献。

4、可望制造特定病人来源的 iPS 细胞,用“个性化”移植来治疗诸多疾病。

Ips 细胞研究中存在的问题

1、肿瘤相关基因,如 c-myc 的使用,有诱发癌症的可能

2、逆转录病毒转染可能会导致一些癌基因的激活,也可能导致某些重要基因功能受阻。

3、基因表达模式与 ESC 还存在一些不同。

4、效率较低,重组率只有 0.1%。

micro RNA

MicroRNA (miRNA) 是一类由内源基因编码的长度约为 22 个核苷酸的非编码单链 RNA 分子 , 它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止 , 在动植物以及病毒中已经发现有 4361 个 miRNA 分子 (Release 910 , October 2006) 。大多数 miRNA 基因以单拷贝、多拷贝或基因簇 (cluster) 的形式存在于基因组中

MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约 21— 23个碱基的单链小分子 RNA ,是由具有发夹结构的约 70-90个碱基大小的单链 RNA 前体经过 Dicer 酶加工后生成,不同于 siRNA (双链)但是和 siRNA 密切相关。据推测,这些非编码小分子 RNA (miRNAs )参与调控基因表达,但其机制区别于 siRNA 介导的 mRNA 降解。第一个被确认的 miRNA 是在线虫中首次发现的 lin-4 和 let-7,随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个 miRNAs 。

已经被鉴定的 miRNAs 据推测大都是由具有发夹结构 ,约 70个碱基大小形成发夹结构的单链 RNA 前体经过 Dicer 酶加工后生成的,有 5’端磷酸基和 3’羟基,大小约 21— 25nt 的小分子 RNA 片断,定位于 RNA 前体的 3’端或者 5’端。

最近 3个研究小组分别从线虫、果蝇和 Hela 细胞中鉴定的 100个新 miRNAs 中,有 15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性(只有有 1— 2个碱基的区别), Lau 和 Bartel 实验室的同事更加认为:所有的 miRNAs 可能在其他物种中具有直向同源物(Ortholog ,指那些起源于同一祖先,在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类,这些类似的基因被称为 “直向同源物”)。

Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段 12.3kb 区域会导致果蝇的眼和翅重复生长,而由转座子介导的一段跨越该位点的 23kb 片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。 Cohen 和同事用一段 3.85kb 的片断导入 21kb 片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个 3.85kb 片断中的 EST 却没有同样的效果。 Cohen 将这个片断和疟蚊 Anopheles gambiae 的同源序列进行比较,发现一段 90bp 的高度保守区,经过 RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构,使得这个区段很象是一个 miRNA 的前体。这个结果经过 Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少

一个 21bp 的 bantam miRNA ,用这个 90bp 的 mRNA 前体经过一系列的“功能缺失”—“功能恢复”实验,证实 bantam miRNA在细胞增殖中的作用。研究人员用计算机程序检索在 hid mRNA的 3’非编码区找到了 bantam 的 3个潜在的结合位点( hid是果蝇中一个诱导凋亡的基因),并证实 bantam miRNA抑制 hid 的翻译而非转录。 miRNAs 的表达方式各不相同。部分线虫和果蝇的 miRNA 在各个发育阶段的全部细胞中都有表达,而其他的 miRNA 则依据某种更为严谨的位相和时相的表达模式(a more restricted spatial and temporal expression pattern )——在不同组织、不同发育阶段中 miRNA 的水平有显著差异。

功能

科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫,果蝇,小鼠和人等物种中已经发现的数百个 miRNAs 中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征 ——在不同组织、不同发育阶段中 miRNA 的水平有显著差异, 这种 miRNAs 表达模式具有分化的位相性和时序性 ( differential spatial and temporal expression patterns),提示 miRNAs 有可能作为参与调控基因表达的分子,因而具有重要意义。第一个被确认的 miRNA ——在线虫中首次发现的 lin-4 和 let-7,可以通过部分互补结合到目的 mRNA 靶的 3’非编码区(3’UTRs),以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制,进而抑制蛋白质合成 ,通过调控一组关键 mRNAs 的翻译从而调控线虫发育进程 (reviewed in Pasquinelli 2002)。 bantam miRNA是第一个被发现有原癌基因作用的 miRNA 。除了 lin-4、 let-7,已知还有一些 miRNAs 可能参与在细胞分化和组织发育过程中起重要作用的基因的转录后调控, 例如 mir-14、 mir-23 等。在植物 miRNAs 的研究中有两条线索提示 miRNAs 可能参与植物的发育过程。一是在 carpel factory (car) 突变株中 3个 miRNAs 的表达水平显著下降。 CARPEL FACTORY 是一个类似 Dicer 的酶,参与植物的发育,其缺失突变株表现为胚胎和叶片发育的缺陷。实验结果提示这种缺陷是由于缺少 miRNAs 加工而造成的。多数的植物 miRNAs 在某些特定组织中高水平表达也提示他们可能参与了植物组织的发育。对一部分 miRNAs 的研究分析提示:miRNAs 参与生命过程中一系列的重要进程,包括早期发育 (Reinhart 2000),细胞增殖, 细胞凋亡 ,细胞死亡 (Brennecke 2003),脂肪代谢(Xu 2003)和细胞分化 (Kawasaki 2003)。此外,一个研究表明, 2个 miRNAs 水平的下降和慢性淋巴细胞白血病之间的显著相关,提示 miRNAs 和癌症之间可能有潜在的关系 (Calin 2002)。由于 miRNAs 存在的广泛性和多样性,提示 miRNAs 可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对 miRNA 的研究还处于初级阶段, 据推测 miRNAs 在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是:miRNAs 可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。

作用方式

最早被发现的两个 miRNAs —— lin-4 and let-7被认为是通过不完全互补结合到目标靶 mRNA 3’非编码区端,以一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制,进而抑制蛋白质合成,阻断 mRNA 的翻译。多个果蝇 miRNAs 也被发现和他们的目标靶 mRNAs 的 3’非编码区有部分同源。由于 miRNAs 和其潜在的目标靶之间并非完全互补,这使得通过信息学的方法鉴定 miRNA 的目标靶位点变得困难。因而也无法确定 miRNAs 的作用方式是什么,以何种机制影响 mRNA 的翻译,以何种方式调控基因表达。 miRNAs 的作用目标靶和活性机制一直是各地的研究人员的关注热点。

在植物中目前有一个 miRNA 和 3个潜在的目标靶基因完全互补(这些 scarecrow 基因编码潜在的转录因子),尽管目前还不清楚这些基因是否就是 miRNA 的目标靶,这仍是第一次发现 miRNA 和其潜在的目标靶完全互补,也提示 miRNA 可能包含和 siRNA 类似的作用方式。

识别方法

多个研究小组采用生物化学结合是生物信息学的方法开展对 miRNAs 的研究工作。由于据推测都是由 Dicer 酶降解 RNA 得到的, 21— 23个碱基大小、有 5’端磷酸基和 3’羟基的 RNA 片断,有的实验室采用改良的定向克隆方法来筛选具有相同特征的小分子——筛选一定大小的 RNA 分子,连接到 3’和 5’的适配子(adapters ),逆转录并通过 PCR 扩增、亚克隆并测序。 miRNA 前体在基因组上的定位和聚类是通过向基因组数据库查询进行。这个方法有助于判断 miRNAs 是否是 mRNAs 、 tRNAs 、 rRNAs 等分子的降解产物。有的实验室通过一种 RNA folding

program ’mfold’ 来判断 C. elegans 和 C. briggsae 之间的高度保守区域是否含有潜在的 miRNA 前体,然后用 Northern Blots的方法来确定这些 miRNAs 是否真的表达了。尽管有数百个 miRNAs 通过生化或者是生物信息学的方法被鉴别出来,已经鉴别出来的 miRNAs 只不过是沧海一粟,由于很多已经鉴别出来的 miRNAs 是从单个克隆中鉴别出来的,所以可以假设还有很多 miRNAs 在分离和鉴定过程中被“漏掉”了,测序工作还远远不够。 miRNA 和 siRNA 的关系

miRNA 和 siRNA 之间的关系令人迷惑。从表面上说,一个是非编码的单链小分子 RNA ,在进化上高度保守,通过翻译抑制调控基因表达而不影响转录本的稳定性;另一个是针对编码区的双链小分子 RNA ,每个转录本都可能有很多个 siRNAs ,是通过降解目标靶,在转录后调控基因表达。由于每个 mRNA 模版可能产生很多个 siRNAs ,要给每个 siRNA 定一个基因的名字就很困难。 miRNA 是进化进程中高度保守的,因此给直向同源物一个同样的名字可能有助于了解他们的功能,而给另一个物种中一段无关的序列一个同样的名字就容易造成混乱。

然而,据推测 miRNAs 通常是由较大的(7090 nt )的茎环结构(发夹结构)前体经 Dicer 酶切割得到的, 而 Dicer 同样负责将长双链 RNA 切割为 siRNA ,而且二者的长度也差不多,同样有调控基因表达功能。因而这两类小分子 RNA 之间的关系格外令人关注。

两个广为人知的 miRNA ——在线虫中首次发现的 lin-4 和 let-7, 可以通过部分互补结合到目的 mRNA 靶的 3’ 非编码区(3’UTRs),通过一种未知方式诱发蛋白质翻译抑制从而抑制蛋白质合成。这种结合并不诱导 mRNA 靶的降解,就是说作为翻译抑制子本身不影响对应 mRNA 的丰度,其原因据推测是由于 miRNA 和结合位点之间不完全互补。这就区别于 siRNA 的介导的 mRNA 的降解。但是其他一些 miRNAs 可能以类似 siRNA 的方式介导目的 RNA 的降解。实验表明引入和 let-7目的 mRNA 靶完全互补的 miRNA 会诱导 mRNA 靶的降解。还有实验结果表明一些 miRNA , 包括在植物中发现的 Scarecrow miRNA,能结合完全互补的 mRNA 链从而降解 mRNA 序列,抑制蛋白合成。这提示 miRNAs 可以和 siRNAs 一样作用,这两种小分子 RNA 作用通路可能有重叠的部分。这种重叠同样提示 siRNAs 可能也有和 miRNAs 同样的功能。

一个很有趣的实验证实这个观点:Doench 和同事挑选一个已知在体内可以有效使 CXCR4基因沉默的 siRNA , 然后在荧光素酶报告基因的 3’端插入对应的 CXCR4结合位点——其中一个拷贝是插入一个完全匹配的 CXCR4结合位点,另一个拷贝插入 4个只有 3’和 5’端匹配,而中间不同的 CXCR4结合位点,这样选定的 siRNA 就不能完全结合到这个结合位点——中间形成一个突起的不匹配的环。将这两个拷贝转入 Hela 细胞并用 siRNA 诱导基因沉默。结果很有趣——两个实验都录得荧光素酶活性下降了超过 10倍, RT-PCR 和 Northern 分析证实,第一个实验的荧光素酶转录本下降了超过 10倍,这正是正常的 siRNA 介导的 RNAi 反应,目标靶 mRNA 降解导致表达水平的下降,而第二个实验中荧光素酶转录本仅仅下降 1.2倍,这种目的基因表达水平下看起来象源于 miRNA 介导的翻译抑制降,而不是 siRNA 介导的影响 mRNA 的稳定性导致。实验表明:siRNA 可能以 miRNA 的方式作用于 mRNA 。实验人员还进行了另一个实验:改变第二个实验中的不匹配环的碱基序列看起来不影响抑制效果,但是 siRNA 和报告基因上的结合位点的匹配程度越高抑制效果越好,增加 siRNA 的量,抑制效果越好——这一点和 siRNA 抑制的情况一样——唯一不同的是:完全匹配的结合位点(siRNA 作用方式)可以单独起作用而相互不影响,而增加不完全配对的结合位点(注意在第二个实验中用了 4个 CXCR4结合位点)的个数对翻译抑制有显著的加乘作用。在哺乳动物细胞中还没有找到内源的 siRNA ,外源的 siRNA 介导的 RNAi 作用正是一种抵御机制。而 miRNAs 则广泛存在于哺乳动物细胞中,从理论上推测可能参与多种调控作用。这两种小东西的作用机制和相互关系的本质就显得更加扑朔迷离。如何在实验中正确鉴定 siRNA 和 miRNA ,甚至是其他的小分子 RNA 都成为一个值得关注的问题。

真核细胞基因结构功能生物学的前沿课题

真核细胞基因结构功能

——生物学的前沿课题

著名生物学家威尔逊早在,,世纪,,年代就提出“一切生物学关键问题必须在细胞中找寻”。细胞是一切生命活动结构与功能的基本单位，细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的科学。

据此间《光明日报》近日报道，细胞生物学的研究范围广泛，其核心可归结为遗传和发育问题。遗传是在发育中实现的，而发育又要以遗传为基础。当前细胞生物学的主要发展趋势是用分子生物学及物理、化学方法，深入研究真核细胞基因组的结构及其表达的调节和控制，以期从根本上揭示遗传和发育的关系，以及细胞衰老、死亡和癌变的原因等基本生物问题，并为把遗传工程技术应用到高等生物，改变其遗传性提供理论依据。,,世纪,,年代以来，分子生物学取得很大进展，这些进展促进了细胞结构和功能调控在分子水平上的研究。

目前对细胞研究在方法学上的特点是高度综合性，使用分子遗传学手段，对新的结构成分、信号或调节因子的基因分离、克隆和测序，经改造和重组后，将基因(或蛋白质产物)导入细胞内，再用细胞生物学方法，如激光共聚焦显微镜、电镜、免疫细胞化学和原位杂交等，研究这些基因表达情况或蛋白质在活细胞或离体系统内的作用。分子遗传学方法和细胞生物学的形态定位方法紧密结合，已成为当代细胞生物学研究方法学上的特点。另一方面，用分子遗传学和基因工程方法，如重组,,,技术、,,,、同源重组和转基因动植物等，对高等生物发育的研究也取得出乎意料的惊人进展。对高等动物发育过程，从卵子发生、成熟、模式形成和形态发生等方面，在基因水平的研究正全面展开并取得巨大进展。

自从“人类基因组计划”实施以来，取得了出乎意料的迅速进展。,,,,年,月，国际人类基因组计划发布了“人类基因组工作框架图”，可称之为“人类基因草图”，这个草图实际上涵盖了人类基因组,,,以上的信息。从“人类基因组工作框架图”中我们可以知道这部“天书”是怎样写的和用什么符号写的。,,,,年,月，包括中国在内的六国科学家发布人类基因组图谱的“基本信息”，这说明人类现在不仅知道这部“天书”是用什么符号写的，而且已经基本读懂了这部“天书”。其他典型生物的基因组研究有的已经完成，有的正在进行。在对从低等到高等的不同生物门类的基因组、调控基因群，以及发育调控模式比较研究的基础上，已开始对发育和进化的关系进行探索。在基因和细胞水平，对遗传、发育和进化关系的探索已展现出乐观的前景。“后基因组时代”的生物学任务是基因组功能的研究，即对细胞的基因表达谱和蛋白质谱的研究，这些都将从根本上影响未来细胞生物学的发展趋向。正如过去各种生命现象的奥秘都要从细胞的结构和功能活动中寻求解答一样，目前对细胞的结构和功能，也要从基因组的结构和功能活动中寻求解答。基因、细胞和发育将是贯穿细胞生物学研究的主线。

真核细胞基因组结构及其功能调控，是未来细胞生物学研究的核心问题。另一方面是基因产物如何构建细胞结构，以及如何调节和行使细胞功能。细胞生物学和分子生物学将在对这两方面的研究中结合在一起，构成新世纪细胞生物学研究的主要内容——分子细胞生物学。

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