这么好的名字都不能过
蛋白质的一级结构:蛋白质多肽链的基排列
肽的结构通式:
氨基末端(N末端) 羧基末端(C
1. 蛋白质分子中氨基酸连接基本
2. 有的蛋白质分子还具有二硫键disulfide bond)，有链间二键和链二硫键两种式。 3. 肽链氨基酸于形成肽键而成为不
肽键的结构:
1. 肽键中的C-N键具有部分双键质，
2. 肽键是一个平面——肽键平面或 酰胺平，肽键4个原子两个相邻的C,
个平面上。
3. 在大多数情况下，肽键为反式构型(外:Pro
肽的物理性质:
1.短肽为晶体，熔点很高。2.在水溶液中以兼性离子形式存。3.具旋光，短肽的旋度为各个氨基酸的旋光度
肽的化学性质:
(1) 酸碱性质:主要取决于游离末端的,-NH2和,-COOH及R基上可解离团。 (2) 化学反应:a(茚三酮反应:多肽 + 茚三酮 蓝
肽的定性、定
b(双缩脲反应:多肽(蛋白质)+ 碱性硫酸铜试剂 紫红色复物 测定蛋质含量 天然存在的活
激素: 胰岛素:含两条肽链(分
催产
加压
抗生素: 短杆菌肽S(环
放线菌D(含2
毒素: ,-鹅膏蕈碱(
蛋白质的一级结构举
1. 胰岛素
含两条肽链: A链: 20aa B
A、B间通过2个二硫键连接，A内还有内二
含一条多肽链 (124aa)
分子内含有4个二硫键: 26-84, 40-95, 58-110, 65-72
3. 肌红蛋白(Mb)血蛋
Mb: 153aa Hb:
,:141aa ,:146aa
蛋白质分子氨基酸顺
一般原则:
? 测定蛋白质分子中多肽
? 拆分蛋白质分子
? 断裂多肽链的
? 测定多肽链的氨
? 分析多肽链的N末端和C末端残基
? 将多肽链断裂成肽段，并分离
? 测定各个肽段的氨
? 确定肽段在多肽链
? 确定原多肽链中二硫
1.测定蛋白质分子中多肽
根据蛋白质摩尔数与末端残基(N端或C端)摩尔数之比确定多肽的目。 比=1，含1肽链 ----,单体
比值?2， 含2条以上肽链 ----,寡聚蛋白质
(若末端残基多于一种，则蛋白质含有2条或多条不同的链) 2.N末端C末端氨基酸残基
a(N末端氨基酸残
二硝基氟苯法(DNFB法，Sanger法)
DNFB + 蛋白质(多肽)(aan) DNP-
有机溶剂抽提
DNP-aa + (n-1)个游离aa DNP-aa位于
层析(分离和
丹磺酰氯(DNS)法
灵敏度高100倍，DNS-aa具强烈荧光，可直接用电泳和层技鉴定。
弱酸(加热)
PITC + 蛋白质(多肽)(aan) PTC-蛋白质(PTC-
有机溶剂抽提
aa( n-1)+ PTH-aa PTH-aa
此方法还可用来测定短肽的
氨肽酶法:
肽链外切酶，可将aa自N端
b(C末端氨基酸残
肼解法
无水NH2NH2
…+
… 苯甲醛
氨基酸酰肼
氨基酸酰肼与苯甲醛形成二苯基衍生物, 离C末端aa位于上清 层析 羧
A: 释放除Pro、Arg 、Lys
B:释放Arg 、LysC
A 和B混合可水解Pro以外的任C-
Y: 任何一个C-末
还原法
C末端aa 被LiBH4 还原成基醇，再用
通过末端aa残基分析，不仅可确定多肽链末端氨基，还确定蛋白分子由几条肽链组
3.多肽链的分离和二硫
多肽链以非共价键相联:(寡聚蛋白)变性剂(8M 尿素6M 盐酸胍)可破坏非价键 多肽链以二硫键
氧化剂:过甲酸(HCOOOH)
还原剂:巯基乙醇(常用),并以碘乙酸保护还后的-SH，防止再形成硫。 4.氨酸组成的鉴定(用层析方法鉴定氨基酸组分
水解方法 反应条件 产
酸水解 6M HCl 或 L-aa Trp被破坏
4M H2SO4 Ser,Thr,Tyr 一部分被分解
共煮20hrs Asn 和Gln 酰胺基
NH3
碱水解 5M NaOH L-aa 和D-aa
共煮20hrs 物
5.多肽链的部分断裂和肽
a( 酶裂解法
肽链内切酶 胰蛋白酶: R1= Lys, Arg R2,Pro
麋蛋白酶(胰凝乳蛋白酶): R1= Phe, Trp, Tyr R2,Pro
胃蛋白酶:R1, R2 =Phe, Trp, Tyr , Leu等 R1,Pro
嗜热菌蛋白酶:R2=Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Tyr, Met R2,Pro,Gly
木瓜蛋白酶: R1= Lys, Arg
葡萄球菌蛋白酶( Glu蛋白
梭菌蛋白酶(Arg
b(化学裂解法
CNBr R1= Met, 成肽
羟胺(NH2OH): 断裂Asn-Gly间的肽键，部分裂解Asn-Leu 和Asn-Ala之的肽键 6.肽段的aa顺
Edman化学裂解法 质谱法(MS) 根
7.肽段在多肽链中次序的
8.二硫键位置的确定—
同源蛋白质:指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质。不同种属源白质在一结构具有相似。亲缘关系越近，结构越
同源蛋白质具有共同的进化起源:氧血素蛋
研究蛋白质的一级结构
研究蛋白质的一级结构 从确定组成蛋质的单结构——氨基酸算起，有150年的悠久历，到1955年，Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序，为研究蛋白质的一级构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中一个重要破。目前关于核酸的一级构研究，于Sanger等发明了加减法，以得了突飞进的发展。对此之下，关于蛋白质的级结构研究进展不如核酸迅速。但随着Edman液相自顺分析仪和固相顺序分析仪以气相谱 质谱(GC MS)等方法的继出现。使结构分析的速度也显著加快。至已成近千蛋白质的一级结构分析。目前不仅样品用量减少，而且工人员也大大减少。当年Sanger分析胰素用了整整十年的时间，今天运用自动化仪器，分析一个分子量在10万左右的蛋质只需要几天，见新技的应用和发展对科学发展促作用，蛋质一级结构测
蛋白质子的一级结构测，概括起来包含多肽链的分离、降解、肽段的分离和序
一级结构的测定方法可概述
1.多肽链的分离
在测定蛋白质的结构以前，首须保证被测蛋白质的纯度，使结果准确可靠。其次要了解它的分子量和亚基，照其亚基数将蛋白质
1)肽链的拆开
蛋白质分多肽链的连接有共合和非共价结合两种。要拆开以共价结合的-S-S-连接的多，必须采用的化学
①过甲酸氧化
用氧化剂甲酸断裂-S-S-。个反应一般在0℃下进行2小时左右，两个S就全部能转变成磺酸基，这被氧化的半胱氨酸称
如果蛋质分子中同时存在半胺酸，那么也会被氧化成磺基丙氨酸。此外甲硫氨酸和色氨酸可氧化，从而增加
②巯基乙醇还原
利用还原剂巯基醇可使蛋白质的-S-S-断裂。当高浓度的巯基乙醇在pH8?条件下室温保温小时后，以使-S-S-量还原为桽H。与此同时反应系统中还需要有8摩尔脲或6摩尔盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松成无规则的构型，此时还剂就可作于-S-S-。此反应是可逆的，因此要使反应完，疏基乙醇浓度必需
③Cleland试剂的还
Cleland′s指出二硫赤苏糖醇(dithioerythriotol)及二硫糖醇(dithiothriotol)在氧化还原能力上是比较强的试剂，只要0.01摩就能使蛋白质的-S-S-还，反应基本与疏基乙醇相似，且在多球蛋
Cleland试剂首先与蛋质-S-S-形成中间物，反应终了，还原剂被氧化形成一个定六环化合物，蛋
还原白不稳定，SH基极易氧化重新生成-S-S-键。稳定SH基
(A)烷基试剂使SH基转变为稳定的硫醚
如果碘代胺代替碘代乙酸，其产物S 羧氨甲基衍生物不带电荷，磺代乙酸也可与组氨酸、蛋氨酸和赖氨酸发生反应，但反应不同，可通过各种pH及
(B)氨乙基化
蛋白质分几条肽链若以非共价健结，则用尿素、盐酸胍等变性剂即可拆开。蛋白质的多肽链被拆开后，将它分离纯化，一般用胶过滤、离子交换、电泳
分离纯化后每条肽链还要进一步分析
2)端分析 其方
A.二基氟苯法(FDNB，DNFB)：1945年Sanger提出此法，是他的重
DNP-酸用有机溶剂抽提后，通过层置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N 末端分别
B.氰盐法：1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N 端的新方法，
由于乙内氨基酸不带电荷，因此可用子换层析法将它与游离氨基酸分开，分离所得的乙内酰脲氨基酸再被盐酸水解，重新生成游离的基，鉴别此氨基酸即可了解N-端是
C.二甲基萘磺酰氯法：1956年Hartley等报告了一种测定N-末端的灵敏方法，采用1-二甲基氨基萘-5-磺酰氯，简称丹磺酰氯。与游离氨基末端作，方类似于Sanger的DNFB法，产物
丹磺酰链酸强烈的黄色荧光。此法优点为灵敏性(比FDNB法提高100倍，样品量小于1毫微克分子)及丹磺酰氨基酸稳定性较高(对酸水解定性较DNP 氨基高)，可用纸电泳或聚酰胺薄膜
A.肼解：这是测定C-末端最常方法。将多肽溶于无水肼中，100℃下进行反应，结果羧基末端氨基酸以游离氨酸释放，而其余肽链部分与
这样羧基末基酸可以采用抽提或离子交换层析的方将分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺，则肼解时不能产生游的羧基末端氨基酸。外肼时注意避免任何少量的水解，免释的氨基
B.羧肽酶法：羧肽酶可以专一性地水解羧基末氨酸。根据酶解的专性不同，可区分为羧肽酶A、B和C。应用羧肽酶测定末端时，需要事先进行酶动力学实验，以便选合的酶浓度及反应时间，使释放的氨酸主要
3)氨基酸组成分析
在进一分析多肽链的氨基顺序之前，首先应了解它是由那几种氨基酸组成的，每种基有多少?分析组
①层析法
将多肽链全酸水解成游离氨基酸，进行Dansyl标记，聚酰胺薄膜层析，此方法在蛋白质结构分析中是一种超微的析术，但此方法用于定量
②离子交换层析法
Spaekman等发展了一种精确的氨基酸组分的定量方法。他们用磺酸型的离子交换脂，这是一种高分子量的固体聚苯乙烯，带有大量功能基团，磺酸基在低pH和低离子强度件下，根据氨基酸酸碱性，氨酸带正电，于是替换下树脂上的Na+，借助电作用
由于各种氨基酸在脂的亲和力不同，因此当改变溶液pH和离子强度，便依次将们洗脱来而分开，并进行量测定。此基础上发展了氨酸自动分析仪。随着科学技术的日益进展，氨基酸自分析仪在样品的量，分离速度及检测能力上也有了很的高。目前最好的仪器样品析量只要十Picomole,分析时间只要数十分钟，而且计算全自动化，给究蛋白质一
2.多肽链的降解
多肽链的氨基成往往是比较复杂，因此直接分析多肽的基顺序还是很困难的，多采用将多肽链进一步降解成为更小的片段，然后再行分析。肽键的裂解是一级结构研究作中的重要问题，它要裂解少，选择性强，而且反应产率，目前要有化学
1)化学法
(1)溴化氰法 最理想的化学方法，能选择性断裂甲硫氨酸所
溴化氢化学降解法其优
①一般蛋白含甲硫氨酸较少，由此可获得
②专一性强
③产率高达80%
④作用条件和，在室温中用几到十几小时
(2)部分酸水解法
Sanger在分析胰岛素的一级结构采了此法，即用0.1N盐酸在110℃或用6N盐酸在37℃水解。这种部分酸水解的方法性不强，因此对大片段的蛋质和
(3)羟胺法
这种方法十年来开始受人注，胺能专一性地裂解Asn Gly的肽键，酸性条件下裂解Asn-Pro肽键。已用于某些
(4)N-溴代琥珀酰
主要裂Try处的肽，五十年代研究较多。但由于它也能断裂Tyr His肽键，因
2)酶解法
酶水解法化学法具有更多的优，使用也更广泛。因其具有较高专一性，而且水解产率较高，所以可以选种不同专一性的酶进
常用的酶有胰白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌
胰蛋白专一断裂Lys,Arg的羧基侧肽键，如果对Lys,Arg,CysH进行化饰可改变胰蛋白酶
(1)氨酸的修饰。将Lys用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸杆修饰，则胰
顺丁烯衍生中性pH下稳定，胰蛋白酶水解仅Arg键断裂。在酸性条件下顺丁烯衍生物可脱去封闭，此时再行胰蛋白酶水解，则得赖氨酸为端的多肽。下述为蛋质的赖氨酸，经顺丁烯酰化作后，胰蛋白
(2)精酸的修饰。精氨酸与1，2-和1，3-二羰化合物作用，缩合产物是一杂环化合物，十分稳定。胰酶水解仅断裂赖氨
(3)半胱的修饰。若肽链内Lys、Arg较，则为了增加胰酶的裂解点，可以将半胱氨酸进行氨乙基化，其产物S β 氨乙基半胱氨酸有似Lys的结构，胰白在水解时，不能识别这微细变化，而在
蛋白水解酶的专一性
肽链的裂解和重组大有三情况：一种是特异性裂解，如酸水解。由于裂解的片段较，造成分离困难。因此这种非特异性裂解大分子肽链不适用的。第二种是特性裂解，采用两种以上的专一裂解，然后进行组合，这种方般也适用于分小于5万的蛋白质。第三种是逐步的专一裂，首将某种氨基酸进行化学修饰，水解酶专一裂某一种基酸，分成若干片段，然后解除化学封闭，再用此酶裂解，使曾被封闭过氨基酸断裂。
3.肽段的分离
大部分肽段离主要通过凝胶过滤法，由于大分子肽解小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一般纯度不高，常需辅离子交换层析法，大片肽用离子交换葡聚糖作载体，小
小肽离还常采高压电泳与层析相结合的指纹图谱法，得到
4.肽的顺序分析
在蛋白一级结构的测中，肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析有化学法和
1)化学法 Edman
这是目前用于顺序分析的最主要方法。的原理是从N端始，步降解。将肽先与异氰酸苯酯(PTH试剂)在pH8-9条件作用，肽的NH2端接到异氰酸苯酯的C原子上生苯异硫甲酰肽，简称PTC 肽，在酸作用下，可使靠近PTC的氨基酸环，肽键断裂形成氨基噻唑啉衍生物和一个失去末端氨基酸的肽链。此肽不破，因而又可出现一个的N－末端。重复以上的步骤，继续与PTH试剂作用，继续分析，苯基噻唑啉衍生物很容易由有机溶剂抽提出来进行鉴定。此衍生物很不稳定，在水中可转化稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH－氨基酸)。这些步骤通常称为Edman氏步降法。所以可用来测定酸排列顺
PTH－氨的鉴定可以用各种层析方法，如纸、薄层层析、气相层析和质谱法等，现在多用高压液相层析法。虽然此方法具有很多优点，但由于操作繁琐，工量，所以目前有人根据Edman降的原理
下面简单介绍几种
A.1967Edman及Begg介绍了一种Edman降的液相自动分析装，使顺序分析开始走向自动化。将样品先在反应杯内旋转成薄膜，使之固定。然后与PITC试剂反应。再有机剂多抽提除去过剩试剂，因而样品丢失，
B.1970年Laursen改进为氨基酸顺序仪。此法样品用量少，检出灵敏，可分析20?0肽，其原理是将肽共价结合惰支持物上，固定后装柱再
固相顺序仪的惰性支持
此法成关键是肽段的固定，目用C端α 羧基固定法，重复法高，其中以高丝氨酸内酯法及双异硫氰酯法(DITC)最好，固定率可
C.另外也有从化学应角度考虑，试改进Edman方法。1976年有人将硫氰酸苯的苯基变为甲氨偶氮苯，试为甲氨偶氨 异硫氰酸盐(简称DABITC)。这是一种有色试剂，产物DABIH 氨酸呈桔黄色，此定时无需染色，用肉眼即可分辨。此方灵敏很高，一次分析小肽段只要个nanomole样即可，是目前一种很可取的方法。此外也有人将异硫酸酯进行 35S标记，使分
2)酶解法 肽谱重
分析肽段也可用解法，利用专一性不同的两种酶将一个肽分断裂更小的寡肽，比较两方法所得之肽段的重复性，进行氨基酸顺序的装配。如，有一个肽段，通过氨基酸组成分析已知其十肽，假如先以蛋白酶解，得到一套寡肽，再以胰蛋白酶水解此肽，得另一套寡
Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val
糜蛋白酶水解
+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)
胰蛋白酶水解
Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val
将此两套肽可以做分析比较，十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val，因此第一段肽
十肽顺
水解酶也可二肽酶，两组可用同一种酶水解如一肽是A桞，C桪，E桭，G桯……第二套肽水解则先将该肽段N 端切去一个末位氨基酸，然后开始二肽酶断裂，结是A，B桟，D桬，F桮……这分析比也可
5.二硫键定位
蛋白质分经任何处理，直接用酶水，检出其中二硫键的肽段，然后将二硫键拆开，分别测定两个肽的顺序，将此两肽结构与测的级结构比较，就能找出相的二
含二硫键肽的检出方
1)凝过滤或离子交层析：用以分离各肽段，然后用特殊的二硫键显反应找出含二
图1-21 对角线电泳技
2)对角线电泳或层析：1966Brown及Hartlay提出对角线电泳进行含－S-S-肽的定位，此方法是将水解后的肽混合物行第一相电泳，样点在中间，泳毕，将样品纸条剪下，于装有过酸的器皿中，用过酸蒸气处2小时，使-S-S-断裂，此时含-S-S-肽段的静电荷生了改变。然将纸条缝于另一张纸上，进行第二相电泳电泳，泳件与第一相相同，只是第次方向成直角。在第二相电泳中，那些不含-S-S-的髣民泳情况与相相同，因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上，而那含-S-S-的肽由被氧化，电荷生变化，第二相电泳速度就与第一相不同，电泳结果这些肽斑就偏离对线，肽斑可用三酮显。对角线法由于其速度，作简便及能用于小
含-S-S-肽被分离后，即可进肽顺序分析，并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较，即可找出相应的-S-S-位置，至此蛋白质的一
今后蛋质一级结构的测定朝自动化、快速化及微量化发展，关键问题仍然是进一找蛋白裂解和肽
蛋白质一级的测定不断有新方法和新思路出现，如X衍法测定一级结构；离相应蛋白质的mRNA，由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些胆的设想必将有助于蛋质一级结构测定，使人们掌握更的工具方法去
该文章
蛋白质一级结构分析
References and documentation are available.
Number of amino acids: 665
Molecular weight: 76089.5
Theoretical pI: 6.06
Amino acid composition:
Ala (A) 63 9.5%
Arg (R) 29 4.4%
Asn (N) 27 4.1%
Asp (D) 47 7.1%
Cys (C) 7 1.1%
Gln (Q) 24 3.6%
Glu (E) 42 6.3%
Gly (G) 43 6.5%
His (H) 17 2.6%
Ile (I) 26 3.9%
Leu (L) 54 8.1%
Lys (K) 51 7.7%
Met (M) 20 3.0%
Phe (F) 28 4.2%
Pro (P) 32 4.8%
Ser (S) 31 4.7%
Thr (T) 24 3.6%
Trp (W) 19 2.9%
Tyr (Y) 38 5.7%
Val (V) 43 6.5%
Pyl (O) 0 0.0%
Sec (U) 0 0.0%
(B) 0 0.0%
(Z) 0 0.0%
(X) 0 0.0%
Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 89Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 80
Atomic composition:
Carbon C 3451
Hydrogen H 5221
Nitrogen N 907
Oxygen O 988
Sulfur S 27
Formula: C3451H5221N907O988S27Total number of atoms: 10594
Extinction coefficients:
Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water.
Ext. coefficient 161495
Abs 0.1% (=1 g/l) 2.122, assuming all pairs of Cys residues form cystines
Ext. coefficient 161120
Abs 0.1% (=1 g/l) 2.118, assuming all Cys residues are reduced Estimated half-life:
The N-terminal of the sequence considered is M (Met).
The estimated half-life is: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro). >20 hours (yeast, in vivo).
>10 hours (Escherichia coli, in vivo).
Instability index:
The instability index (II) is computed to be 29.16
This classifies the protein as stable.
Aliphatic index: 75.14
Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.451
EXPASY ——protparam
蛋白质的一级结构
蛋白质的分子质构
、蛋白质的一质质;构Primary
structure,
又质共质或化质。是指白质中的基酸按照特定的排列质序通质质质质接起的质质质。 称构
质质,基酸的 个氨 α-COOH 和相质的一基酸的另个氨 α-NH脱水形成
1)构氨残称氨成质质的基酸已缺不
基酸基残～
2)质质中
端质～由N指 向C～即多质质有方向性～N端质质～C
质的质色质: 多质可质化合物作用～质生不同的质色反质。质些质色反质～可用于多定性或定量质定。
是由酸基酸的基;酪酸和丙酸,反质生成二硝基衍生物而质色。与氨苯
多质的质反质是多质特的质色反质双;双两质质是分子的尿素质加质失去分子NH3而
质质性硫酸质作用～质生质色的质双与碱-双称双质质质合物～质质质质。含有以上质质的
与双构质质相似的质特～也能质生质质反质～生成紫质色或质紫色质合物。质是多质定量
质.
;二,天然活性质
1.谷胱甘;GSH,,三质;Glu-Cys-Gly,～谷酸氨-半胱氨-甘酸 氨广泛存在于生物质胞中～含有自由的-SH～具有强的很质原性～作质重要的质原质～质些蛋白质或质分子中的质基免化～其质于
2.促腺素质放激,三质;焦谷质质质脯酸,～可促质甲质腺的质放。
3.短杆菌S,质十质～含有D-苯氨氨坏酸、质酸～质革质氏质性质菌有破作用～主要作用于质胞膜。 4.青霉素,含有D—半胱和氨D—质酸的二衍物 。主要破质菌的质胞壁粘质合成
蛋白质的质构
蛋白质由一或多多质条(polypeptide)质以特殊方式合而成的生
蛋白质质无质格的质～通常是分子量在与并将6000道质质上的多质质
蛋白分子量质化质大很, 从大质6000到1000000道质质
一、蛋白质的一质质构p168
1. 定质 ——1969年～质质化质用化委;国学与学会IUPAC, 质定,蛋白质的一质质指蛋白质多质质中构AA的排列质序～包二硫质的位置。其最要的是多质质的基酸质序～蛋白生物功
2.蛋白质一质质的
蛋白质基酸序的质定是蛋白质化究的基质。
自从1953年F.Sanger质定了质素的一质质以～质在已质有上千质不同蛋
;1,质定
a、质品必需质;>97%以
b、知道蛋白质的分子
c、知道蛋白质由质基质成～几个
(2) 质定步质 p168
A.质定蛋白质分子中多质质的
质质定末端基基的摩质蛋白质分子量之质的质系～可定多质的目。氨残
如果蛋白质只含质质～质蛋白质的摩质条数?(蛋白质分子量/110=蛋白质的,质于末端基的摩
后者是前者的～质明质蛋白质是由多多质质质
B.多质质的分。拆p169
由多多质质成的蛋白质分子～必质先质行
多质助非共价质质接在一起～寡蛋白质～如～血质蛋白质四聚～质醇化质质二聚～可用几条称体体8mol/L尿素或6mol/L质酸质理～可分质多质胍
C.二硫质的裂 断p169
多质质二硫质交质在一起。可在几条8mol/L尿素或6mol/L质酸存在下～用质量的质胍-质基乙醇(质原法)质理～使二硫质质原质基～然后用质基化质;ICH2COOH,保质生的质基～以防
可以通加入质酸方法多质质之质的非共价力～质用质甲酸化法分多
质基;-SH,的
D.分
多质质基基酸分质质,氨两N-端基酸氨(amino-terminal)和C-
在质质基酸质分析中～最重要的是氨N-端基酸分
Sanger法。2,4-二硝基在性件～能质质质氟苯碱条与N-端的游基作用～生成二硝衍生物;离氨苯DNP,。p169在酸件下水解～得到色条黄DNP-氨离基酸。质质物能质用乙质抽提分。不同的DNP-氨基酸可以质法质行质定在性件下～丹质质;二甲基质质,可以碱条磺氨磺与N-端基的游基作～得到丹氨离氨磺-氨基酸。此法的质点是丹质磺-氨很灵达酸有强的质光质～质质敏度
N-基酸分析
氨它质质是一质质外切质～能多质质的N-端逐的向里
根据不的反质质质质出质水所质放出的基酸质质和量～按反质质质和基酸基质放量作质质～而知道蛋白质
的N-末端基质序。残
最常的质质是亮质质～水解以亮酸基质氨氨氨氨残N-末端的质质
此法是质质C-端基酸分法。多质质在无水件下加质～氨与条C-端基酸质质上解出～余的基酸质质成质
化物。质化物能质质质合成不溶于水的物质而与苯与C-端基酸
质质质是质质质外切质～能多质质从C-端逐的水解个AA。根据不同的反质质质质出质水解所质放出的基酸质质和
目前常用的质质有质,A,B,C和Y～A和B来胰自质～C来叶自桔～Y来自面包酵母。质质质A水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端基酸基～氨残B只能水解Arg和Lys质C-末端基质。残E.多质质裂成质段～采用质多质不同的裂方法多质质品裂成套或多质段或质片～其分质
来。p169
二,多质质的质质性
1.质解法:
胰糜氨蛋白质～白质～胃蛋白质～嗜质菌蛋白质～质质
;1,。蛋白质胰
Trypsinase ,R1=Lys和Arg质质;质一性质强～水解速度快,。R2=Pro 水解
1,2-质
;2,.糜蛋白质
或凝乳蛋 胰p173;Chymotrypsin,,R1=Phe, Trp,Tyr质水解快; R1= Leu～Met
;3,.胃蛋白质p174
Pepsin,R1和R2,Phe, Trp, Tyr; Leu以及其疏性基酸水解速
R1=Pro 水解受
质的适pH2。硫质在酸性件下质定。定二硫质的位置质常用胃蛋
;4,.嗜质菌蛋
thermolysin,R2=Phe, Trp, Tyr; Leu～Ile, Met以及水性强的基酸水解
R2=Pro或Gly 水解
R1或R3=Pro 水解
;5,.酸蛋白质, 氨R1=Glu、Asp(磷冲酸质液); R1=Glu (磷冲冲酸质液或醋酸质
;7,.木瓜蛋白质、质蛋
荔荔国称荔荔内丰枝病,枝质“南第佳果”。但质量质食易患“低血糖症”～俗“枝病”。枝含有富的果糖～质食后量果糖来体内及质肝质化质质化成葡萄糖～质聚在～使血液中葡萄糖含质重足。质,芒果皮炎,芒果“质质果王”之～称独内即触滋味特。芒果汁的特性蛋白和蛋白质引起的质型性质反质。。质,波质症,质有菠会称内菠“宴水果”之～含质蛋白质的作用。质一质蛋水解质～可使胃质粘膜通透性增大～使胃中性大分子蛋白菠碱与渗透血液中～而引起胃质道乃至全身质敏反质。质所含的生物及蛋白质～能使凝质散抑制血液凝质的成。质冠状脉质和质
柿柿胶酚宁胶会与石症,含大量、质和果质。空腹服少量～就致胃脘痛～化不良等症～原因质果胃凝质成不溶性物胃质——柿与螃石。正常人也宜质餐后食～且忌蟹、山芋和菱角等同食。质,质桃,含质质质质质～故质食后可起质中～甚至化物中毒而死亡。李质珍在《本草质目》中有质于食质桃致死
2.化法,可质得质大的质段 学p174
;1,.质化(Cyanogen bromide)水解法～能质性地切割由Met的质基形成的质质。;2,.质;胺NH2OH,,质一性裂-Asn-Gly-之质的质质。也能部分裂解-Asn-Leu-质的质以及-Asn-Ala-之质的质质。各质蛋
质定步质
F.分质段
Edman ;硫质酸质法,基酸质析法质质上也是一质苯异氨N-端分析法。此法的特点是能质不重质断将循质～质N-端氨基酸基逐一质行
质定每条氨多质质的基
G.确定质段在多质质中的
利用套多套质段的基酸质两氨叠拼凑条氨彼此质的交质重～出整多质质的基酸质序。H.确定原多质质中二
一般采用蛋白质质理含有二硫质的质(切点多～酸性质境下防止二硫质质生交质)。将所得的质段利用BrownHartlay的质角质质
蛋白质的一质质 构p180
氨基酸质序质定步质
质定蛋白质分子中多质质的目～ 数
多质质的分～ 拆
二硫质的裂～断
质定每条氨并多质质的基酸质成～质算出基酸的
分析多质质的N-末端和C-末
多质质裂成多质段～
质定每个氨质段的基酸
确定质段在多质质中的次
确定原多质质中二硫质的
其基酸质序法它氨
用质定核酸的质序推质蛋白质的质
三、 蛋白质的一质质生物功
1. 同源白质的质属异与差生物质
同源蛋白(homologous protein)是指在不同的有体质质同一功能的
例如血质蛋白在不同的脊质质物中行使相同的质功能。 氧
不质属来源的同源蛋白质一般具有相同质 度或接近相同
不质基残(invariable residue),同源蛋白质的基酸质序中有质多位置的基酸质所有的质质氨氨属来都是相同的～ ?残可质基(variable residue),其位置的基酸质同质有大的
?质序源(sequence homology)质象,同源蛋白质的基质序中所具有
质同?从离源象表明中分同源蛋白质的质些生物在质化上有着共同
质序同源的生物学
在不同质源的质胞色素c中～可以质质的酸基目质些质在系质质生上的位置有残数与属即密切质系～在质化位置上相距愈质～基酸质序之质的氨质大; 反之～质质质系越近～质序
质胞色c的基酸质序分质氨来个学料己被用核质各物质之质的分质质系～以及
根据质质不质可以究质质研从体体估属机到多质胞有机的生物质化质程～而且可以粗略质质的质质生物在质化中
2 一质质的构断与局部裂蛋白质
在质物的某物化质体内学断程中～蛋白质子部分质质必质先按特定的方式裂～然后才呈质生物活性。 血液凝固质血质质蛋白原(fibrinogen)
消化液中一系
质多质或蛋白激素前质质质活性的激素形式等体属况都于质
血液凝固的生物化学
血液中包含着质立质一的系质,两个
凝血系质和溶血系
质系质两个既互制质～保质血血管中质通无阻～又保质一旦血管壁破质能及质堵漏。 如果凝血因子都质于质～血液有质凝状随固
如果液有凝血将会因子存在～那质质物一旦受到质质流血
血液凝固的生物化学
有机决个解质体矛的质法就是凝血因子以前质(precursor)的
质物受到质而体体将将流血质～些前在其他因子作用下被激活～使血液迅速凝固而质质质封质～质质就防质质流血～起着保质
凝血功能失～有凝血而确另个即堵塞血管的质～因此血液中质存在一系质～质质蛋白溶质原～被激活后质质成质质蛋白溶质～的作用是使质蛋白溶解。质质凝相的质它与程质于保持血液流质有重要
上述激活质都质一性很构即断高的一质质的局部水作用～质质的局部裂质蛋白质生物功能的出质。 蛋白质分子的质一特性----质原激活～具有重要的生物它来构意质。是在生质化程中质展起的～是蛋白质分子质与功具有高
蛋白质的一级结构
第三节蛋白质的一级构白质的相关概念肽的命名、书写及特点测序过程一、相关概念1.质的一级结构Primary structure:又共价结构化学结构。它是白中的氨基酸残基的种类、排列顺序及连接方式。特点?具有部分双键性质不可以旋转?肽键比般的碳-氧键短?与肽键相连原子和氮原子反式2.肽键peptide bond一氨基酸的α-羧与另一个氨基酸α-氨基缩水成的酰胺键共价键称为肽键。3.肽peptide一个氨基酸的羧基另个氨基酸的氨基缩水形成的化合物称为肽。在蛋白质分子中氨基酸借肽键接起来形成肽链。肽单位肽键肽平面4.残基residue肽链分子中每一个氨基酸由于相互连接而去一分子水与原来的结构相比分子稍有残缺因此通常肽链分中的每个酸单位称为氨基酸残基128/110.二、肽命名及书写1.命名习惯按数量的多少、按来源统某氨基酰某氨基酰……氨基酸2.书从NH到C OH 方向三字母符号或单字符号示中间用“?”或“-”示。例如:Gly-Glu-Lys-Ala 甘氨谷氨基氨基酰丙氨酸当两个基酸通过肽相互连形成二肽在N端仍然有离的氨基C端有游离的羧基一端连接更多的基酸。氨基酸能以肽键相互连接形成长的、带链的寡肽和多肽。多肽仍然有游离的α-氨基和α-羧。少于10AA为寡肽多10AA称为多肽或聚肽。分子量于10000d称为蛋白质小于10000d称为多肽。??在生物体中多肽重要的存在形是作为蛋白质的亚位。??但是也有许多分子量比较小的多肽游离状态存。这类多肽通常都具有特殊的生理功能常称为活性肽。??实例谷胱甘肽glutathioneGSH??短杆菌脑啡肽??促甲状腺素释放因TRH??-天氨酸-苯丙氨酸甲酯甜味剂??激素类多肽抗生素类多蛇毒多肽等。要的肽GSH的作用解作用与毒物或药物消除其毒性作用参与氧化还原反应作为重要的还原剂参与内多种氧还反应保护巯基酶的活使巯基酶活性团-SH维持原状态维持细胞结构的稳定消除氧化剂对红细胞膜结的破坏作用。3.肽的理特?的酰氨不解离肽碱性质主要决定于肽键中的游离末端α-NH2、α-COOH及侧链R基上的可解离团?肽中端α-羧基的pKa值比游离基酸的大末端α-氨基pKa值比游离氨基酸?游离的α-氨基、α-羧基和R基可发与氨基酸相应的类反应如茚三酮反应等?蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋则具有旋光性短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋度之和较长的肽的旋光度则不是简单加和。样品必须是均一的纯度于97须知道它的相对分子量其误差在10以内1.测定白质子中多肽链的数目2.拆分蛋白质分子的多肽链3.断开链二硫键4.析每条多肽链的氨基酸组成比及数目5.鉴定多肽的N、C残基6.裂多肽成小的肽段7.测各肽段的氨基酸序列8.重建完整多肽链的一级结9.确定二硫键的位置一N末端测定二硝基苯DNFB法肽游离末端NH2与DNFB反应生成DNP-肽?黄色DNP-氨基酸丹磺酰氯DNS法用DNSDNFB成DNS-氨基酸苯异氰酸PITC法生成PTH-氨基酸从肽上断裂下来氨肽酶法外酶但效果不好氨肽酶是一类外切酶从肽链N末端个向里。最常用氨肽酶是亮氨酸氨肽酶也会遇到N末端氨基封闭用焦谷氨酸氨肽酶处理。C-末端测定肼解最重要的化学方法肽与反应除C-末端氨基酸游离他基酸转变为氨基酸肼化物还原法C-端氨基酸用硼氢化锂还原相应的α-氨基醇羧肽酶最有效、最常用羧肽酶A羧酶B羧肽酶Y羧肽酶C氨基酸酰肼可以与苯甲醛作用变成水不溶性二苯基衍生物而沉淀Gln Asn Cys等不易测出末端Arg变成鸟氨本方法目前最有效。从羧基端开始向逐一水解蛋
除ProArg和Lys以个的所有C-末端残基羧肽酶B只水解以碱性Arg和Lys为C-末端的键羧肽酶C羧肽酶Y可作用于任何个C-末残基二硫键的氧化过甲酸还原法巯基化合物还原β-巯基乙醇二硫苏糖醇等此还需要加8mol/L 尿素或6mol/L的盐酸使蛋白质变性。生成的巯基要用碘乙酸等烷化剂保护。氨基酸组成的测酸水解是主要方法同时辅以水解所得氨基酸不消旋但Trp全部被坏SerThrTyr部分坏Asn和Gln的酰氨基被水解生成Asp和Glu同时释放NH3碱水解多数氨基酸都被破坏但Trp可定量回收四多肽链的部裂解酶裂解胰蛋白酶专一强断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键糜白酶断PheTrpTyrLeu等疏水氨基酸的羧基参与形成肽键嗜热菌蛋白酶专一性差断裂ValLeuPheTyrTrp氨基参与形成肽键胃蛋白酶在酸性件定肽键两侧均为水氨酸。在确定二硫键位置常用专一性与糜蛋白质酶类似化学解溴化氰CNBr只裂Met羧基形成的键羟氨NH2OHpH9时专一断裂Asn-Gly之间的肽键其条件下不专一今一个七肽经分析它的氨基酸组成是LysPro Arg Phe AlaTyr和Ser该肽经糜蛋白酶处时与DNFB反应不产生α-DNP-氨酸经糜蛋白酶作用后此肽断裂成两肽段。其氨基酸组成分别是Ala Ser Tyr和LysPro Arg Phe。这两个肽段分别与DNFB反应可别生成DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应同样能生成两个肽它的氨基酸组成分是Arg Pro和Phe Tyr Lys Ser Ala。试问此七肽的一级结构序列怎样五肽段的基酸测序Edman学降解法用Edman试剂PITC与游离氨基作用生成PTH-氨基并可用各层技术分离现改用蛋质测序仪。酶解法利用氨肽和羧肽酶局性有困难质谱法质谱仪由核苷酸序列定法mRNAcDNA出cDNA的核酸序列然测出蛋白质的氨基酸序列六肽段在多肽链中次序的决定七二硫键位置的确定对线电流法般采用胃蛋白酶水解原来含二硫键的蛋白质。是胃蛋白酶专一低切得到含二硫键的肽段较小易分离鉴二是在性条件下利于防止二硫键发生交换反应。对角线电泳过程把水解后的混合肽段点到滤纸的中央在pH6.5条件进行第一向电泳肽段将按大小及电荷不同分离开然后把滤纸暴露在过甲酸蒸气中使S-S氧化成一含磺酸基丙氨的肽。滤旋转90度在与第一向完全相同的条件下进行第二向电。这时多数氨基酸的迁移率未变将位于滤纸的一条对角上而含磺丙氨酸的成肽段将比原来含二硫键的肽小而负电荷增加结果它们都偏离了对线。问题有一个A肽经酸水解分析得知Lys、Asp、Glu、Arg、Ala、Val 和Tyr组成。A肽与DNFB后得DNP-Glu当羧肽酶处理后得游离Asp。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时得到三其中一种Arg、Gln、Tyr在pH6.4时净电为1另种Ala、Lys 第三种为Val和Asn在pH6.4时带电为零。此外A肽用糜蛋白酶降解时也以两种肽一种Gln、Tyr、pH6.4时不电荷另一种Arg、Ala、Val、Lys 、Asn在pH6.4时带2个正电荷问A肽序列如何详细写出推理过程。作业??1 名词解释??蛋白质的一级结构protein primary structure、肽和肽键??2 裂解多肽链部分方法有
