范文一:组织免疫共沉淀方法
论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论里的都是于胞的免疫共沉淀的方法,论论论论论是我做用到的方法,希望能大家有点帮助论论论论论论论
论论方法如下:
第一:制裂解物步论论论论论论
1. 把剪切成小的碎片。论论论论论论论论论论论
2. 融解Western及IP论胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分内加入论论论论PMSF,使PMSF的最度论论论论1mM。 3. 按照每20毫克加入论论论论100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高度的论论论蛋白品,可以适当减少裂解液的用量。论论论论论论论论论论论论论论论论)
4. 用玻璃匀器匀,直至充分裂解。论论论论论论论论论论论论
5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分,取上清,即论论论论论论论可行后的论论论论论PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果品本身非常小,可以适当剪切后直论论论论论论论论论论论论论论论论论论论接加入裂解液裂解,通烈论强vortex使品裂解充分。然后同离心论论论论论论论论论论论论论取上清,用于后。 论论论论
或
1. 使用的工具用最快的速度切取待论论论论论论论论论论论论论论论论论
最好在冰上操作。以防止蛋白降解
2. 将放入底离心管中,浸入液氮以达论论论论论论论论论论论论论论论论论
到“snap freeze”. 如果上裂解将冰浴,否将保存论论论论论论论论论论论论论论论论论论-80?C以后用。论论论论
3. 每5mg论论加入300ul裂解液,使用玻璃匀器匀,直论论论论论论至充分裂解。
4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次,然后将液在论论论论4?C论论论慢2小论 5. 12000rpm 4?C.离心20分。的将离心管取出冰论论论论论论论论论论论论浴,将上清吸出到新的冷的离心管中,保持冰浴,,弃沉淀论 论 。
裂解液的体要根据量来确定。蛋白提取论论论论论论论论论论论论论论论
物不能太稀一方面避免蛋白的失,另一论论论论论论论论论论论论论论论论
方面也减少后泳的上量,如果需要的,。论论论论论论论论论论论论论论论论蛋白的合适度论论论1-5 mg/ml ,最低不能少于0.1 mg/ml。
第二:化裂解物步论论论论论论
使用无抗体或血清可以将裂解物非特异性合论论论论论论论论论论论论论论论论论论Ig的蛋白去除,随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异合论论agarose 或sepharose beads的蛋白去除,另一方面也将加入的无抗体和论论论论血清蛋白去除。理的裂解物所得果背景论论论论论论论论论论论论论论论论更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来的,化论论论论论论论论就不是特的必要了。论论论论论论
主要:步论
1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及型相同的无论论论论论论论抗体,例如后免疫沉淀用的是小鼠论论论论论论论论论论论IgG,在本论论论论论论论中可以加入步normal mouse IgG,或者正常血清,常用兔血清,,冰浴1小论 2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads, 4?C论论论慢10-30分论 3. 14,000 x g 4?C离心10分论
4. 取上清,弃沉淀
论提高蛋白回收率,可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗论1-2次,所得上清和前面的合在一起
Note:要确保最大可能将正常血清,或无论Ig,从本中去除。论论论论论论第三:免疫沉淀步
1. 取10-500 μg论胞裂解物,加入推荐量的抗体:抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的和力。可参考明推荐的抗论论论论论论论论论论论论论论体用量,如果明没有推荐,也可以参考以下数据:论论论论论论论论论论论论论论论论论论. o 多抗血清:1-5 μl
o 论论论论论论论和化的多抗:1 μg
o 腹水,抗,:论论论论0.2-1 μl
o 培上清,抗,:论论论论论论论论20 -100 μl
2. 4?论论论论论慢孵育1h到夜,取决于蛋白的量以论论论论论论论论论论论及抗体的和力论论论
3. 同准论论论Preotein A/G agarose beads。建减掉尖部分,论论论论论论论论避免在及脂糖珠的操作中破坏脂糖珠:涉论论论论论论论论论论论论论论论
根据抗体型合适的论论论论论论论beads,参考附表2,,如果IP抗体是IgM:不使用protein-A/G beads,直接使用Goat anti Mouse IgM
beads。
4. 加入混匀的70-100ul protein-A/G beads,4?论论论慢4h,根据具体论论论论论化孵育)
5. 2500rpm(论1000g) 4?C离心5分,或瞬高速离心,论论论论论论论论论小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G
Agarose。
6. 用准蛋白品的裂解液洗沉淀论论论论论论论论论论论论论论3-5次,裂解液或PBS的用量次每论0.5-1毫升。洗离心条件和吸除上清的要求同上面的论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论步
3。
7. 最后一次洗后,去除上清,加入论论论论论论论论论论25-50ul 2×论论论论泳上冲液,95-100?C煮沸5分,将蛋白性并从论论论论论论论论论protein-A/G beads中分离下来,。离心后取上清,弃沉淀。得到的上清可以即可行后论论论论WB分析或-80?C保存。
Loading buffer是最力的洗脱液,所以同也会将无的强论论论论论论论论合抗体或抗体片段洗脱下来,些在后面泳会有所论论论论论论论论论论论体。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液,论论论论论论论论论论论论论论论论up to 1 M,从抗体上洗脱下来。
附1:免疫沉淀中用到的主要buffer和论论
裂解buffer中各成分的推荐度范论论论论论论论论论论
Salts: 0-1 M
Detergent, non-ionic: 0.1-2%Detergent, ionic: 0.01-0.5%Divalent cations: 0-10 mMEDTA: 0-5 mM
pH: 6-9
1. 非性裂解论论论论buffer:
适用于抗原型:可溶于性并论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论且其天然状可被抗体20 mM Tris HCl pH 8
137 mM NaCl
10% glycerol
1% Nonidet P-40 (NP-40)2 mM EDTA
4?C 可保存6个月
使用前加入:Protease inhibitors上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代
2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer
含有更的性,特适用于强论论论论论论论论论论论论论论论论核蛋白的提取。
50mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate0.1% SDS
10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。
3. 不含去的可溶性蛋白裂解论论论论论论论论论论buffer,Detergent-free soluble protein
lysis buffer,:
一些可溶性蛋白不需要使用去,论论论论论论论论只要使用buffer配合机械性的破碎操作即可:如将胞论论论论论论论论论论论论论论反用的注射器吸取或行匀操作论论论论论论
含有以下成分的PBS:
5 mM EDTA
0.02 % Sodium Azide
4?C 可保存6个月
使用前加入:Protease inhibitors4. 论性裂解buffer或不溶于性的抗原提取论论论论论论论论buffer: 有些抗体只能性后蛋白的表论论论论论论论论论论论论论论论论位而不天然状论论论论论论论论论论论论论论论论论论的蛋白表位。就需要使用性裂解buffer,然后煮沸理论论即可。方法同适用于不能用非离论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论论子去提取的蛋白。在buffer
中加入DNase1将有利于提取染色论论论蛋白
1% SDS
5 mM EDTA
室温可保存1周
使用前加入:Protease inhibitors、10mM DTT or beta-
mercaptoethanol、15 U/ml DNase1
5、其它所需:论论论
蛋白论论论论抑制Protease inhibitors :推荐使用蛋白论论论论抑制cocktail,也可使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml).无菌PBS pH 7.4
无菌PBS-BSA 1% (论论论理)
TBST论冲液
WB上论buffer
范文二:组织免疫共沉淀方法
论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助
实验方法如下:
第一步:制备组织裂解物
1. 把组织剪切成细小的碎片。
2. 融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
4. 用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。
5. 充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。
6. 如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用 于后续实验。
或
1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解
2. 将组织放入圆底离心管中,浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴,否则将组织保存-80°C以备后用。
3. 每5mg组织加入300ul裂解液,使用玻璃匀浆器匀浆,直至充分
裂解。
4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次,然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时
5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴,将上清吸出到新的预冷的离心管中(保持冰浴),弃沉淀 。
裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失,另一方面也减少后续电泳的上样量(如果需要的话)。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ,最低不能少于0.1 mg/ml。 第二步:预纯化裂解物
使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除,随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除,另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话,预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤:
1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体(例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normal mouse IgG)或者正常血清(常用兔血清),冰浴1小时
2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads, 4°C缓慢摇动10-30分钟
3. 14,000 x g 4°C离心10分钟
4. 取上清,弃沉淀
为提高蛋白回收率,可将Preotein A/G agarose beads(上述沉淀)用裂解液洗涤1-2次,所得上清和前面的合在一起
Note:要确保最大可能将正常血清(或无关Ig)从标本中去除。 第三步:免疫沉淀
1. 取10-500 μg细胞裂解物,加入推荐量的抗体:抗体用量取决于蛋白的量以及抗体的亲和力。可参考说明书推荐的抗体用量,如果说明书没有推荐,也可以参考以下数据:.
o 多抗血清:1-5 μl
o 亲和纯化的多抗:1 μg
o 腹水(单抗):0.2-1 μl
o 培养上清(单抗):20 -100 μl
2. 4℃缓慢摇动孵育1h到过夜,取决于蛋白的量以及抗体的亲和力
3. 同时准备Preotein A/G agarose beads。建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠:根据抗体类型选择合适的beads(参考附表2),如果IP抗体是IgM:不使用protein-A/G beads,直接使用Goat anti Mouse IgM beads。
4. 加入混匀的70-100ul protein-A/G beads,4℃缓慢摇动4h(根据具体实验优化孵育时间)
5. 2500rpm(约1000g) 4°C离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉Protein G Agarose。
6. 用准备蛋白样品时的裂解液洗涤沉淀3-5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步
骤3。
7. 最后一次洗涤后,去除上清,加入25-50ul 2×电泳上样缓冲液,95-100°C煮沸5分钟(将蛋白变性并从protein-A/G beads中分离下来)。离心后取上清,弃沉淀。得到的上清可以即可进行后续WB分析或-80°C保存。
Loading buffer是最强力的洗脱液,所以同时也会将无关的结合抗体或抗体片段洗脱下来,这些在后面电泳时会有所体现。抗原可以使用梯度甘氨酸溶液(up to 1 M)从抗体上洗脱下来。
附1:免疫沉淀中用到的主要buffer和试剂
裂解buffer中各种成分的推荐浓度范围
Salts: 0-1 M
Detergent, non-ionic: 0.1-2%
Detergent, ionic: 0.01-0.5%
Divalent cations: 0-10 mM
EDTA: 0-5 mM
pH: 6-9
1. 非变性裂解buffer:
适用于抗原类型:可溶于变性剂并且其天然状态可被抗体识别 20 mM Tris HCl pH 8
137 mM NaCl
10% glycerol
1% Nonidet P-40 (NP-40)
2 mM EDTA
4°C 可保存6个月
使用前加入:Protease inhibitors
上述溶液中NP-40可使用Triton X-100替代
2. RIPA (RadioImmunoPrecipitation Assay) buffer
含有更强的变性剂,特别适用于核蛋白的提取。
50mM Tris HCl pH 8
150 mM NaCl
1% NP-40
0.5% sodium deoxycholate
0.1% SDS
10% sodium deoxycholate橱窗液需要避光保存。
3. 不含去污剂的可溶性蛋白裂解buffer(Detergent-free soluble protein lysis buffer):
一些可溶性蛋白不需要使用去污剂,只要使用该buffer配合机械性的破碎操作即可:如将细胞反复用带针头的注射器吸取或进行匀浆操作
含有以下成分的PBS:
5 mM EDTA
0.02 % Sodium Azide
4°C 可保存6个月
使用前加入:Protease inhibitors
4. 变性裂解buffer或不溶于变性剂的抗原提取buffer:
有些抗体只能识别变性后蛋白的表位而不识别天然状态的蛋白表位。这样就需要使用变性裂解buffer,然后煮沸处理即可。该方法同样适用于不能用非离子去污剂提取的蛋白。在该buffer中加入DNase1将有利于提取染色质蛋白
1% SDS
5 mM EDTA
室温可保存1周
使用前加入:Protease inhibitors、10mM DTT or beta-mercaptoethanol、15 U/ml DNase1
5、其它所需试剂:
蛋白酶抑制剂Protease inhibitors :推荐使用蛋白酶抑制剂cocktail,也可使用PMSF (50 ug/ml)和aprotinin (1 ug/ml). 无菌PBS pH 7.4
无菌PBS-BSA 1% (过滤处理)
TBST缓冲液
WB上样buffer
范文三:免疫共沉淀原理及实验方法
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免疫共沉淀原理及实验方法
2007-03-22 16:07:46 大 中 小
免疫共沉淀
一 原理:
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。
每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。(待续)
二 准备:
器械
#微量高速冷冻离心机
#移液枪
#旋转盘
#电泳设备
#vortex震荡器
#液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#细胞或组织
#蛋白定量kit
#SDS电泳试剂
#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)
#PBS
#NaN3
#proteinA sapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1.RIPA缓冲液 (最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10% DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal 500ml
另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)
2.NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%NP40 25ml (1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMSF
注意点:
*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。 *反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC
*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。
Protocol
1 调制protein A sapharose
protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS
离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存
用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每
50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s
去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次
加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。
2.抗原的检出
以下操作全在冰面或4度进行
去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。
30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube
往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h
加protein A sapharose50ul,再混匀1h
5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。
加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。
3.注意点
A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。
B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)
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免疫共沉淀原理及实验方法
[SPAN class=java id=text9766]免疫共沉淀[BR]一 原理:[BR]IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合
以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。[BR][BR]实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。[BR][BR]其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。[BR][BR]再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。[BR][BR]每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。(待续)[BR]二 准备:[BR]器械[BR]#微量高速冷冻离心机[BR]#移液枪[BR]#旋转盘[BR]#电泳设备
[BR]#vortex震荡器[BR]#液氮及组织粉碎器[BR]#eppentube[BR]试剂[BR]#细胞或组织[BR]#蛋白定量kit[BR]#SDS电泳试剂[BR]#抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清)[BR]#PBS[BR]#NaN3[BR]#proteinA sapharose[BR]试剂配制[BR]抗原蛋白溶解缓冲液[BR]1.RIPA缓冲液 (最终浓度)[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%TritonX-100 25ml (1%)[BR]10% DOC 50ml (1%)[BR]10%SDS 5ml ( o.1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 395ml[BR]toal 500ml[BR]另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)[BR]2.NP40 lysis 缓冲液[BR]1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)[BR]5MNacl 15ml (150mM)[BR]0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)[BR]20%NP40 25ml (1%)[BR]TLCK 18.5mg (0.1mM)[BR]TPCK 35mg (0.2mM)[BR]DDW 450ml[BR]toal 500ml[BR]使用前加1mM的PMSF[BR]注意点:
[BR]*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。[BR]*反复使用PMSF要注意保管方法。[BR]*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOC<SDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。[BR]*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。
[BR]Protocol[BR][BR]1 调制protein A sapharose[BR][BR]protein A sapharose 5ml 溶于20ml含0.02%NaN3的PBS[BR][BR]离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存[BR][BR]用单抗做一抗时,把protein A sapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulprotein A sapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s[BR][BR]去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次[BR][BR]加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。[BR][BR]2.抗原的检出[BR]以下操作全在冰面或4度进行[BR][BR]去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1 ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。[BR][BR]30m,15000rpm离心,上清转移到新tube 。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube[BR][BR]往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h[BR][BR]加protein A sapharose50ul,再混匀1h[BR][BR]5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex 混匀,离心,去上清。重复4次洗净。
[BR][BR]加电泳用 sample 缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。[BR][BR]3.注意点[BR]A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。[BR]B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完) [/SPAN][BR]
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4. 免疫共沉淀技术路线(CoIP)
2007-05-07 09:14
准备工作:
预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)
4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景
7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)
13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)
15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制:
基础成分:
Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)
NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)
NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)
去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存) 注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存) EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)
亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存) 胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)
RIPA磷酸(酯)酶抑制剂
激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate Activation Protoco)
NaF(200mM的储存液,室温保存)
注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制:
配制100ml的modified RIPA buffe:
1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8℃保存
5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 μl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 μl),但是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度:
? Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
? NP-40: 1%
? 去氧胆酸钠:0.25%
? NaCl: 150 mM
? EDTA: 1 mM
? PMSF: 1 mM
? 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 μg/ml
? Na3VO4: 1 mM
? NaF: 1 mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1.用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2.将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。
3.收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4℃摇动免疫沉淀物1 h。
4.加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4℃摇动免疫沉淀物30 min。
5.用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。
6.吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。
7.将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8.通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9.从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。
10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
范文四:免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀实验原理及方法
免疫共沉淀(CoIP )概述及原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation ,CoIP )是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,属于免疫沉淀技术的一类,常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来(常说的“pull-down”),进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点,第一是天然状态,第二是蛋白复合物。
免疫共沉淀的优势:
与其他研究蛋白质相互作用技术(如GST-Pull down、酵母双杂交等)相比,免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合,避免了人为的影响,因此符合体内实际情况,得到的蛋白可信度更高。
免疫共沉淀的局限性和注意事项:
1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上,意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到;
2. 由于蛋白质形成复合物以后,某些表位就会被掩盖,因此可能导致使用某一种pull-down 抗体,无论怎么增加抗体浓度,也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来,如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP ;
3. 由于检测的是天然状态,因此在不同的时间和不同的处理下,CoIP 拉下来的蛋白复合物都可能是不同的,当然随着实验次数的增加,得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大;
4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白,则需要在试验前进行预测,具有一定的冒险性;当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题,但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事,并且成本较高;
5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用,进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测;
6. 为了保证CoIP 实验的可靠性和严谨性,需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP 实验,并且结果应该能够彼此验证,因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP 都会得到其他所有成员
免疫共沉淀的一般操作流程(中英文对照):
1. 用预冷的PBS 洗涤细胞两次;
Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.
2. 加入预冷的RIPA 裂解缓冲液(107细胞加入1ml );
Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).
3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离,并转移到干净的1.5EP 管中。并置于低速摇床,4℃缓慢晃动15min ;
Scrap cells off to clean 1.5ml eppendorf tubes with a clean, cold scraper. Put them on a low-speed rotating shaker for 15 min at 4°C.
4. 4℃,14000g 离心15min ,立即将上清转移到一个新的离心管中
Centrifuge at 14,000 g 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes immediately.
5. 将Protein A/G-agarose微球用PBS 洗两遍,用PBS 配制成50%的protein A/G-agarose工作液;
Wash protein A/G-agarose beads for 2 times with PBS and make a 50% protein A/G agarose working solution (in PBS)
6. 在样品中以每1ml 中加100μl的比例,加入50%的Protein A/G agarose
工作液。水
平摇床4℃摇动10min (该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白)
Add in 50% protein A/G agarose with ratio of 100μl for a 1ml sample solution. Shake on horizontal shaker for 10min, 4°C (This step aims to eliminate non-specific binding proteins)
7. 4℃,14000g 离心15min ,将上清转移到一个新的离心管中,去除protein A/G-agraose微球;
Centrifuge 14,000g at 4°C for 15min, transfer the supernatant to new tubes and discard protein A/G-agraose beads
8. 使用BCA 法或者其他方法测定总蛋白的浓度
Quantify total protein with BCA assay or other methods.
9. 用PBS 将总蛋白稀释到1 μg/μl以降低裂解液中去垢剂的浓度。如果你觉得你的目的蛋白的浓度低了,你可以将总蛋白浓度提高到10 μg/μl(假设浓度够的话)
Dilute the total protein to 1μg/μl with PBS to decline the concentrations of detergents. If you feel the concentration of your target protein is low, you can dilute the total protein to 10μg/μl. (if it’s high enough)
10. 加入一定体积的一抗,至总体积约为500μl;
Add in appropriate amount of primary antibody to approximately 500μl total volume.
11. 用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物,4℃过夜
Slowly shake antigen-antibody complex on rotating shaker at 4°C for overnight.
注意:如果如果下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定,则最好将11步改为室温孵育2h ; Note: if downstream experiment is enzyme activity assay for kinase or phosphatase, it’s better to change step 11 to a 2h incubation at room temperature.
12. 14000g 离心5s ,收集沉淀,并且用预冷的洗涤缓冲液(或者预冷的PBS )洗涤3遍(每次加入800μl)
Centrifuge 14,000g for 5s, keep the pellet and wash with pre-chilled washing buffer (or cold PBS) for 3 times. (800μl each)
13. (用合适体积的上样缓冲液重悬)收集上清,用于进一步的下游SDS-PAGE ,western-blot 或者质谱分析
Collect the supernatant to proceed to SDS-PAGE, western-blot, or mass spectra analysis.
注意:该CoIP 操作步骤是将抗体先结合到Protein A/G-argarose微球上,然后再与抗原混合。相对其他方法,最终的得率较低,但避免了抗体共洗脱的问题。如果你希望获得
高纯度的目的蛋白,而不考虑非特异性结合的话,你可以将抗体和蛋白样品在加入Protein A/G-argarose微球之前进行混合,这样最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来,从而可能会对western blot检测造成干扰。
Note: This Co-IP protocol is to bind antibody to the Protein A/G-argarose beads and then mix with the antigen. It gives lesser yield than the other one and avoids the problem of co-elution of antibodies. If you want to yield high purity of target protein regardless of non-specific binding, you can mix antibody with protein sample prior to addition of Protein A/G-agarose beads, thus in the end the antibodies are also co-eluted with target protein and interference might occurs in western blot detection.
参考资料:
范文五:免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法
一、基本概念
免疫沉淀(immunoprecipitation)是利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来,初步分离靶蛋白的一种方法。
免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话,那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时,另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同,免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应,是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。
不难看出,免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上,通过进一步与其它技术的结合,如聚丙烯酰胺凝胶电泳,还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。
二、抗体的选择
(一)多克隆抗体
多克隆抗体因其制备相对简单,可与靶蛋白分子的多个位点结合,所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多,常会导致反映本底(是否是背景)升高和一定的假阳性结果。
(二)单克隆抗体
与多克隆抗体相比,单克隆抗体往往只结合一种抗原表位,具有单一结合特异性,所以发生非特异结合的机会少,可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构,甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来,单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。
三、免疫沉淀方法
免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液,可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者,免疫沉淀后再经聚丙烯酰胺凝胶电泳,只需压片即可检测到靶蛋白的存在;若为后者,经免疫沉淀和聚丙烯酰凝胶电泳后,尚需借助银染或免疫印迹进行鉴定。
(一)所需试剂及溶液
改良的RIPA液(细胞裂解液)、稀释缓冲液(常用PBS溶液)、TSA溶液、0.05mol/lTris(pH6.8)、2×SDS蛋白上样缓冲液、抗体与Sepharose或抗免疫球蛋白抗体、蛋白A、蛋白G的交联物。
改良的RIPA液的组成(100ml体系):Tris-HCl: 50 mM(pH 7.4)、NP-40: 1%脱氧胆酸钠(0.25%)、NaCl(150 mM)、EDTA(1 mM)、PMSF(1 mM)、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素(各1μg /ml)、Na3VO4(1 mM)、NaF(1 mM)。
(二)方法
1.用冰冷的PBS溶液洗涤贴壁细胞两次,弃干净PBS。(对于悬浮细胞则用台式离心机以800-1000rpm转速通过离心洗涤)。
2.给细胞培养瓶中加入冰冷的改良RIPA液,RIPA液的用量:按照1 ml/107 细胞/100mm 培养面/150cm2瓶或 0.5 ml每5×106 细胞/60mm 培养面/75cm2 瓶计算。
3.用经蒸馏水预冷的橡皮或塑料细胞刮棒将贴壁细胞转移至一离心管中,轻轻混匀细胞悬液,用振荡器在4℃振荡15min以裂解细胞。
4.于4℃,14000g离心裂解液15min,迅速转移上清至另一离心管中,弃掉沉淀。
5.准备蛋白A(蛋白G或Sepharose):用PBS洗涤蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子两次,并将其用PBS调制成50%悬液。
6.每1ml细胞裂解液上清加入100μl蛋白A,4℃,振荡10min,进行预清除。
7.4℃,14000g离心10min移去蛋白A(蛋白G或Sepharose)珠子,转移上清至一新离心管中。
8.用Bradford法(考马斯亮蓝染色法)测定蛋白浓度。(应至少将细胞裂解液作1:10稀释后再测定,这是因为存在于裂解液中的去污剂成分会干扰考马斯亮蓝的作用)。
9.根据所测得的细胞裂解液蛋白浓度,用PBS将其稀释至1mg/ml以降低缓冲体系中去污剂的浓度(但对于那些在细胞中表达水平较低的蛋白而言,10mg/ml这样更高的浓度可能对免疫沉淀更有效一些)。
10.加入推荐体积的免疫沉淀抗体至500μl细胞裂解液中。(抗体的最适用量要根据每一细胞模型中免疫沉淀靶蛋白的数量来确定)。
11.将细胞裂解液与抗体轻轻混匀后孵育2h,或置摇床上振荡4℃过夜。(选择孵育2h常用于免疫沉淀与激酶或磷酸酯酶作用的活化酶。)加入100μl蛋白A(蛋白G或Sepharose)轻轻振荡1h或4℃过夜以捕获免疫沉淀复合物。(在多数情况下,加入2μg像兔抗小鼠IgG这样的桥连抗体可以增强对免疫复合物的捕获能力,这对于像小鼠IgG1或由鸡所产生的低亲和力抗体尤为重要)。
12.通过脉冲离心(14000 rpm,5s)收集琼脂糖/Sepharose珠子,弃掉上清,用800μl冰冷的改良RIPA缓冲液洗涤珠子3次。
13.将琼脂糖/Sepharose珠子重悬于60μl 2×SDS蛋白上样缓冲液中,轻混均匀后煮沸5min,200g离心1min弃掉珠子。
14.将上清转移至一新离心管中-20℃冻存或进行SDS-PAGE电泳。