范文一:微生物实验技术
微生物实验技术
-----纤维素降解菌的相关研究 1、 土壤中纤维素降解菌的分离、提纯与鉴定
(1) 降解菌的分离;
(2) 降解菌的纯化;
(3) 降解菌分解纤维素能力的测定。
2、 降解菌的形态观察
(1) 降解菌的大小测定,测定100个细菌的长和宽;
(2) 降解菌的普通染色、G染色、芽孢染色,确保每个实验都有一张很好
的照片,G染色必须准确;
(3) 降解菌菌落观察。
3、 降解菌的分子生物学鉴定
(1) 降解菌的DNA提取;
(2) 16S rDNA的扩增;
(3) 16S rDNA的测序及ncbi比对。
4、 降解菌的菌种保藏
(1) 降解菌的常温保藏;
(2) 降解菌的冷冻干燥保藏。
5、 降解菌的液体发酵及其生长曲线的测定
(1) 降解菌液体发酵;
2) 生长曲线的测定; (
(3) 细菌含量的测定。
备注:
(1)每个环节必须拍照;
(2)本次实验5人一组,按照学号成组;
(3)查找文章,预习报告在一周内解决,下周这个时候面批; (4)两个班的班长安排好同学的值日表,每天1组; 预习报告要求:
(1) 实验目的:
(2) 实验原理:
(3) 实验仪器:
(4) 实验步骤:最重要,必须每一个步骤非常详细,每位同学必须知道每个步
骤的内容及原理。
参考文献:
张三,李四.XXXXXXXXX[J].XX期刊,2001,6:12-14.
邓优锦 13276010406 刘新锐 18659183623 刘芳 13599067529 熊芳 13600809374
范文二:微生物实验技术
广州市玉岩中学校本课程
微生物实验技术
[“科技教育特色项目”微生物纯化项目配套教材]
唐红梅编
前 言
2010年广州市玉岩中学生物科组申报到了第五批广州市学校“科技教育特色项目”--- “微生物纯化研究项目”,配合此项目特编写《微生物实验技术》一书,以便较为系统地教会参赛学生一些基本的微生物实验操作技术,为其进一步发展奠定一定的基础。本课程的主要内容有清洁玻璃器皿、灭菌方法、培养基的制备、微生物的分离和纯化实验、选择性培养基筛选目的菌株实验、革兰氏染色法、微生物菌种的保藏等。具体如下:
编者
2011年10月
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实验一 清洁玻璃器皿
(1)一般的玻璃仪器(如烧瓶、烧杯等):先用自来水冲洗一下,然后用肥皂、洗衣粉用毛刷刷洗,再用自来水清洗,最后用纯化水冲洗3次(应顺壁冲洗并充分震荡,以提高冲洗效果)。
计量玻璃仪器(如滴定管、移液管、量瓶等):也可用肥皂、洗衣粉的洗涤,但不能用毛刷刷洗。
(2)精密或难洗的玻璃仪器(滴定管、移液管、量瓶、比色管、玻璃垂熔漏斗等):先用自来水冲洗后,沥干,再用铬酸清洁液处理一段时间(一般放置过夜),然后用自来水清洗,最后用纯化水冲洗3次。
(3)洗刷仪器时,应首先将手用肥皂洗净,免得手上的油污物沾附在仪器壁上,增加洗刷的困难。
(4)一个洗净的玻璃仪器应该不挂水珠(洗净的仪器倒置时,水流出后器壁不挂水珠)。
实验二 灭菌方法
将物体上的所有微生物包括细菌芽孢全部杀死或除去的措施。灭菌的方法有加压灭菌、紫外线照射灭菌、过滤除菌和化学药剂灭菌。应用灭菌技术可对接种室、玻璃器皿、发酵罐、培养皿等进行灭菌,这是进行微生物学研究和微生物工业生产所不可缺少的。
一、常用的灭菌方法有:
(一)干热灭菌
1.焚烧:是一种彻底的灭菌方法,但仅适用于废弃物品或尸体等。
2.烧灼:直接用火焰灭菌,适用于微生物学实验室的接种环、试管口等的灭菌.
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3.干烤:用烤箱灭菌。一般加热至160℃~170℃经2小时。适用于高温下不变质、不蒸发的物品,如玻璃器皿、瓷器等。
(二)湿热灭菌
1.煮沸法:1个大气压下,煮沸的水温为100℃,一般细菌繁殖体煮沸5分钟即被杀死。细菌芽胞常需煮沸1~2小时,才被杀死。水中加入 2%碳酸钠,既可提高沸点达105℃,促进细菌芽胞的杀灭,又可防止金属器皿生锈。
2.巴氏消毒法:用较低温度杀灭液体中的病原菌、同时又不影响消毒物品的营养成分及香味的消毒方法。加热61.1~62.8℃半小时即可,常用于牛奶和酒类等的消毒。
3. 间歇灭菌法:是利用反复多次的流通蒸汽加热,杀死细菌所有繁殖体和芽胞的灭菌法。具体做法是将待灭菌的物品置于阿诺流通蒸汽灭菌器内,100℃ 加热15~30分钟,杀死其中的细菌繁殖体,然后将物品置于37℃温箱中过夜使芽胞发育成繁殖体,次日再通过流通蒸汽加热,如此连续三次,可将所有细菌繁殖体和芽胞全部杀死。
4.高压蒸汽灭菌法:是灭菌效果最好、目前应用最广的灭菌方法。方法是在一密闭蒸锅—高压蒸汽灭菌器内进行的。加热时蒸汽不能外溢,容器内温度随蒸汽压的增加而升高,杀菌力也大为增强。通常在1.05kg/cm2的压力下,温度达121.3℃,维持15~30分钟,可杀死包括细菌芽胞在内的所有微生物。此法适用于耐高温和不怕潮湿物品的灭菌
(三)滤器除菌
凡是具有生物活性的物质,要保持生物活性一般都不能用高压灭菌。生物素及
组氨酸溶液也只能用滤器除菌。
二、选择消毒、灭菌方法的原则
根据物品污染后的危害程度选择消毒、灭菌的方法。
(1)高度危险的物品:必须选用灭菌方法处理。
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(2)中度危险性物品:一般情况下达到消毒即可,可选用中水平或高水平消毒法。但中度危险性物品的消毒要求并不相同,有些要求严格。
(3)低度危险性物品:一般可用低水平消毒方法,或只做一般的清洁处理即可,仅在特殊情况下,才作特殊的消毒要求。例如,当有病原微生物污染时,必须针对污染病原微生物的种类选用有效的消毒方法。
3.根据物品上污染微生物的种类、数量和危害性选择消毒、灭菌方法。
(1)对受到细菌芽胞、真菌孢子、分枝杆菌和经血传播病原体(乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒等)污染的物品,选用高水平消毒法或灭菌法。
(2)对受到真菌、亲水病毒、螺旋体、支原体、衣原体和病原微生物污染的物品,选用中水平以上的消毒法。
(3)对受到一般细菌和亲脂病毒等污染的物品,可选用中水平或低水平消毒法。
(4)对存在较多有机物的物品消毒时,应加大消毒药剂的使用剂量和(或)延长消毒作用时间。
(5)消毒物品上微生物污染特别严重时,应加大消毒剂的使用剂量和(或)延长消毒作用时间。
4.根据消毒物品的性质选择消毒方法
选择消毒方法时需考虑,一是要保护消毒物品不受损坏,二是使消毒方法易于发挥作用。
(1)耐高温、耐湿度的物品和器材:应首选压力蒸气灭菌;耐高温的玻璃器材、油剂类和干粉类等可选用干热灭菌。
(2)不耐热、不耐湿,以及贵重物品:可选择环氧乙烷或低温蒸气甲醛气体消毒、灭菌。
(3)器械的浸泡灭菌:应选择对金属基本无腐蚀性的消毒剂。
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(4)选择表面消毒方法:应考虑表面性质,光滑表面可选择紫外线消毒器近距离照射,或液体消毒剂擦拭;多孔材料表面可采用喷雾消毒法。
微生物对消毒因子的敏感性一般认为,微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序为:
1.亲脂病毒(有脂质膜的病毒)如乙型肝炎病毒、流感病毒等。
2.细菌繁殖体。
3.真菌。
4.亲水病毒(没有脂质包膜的病毒)如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。
5.分枝杆菌:例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。
6.细菌芽胞:例如炭疽杆菌芽胞、枯草杆菌芽胞等。
7.朊毒(感染性蛋白质)。 实验三 培养基的制备
一、 目的
学会和掌握培养基的配制方法
二、实验原理:
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素、能源和水。根据微生物的种类和实验目的不同,培养基要选择合适的配比关系;选择合适的理化性质;配后要及时灭菌。
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牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基,有时又称
为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质,所以可供细菌生长繁殖之用。
高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法:单细胞挑取法,稀释涂布平板法,稀释混合平板法,平板划线法等。
三、实验内容:
1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备
(1)计算 根据配方计算出实验中各种药品所需要的量,然后再分别称量。
(2)称量 准确称取各种成分。一些不易称量的成分如牛肉膏,可用玻璃棒取
出放硫酸纸上称量,然后连同硫酸纸一起放入烧杯中。
(3)溶解 向烧杯内加入所需的水量,将牛肉膏用水洗下后,取出硫酸纸弃
去。加热搅拌全溶后稍放冷。
(4)调pH值 用酸度计或精密pH试纸测定其pH值,并用10%NaOH调至所需
pH值,必要时用滤纸或脱脂棉过滤。一般比要求的pH高出0.2,因为高压蒸汽灭菌后,pH常降低。
(5)分装 根据不同需要,可将配好的培养基分装入配有棉塞的试管或三角瓶
内。注意分装时避免培养基挂在瓶口或管口上引起杂菌污染。如液体培养基,应装试管高度的1/4左右;固体培养基装试管高度的1/5左右;装入三角瓶的量以三角瓶容量的一半为限。
(6)包扎 试管扎成捆。试管和三角瓶的棉塞外用硫酸纸和牛皮纸包扎,纸上
表明培养基的名称、配制日期等。
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(7)灭菌 培养基用0.1Mpa高压蒸汽灭菌15~20min。
2.培养基的高压蒸汽灭菌
灭菌原理:水的沸点可随压力的增加而提高,当高压蒸汽灭菌锅中水煮沸时,因锅是密闭的,蒸汽不能溢出,而使压力增加,水的沸点和温度也随之增加。因此,高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽产生的高温,以及热蒸汽的穿透能力来达到灭菌的目的。一般在0.1Mpa的压力时,温度可达121℃只要维持15~20min,就可杀死一切微生物的营养体和它们的各种孢子。
灭菌方法:
(1)加水于灭菌器内到规定的水平面。
(2)需灭菌的物品(分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基),棉塞、硅
胶泡沫塞等用防潮纸包好(防止锅内水汽把棉塞淋湿),放入灭菌锅内的套筒中。摆放要疏松,不可太挤,否则阻碍蒸汽流通,影响灭菌效果。
(3)将灭菌锅盖的排气管插人套筒侧壁的凹槽内,关闭灭菌锅盖旋紧螺栓,切
勿漏气。
(4)打开放气阀,加热,热蒸汽上升,以排除锅内冷空气,排气约5~l0min,关闭放气阀。
(5)关闭放气阀后,整个灭菌锅成为密闭状态,而蒸汽又不断增多,这时压力
和温度都上升,直至压力表指针达到所需压力时,开始计时,通过调节热源,维持此压力到所需时间。
(6)灭菌完毕,待压力自然降至0时,打开放气阀,注意不能打开过早,否则突然降压致使培养基冲腾,使棉塞、硅胶泡沫塞沾污,甚至冲出容器以外。
(7)打开灭菌锅盖,取出已灭菌的器皿及培养基。
(8)灭菌锅用完后,将锅内剩余的水倒掉,以免日久腐蚀。
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3. 注意事项
(1)要严格按配方配制。
(2)调pH不要过头。
(3)高压灭菌要注意物品不要过多,加热后排除冷空气,到时降压回零取物。 实验四 微生物的分离和纯化
一、目的
学习和掌握微生物的分离和纯化的基础操作技术
二、原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中,不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起,当我们希望获得某一种微生物时,就必须从混杂的微生物类群中分离它,以得到只含有这一种微生物的纯培养,这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而淘汰其他一些不需要的微生物,再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物,直至得到纯菌株。 土壤是微生物生活的大本营,在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的,因此,土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地,可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
三、器材
高氏1号琼脂培养基,肉膏蛋白胨琼脂培养基,马丁氏琼脂培养基,盛9ml无菌水的试管,盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,无菌玻璃涂棒,无菌吸管,接种环,10%酚,无菌培养皿,链霉素,土样等。
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四、操作步骤
1.稀释涂布平板法
(1)倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化,待冷至55~60℃时,向高氏1号琼脂培养基中加入10%酚数滴,向马丁氏培养基中加入链霉素溶液,使每毫升培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板,每种培养基倒三皿,其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶,置火焰旁边,左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞,用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出,如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完,则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝,迅速倒入培养基约15ml,加盖后轻轻摇动培养皿,使培养基均匀分布,平置于桌面上,待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上,用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿,再注入培养基,摇匀后制成平板。最好是将平板放室温2~3天,或 37℃培养24小时,检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
(2)制备 土壤稀释液称取土样10g,放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中,振摇约20分钟,使土样与水充分混合,将菌分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液注入盛有9ml无菌水的试管中,吹吸三次,使充分混匀。然后再用一支1ml无菌吸管从此试管中吸取1ml注入另一盛有9ml无菌水的试管中,以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
(3)涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度,然后用三支1ml无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
(4)培养 将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5日,肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3日。
(5)挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上,分别置28℃和37℃温室中培养,待菌苔长出后,检查菌苔是否单纯,也可用显微镜涂
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片染色检查是否是单一的微生物,若有其他杂菌混杂,就要再一次进行分离、纯化,直到获得纯培养。
2.稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同,无菌操作也一样,所不同的是先分别吸取0.5ml10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿,然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基,边倒入边摇匀,使样品中的微生物与培养基混合均匀,待冷凝成平板后,分别倒置于28℃和37℃温室中培养后,再挑取单个菌落,直至获得纯培养。
3.平板划线分离法
(1)按稀释涂布平板法倒平板,并用记号笔标明培养基名称。
(2)划线在近火焰处,左手拿皿底,右手拿接种环,挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多,但无论哪种方法划线,其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释,使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种:
(a)用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环,先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条,再转动培养皿约70°角,并将接种环上剩余物烧掉,待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线,再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后,盖上皿盖,倒置于温室培养。
(b)将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后,盖上皿盖,倒置温室培养。
(3)挑菌 同稀释涂布平板法,一直到菌分纯为止。
五、实验结果分析
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实验五 选择性培养基筛选目的菌株实验
一、实验目的
学习和掌握分泌目的酶菌株的基本原理和方法
二、原理
产β-甘露聚糖酶的菌株能分泌到菌落周围的培养基中,从而水解培养基的甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖的酶等半纤维,由于使用的经刚果红标记的魔芋精粉,当魔芋精粉被β-甘露聚糖酶作用后便形成分子量小、可溶且交易扩散的水解物,从而在该菌落周围形成颜色较浅的透明圈,而透明圈的大小可以反应酶活性的高低。
三、材料、试剂和仪器
1、菌的来源
玉岩后山树木园里采集几处土样(离表土层11cm 左右)
2、主要化学试剂
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魔芋精粉(成都魔芋精粉厂) 、刚果红(上海伯奥生物科技有限公司)、无菌水和琼脂粉等
3、仪器设备
SW-CJ-1B标准型净化工作台、生化恒温培养箱、电热恒温培养箱 、
HIRAYAMA灭菌锅、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平
四、方法与步骤
1、培养基及其制备
LB培养基: 蛋白胨1g 酵母膏0.5 g 氯化钠1g dH2O 100ml pH 7.0 富集培养基: 魔芋精粉 4g MgCl2.6H2O 0.02g K2HPO4.3H2O 0.1g
KNO3 0.05g dH2O 100ml 自然pH
筛选培养基: 魔芋精粉 1g 琼脂粉1.5 g MgCl2.6H2O 0.02g K2HPO4.3H2O 0.1g
KNO3 0.05g dH2O 100ml pH 7.2-7.4
β-甘露聚糖酶活性检测培养基:
RBV-魔芋精粉 1.5g 琼脂粉1.5g dH2O 100ml pH7.2-7.
2、器皿与培养基的灭菌
培养皿、牙签、塞刻度试管、滴管等四层报纸包好121℃下灭菌20min,备用。
3、土样的采集与稀释
在玉岩后山树木园里采集几处土样(离表土层11cm 左右),混匀后过40目筛,去除小石头及过粗颗粒。称取1g加入装有100ml无菌水的三角瓶中,用力摇匀后静置上10分钟后,取1ml澄清的上层液于无菌具塞试管中,用无菌水定容至10ml,同理依次得到10-4、10-5、10-6、10-7稀释液,分别取10-6、10-7稀释液200μl,与50℃的3%充分溶胀的魔芋精粉混匀后置于37℃恒温箱中培养
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4、菌种的初筛、富集
48小时后挑出液化现象明显的培养基,取100μl培养液适当稀释后,以β-甘露聚糖酶活性检测培养基快速检测酶活的有无和大小(40℃,温育1 h);吸取酶活最高的培养液1ml用2%的富集培养基25ml的作富集培养,同样方法连续培养五次以后,取适当稀释倍数的菌液100μl均匀涂布在筛选培养基上,置于37℃恒温箱中培养18小时后 采用棉绒垫影印法和刚果红染色法,挑出具透明圈的单菌落。
5、产酶菌株的筛选分离、纯化
挑取出现透明圈的单菌落平板划线,相同条件下培养至透明圈出现,以后按同样方法进行复筛,重复6次以后,得到纯化菌株。
五、结果的处理与分析
1、菌落产生透明水解圈的观察
用直尺分别与不同方向测量菌落和水解圈的直径大小,求平均值,计算透明水解圈直径与菌落直径的比值。
2、候选菌落的形态观察
六、注意事项
1、实验过程中避免说话、走动
2、注意实验仪器与用具的消毒
3、每次接种针或涂布棒要灼烧灭菌,冷却后再涂下一块板
实验六 革兰氏染色法
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,1884年由丹麦医师、细菌学家 Christain Gram创立。
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细菌先经碱性染料结晶染色,而经碘液媒染后,用酒精脱色,在一定条件下有的细菌此色不被脱去,有的可被脱去,因此可把细菌分为两大类,前者叫做革兰氏阳性菌(G+),后者为革兰氏阴性菌(G—)。为观察方便,脱色后再用一种红色染料如碱性蕃红、稀释复红等进行复染。阳性菌仍带紫色,阴性菌则被染上红色。有芽胞的杆菌和绝大多数的球菌,以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏正反应;弧菌,螺旋体和大多数致病性的无芽胞杆菌都呈现负反应。革兰氏阳性菌对青霉素敏感,革兰氏阴性菌对链霉素敏感。可根据革兰氏染色法鉴别不同菌种并对症下药。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在化学组成和生理性质上有很多差别,染色反应不一样。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物,它与碘和结晶紫的复合物结合很牢,不易脱色,阴性菌复合物结合程度底,吸附染料差,易脱色,这是染色反应的主要依据。 另外,阳性菌菌体等电点较阴性菌为低,在相同PH条件下进行染色,阳性菌吸附碱性染料很多,因此不易脱去,阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如,在强碱的条件下进行染色,两类菌吸附碱性染料都多,都可呈正反应;pH很低时,则可都呈负反应。此外,两类菌的细胞壁等对结晶紫—碘复合物的通透性也不一致,阳性菌透性小,故不易被脱色,阴性菌透性大,易脱色。所以脱色时间,脱色方法也应严格控制。
染色原理
G+菌:细胞壁厚,肽聚糖网状分子形成一种透性障,当乙醇脱色时,肽聚糖脱水而孔障缩小,故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。
Gˉ菌:肽聚糖层薄,交联松散,乙醇脱色不能使其结构收缩,其脂含量高,乙醇将脂溶解,缝隙加大,结晶紫-碘复合物溶出细胞壁,番红染液复染后呈红色。 操作流程
革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是:
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1)涂片固定。在无菌操作条件下,用接种环挑取少量细菌于干净的载玻片上涂布均匀,固定。
2)草酸铵结晶紫染1分钟。
3)自来水冲洗,去掉浮色。
4) 用碘-碘化钾溶液媒染1分钟,倾去多余溶液。
5)用中性脱色剂如乙醇(95%)或丙酮酸脱色30秒,革兰氏阳性菌不被褪色而呈紫色,革兰氏阴性菌被褪色而呈无色。
6)用蕃红染液复染30秒,革兰氏阳性菌仍呈紫色,革兰氏阴性菌则呈现红色。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌即被区别开。
实验七 微生物菌种的保藏方法
一、菌种的保藏方法
(一)定期移植保藏法
定期移植保藏法又称传代培养保藏法,包括:斜面培养、液体培养、穿刺培养等,是最早使用而且现今仍然普遍采用的方法。操作方法:将菌种接种于适宜的培养基中,最适温度下培养,待长出健壮菌落,置温度4℃ ~6℃ 、相对湿度60% ~70%的条件下保藏,并且每隔一定时间移植培养1次。定期移植的时间,随微生物的种类不同而异。一般来说,不产芽孢的细菌每月移植1次,芽孢细菌每3个月移植1次;放线菌、酵母菌、霉菌和食用菌每3~6个月移植1次。该法便于操作,不需特殊设备,并可随时观察菌种的变异、退化、污染、死亡现象。但是,菌种在长期保藏中频繁移植传代,易变异退化,并有杂菌污染的危险。
(二)矿油封存法
矿油封存法又称液体石蜡封存法,系为定期移植保藏法的辅助方法。具体方法:将化学纯的液体石蜡经121℃灭菌30 min后,注入试管斜面培养物上,使液面高出试
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管斜面1 cm,试管口盖上胶塞,以直立状态将试管斜面菌种排放在试管架上,置温度4℃ ~ l5℃ 、干燥条件下保藏。使用时,到去液体石蜡,用无菌水洗涤斜面菌种1~2次,进行接种。试管斜面菌种采用矿油封存,防止了培养基中水分的蒸发,隔绝了菌种与氧的接触,降低了微生物的代谢活性,使保藏期较定期移植法延长。
(三)蒸馏水或溶液悬浮保藏法
蒸馏水或溶液悬浮保藏法是一种简单的菌种保藏法,系指将微生物细胞悬浮在蒸馏水或蔗糖、葡萄糖、磷酸、食盐等溶液中,置低温下封存保藏的方法。菌种悬浮的方法有:细胞悬浮法和菌块悬浮法。
1.细胞悬浮法
取试管斜面或平板菌落1菌环,移入已灭菌的5 ml蒸馏水或溶液试管中,使细胞在蒸馏水或溶液中分散,盖上灭菌胶塞,置l0℃ 条件下保藏。恢复活性时,从试管中移出1菌环于新鲜培养基中,而原试管悬浮菌种加塞后可继保藏。
2、茵块悬浮法
从平板培养的丝状真菌菌落边缘切取约6 mm见方的小块,连同琼脂一起悬浮于无菌的5 ml蒸馏水或溶液试管中,盖上灭菌胶塞,置10℃ 条件下保藏。恢复活性时,从试管中移出1小块于新鲜培养基中,而原试管悬浮菌种加塞后可继续保藏。采用蒸馏水或溶液悬浮法保藏某些细菌该法操作简便,效果较好
(四)液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法。签于真空冷冻干燥法不易保藏不产孢子的丝状真菌(如食用菌中的某些担子菌)和高度组织化的高等生物细胞的事实,特别是近年来的研究发现,真空冷冻干燥法对某些生物具有致突变作用,因而更加促进了液氮超低温保藏技术的发展。1949年,英国低温冷冻精子获得成功;1956年MERYMAN提出:一130℃ 是生物化学反应和生物变异的终止点,由此推断,能经受超低温冷冻及其后融化的生物,在一130℃ 或更低的液氮温度下可能无限期地保持原有的生物学性状而存活;60年代以后,受液氮保藏高等生物细胞的启发,开始探索液氮超低温冷冻
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技术保藏微生物菌种,至今已取得了许多成功的经验。目前,液氮保藏法被认为是长期保藏所有微生物菌种最为有效的方法。液氮保藏法保藏微生物菌种的主要设备和器具有:液氮发生器(生产制造液氮的设备)、液氮贮存罐(盛纳液氮的容器,定期向液氮冰箱中补充液氮)、液氮生物贮存罐(即液氮冰箱,用于保藏安瓶管菌种)、控速冻结器(控制安瓶管菌种冻结速度的仪器)、安瓶管(装有菌种悬液的小试管)、铝夹(固定安瓶管的铝制长形夹卡)等。利用该法可达到长期保藏微生物菌种的目的,效果良好。但需要定期向液氮冰箱中补充液氮,费用较高,运输不方便。
(五)干燥保藏法
1.普通干燥保藏法
在液氮超低温冷冻技术和真空冷冻干燥技术尚未广泛应用于菌种保藏之前,多采用普通干燥法保藏菌种。普通干燥保藏法系利用干燥的原理保藏菌种,即将微生物细胞或孢子吸附在容易干燥的载体上,干燥后保藏。根据载体不同,有砂土管保藏法、滤纸片保藏法、明胶或硅胶保藏法、麸皮保藏法等,虽然形式不同,但原理和操作程序类似,现只介绍砂土管保藏法。
(1)砂土管的制备:
取河砂,过60 目筛,10% 盐酸浸泡24h,水冲洗至中性,烘干备用;取果园土,风干、粉碎,过60 目筛备用;将砂与土按2:1(w/w)混合,分装安瓶管(10×100 ram)1cm 厚,塞好棉塞,121℃ 灭菌30 rain备用。
(2)菌种悬液的制备:
在培养好的试管斜面培养物中加入蒸馏水3 mL,洗下细胞或孢子,制成菌种悬液。
(3)菌种悬液与载体混合:
用无菌吸管将菌种悬液滴入砂土管中,每管10滴,摇均。
(4)干燥:
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将砂土管菌种放入底部盛有P2 O5的干燥器中,待P,O 吸水成糊后更换,反复数次,砂土管菌种即可干燥。
(5)保藏:
砂土管干燥后,仍可在干燥器内保藏或将砂土管
熔封后保藏。由于细菌的芽孢、放线菌和真菌的孢子耐干燥,因而,该法适宜保藏芽孢细菌、放线菌和产孢真菌。
2.真空干燥保藏法
真空干燥保藏法是利用干燥、隔氧的原理保藏菌种,即将微生物细胞或孢子与保护剂混合制成悬液,直接真空干燥,再经真空封存后保藏。由于菌种悬液不经冻结而直接真空干燥,因而又称L一干燥法或称液体直接干燥法。该法由ANNEAR 于1958年建立。真空干燥法保藏菌种的装置为:在真空泵与多歧管相连的管路上安装热电偶真空计和冷凝器(水分收集器,内有P2 O5),多歧管通过密封圈和螺圈帽与安瓶管相连,安瓶管下面设置水浴槽保温。该法适合保藏对冷冻比较敏感的微生物菌种,而且大多数细菌采用此法保藏存活率较低。
3.真空冷冻干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法简称冻干法,即将微生物细胞或孢子与保护剂混合制成悬液,在共溶点以下预冻,然后,在低于三相点压力的高度真空状态下使冰晶升华,最后达到干燥。冻干法由于利用低温、干燥、隔氧的原理保藏菌种,使菌种的代谢终止并处于休眠状态,保藏期得以延长。20世纪50年代以来,冻干法被广泛应用于微生物菌种的保藏,研究表明:除了某些不产孢子的丝状真菌(如食用菌中的某些担子菌)不宜采用此法保藏外,其它各类微生物采用该法保藏均取得良好效果,菌种保藏期可达lO年以上。另外,冻干菌种便于保藏、运输和商品化生产,因而,随着冻干技术和设备的日益完善,冻干法已成为目前世界各国保藏微生物菌种的主要手段。冻干法保藏菌种的主要设备是真空冷冻干燥机,型号各异。
二、影响茵种存活及长期保藏的主要因素
(一)培养条件和菌龄
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实践证明:保藏各类食品微生物菌种,采用最适培养基和最适培养温度进行培养,可提高微生物的存活率,延长菌种保藏期;同一菌种相同成分的培养基,液体培养或固体培养对微生物的存活力影响不大。研究表明:处于稳定期的细胞或成熟的孢子对不良环境具有较强的抗性,因而,保藏非芽孢细菌、酵母菌,应采用对数末期或稳定初期的细胞;而保藏芽孢细菌、放线菌、霉菌,要用成熟的孢子。
(二)菌种悬液的浓度
为了保证菌种保藏期间具有一定数量的存活细胞,往往将保藏微生物的细胞浓度增大。一般要求:细菌细胞和放线菌孢子的浓度> l0 cfu/mL;酵母菌细胞和霉菌孢子的浓度>10 cfu/mL。另外,在液氮超低温冷冻、真空干燥和真空冷冻干燥过程中,高浓度细胞可降低每个细胞暴露在介质中的面积,从而增强了抗冷冻、抗干燥的能力,提高了细胞存活率。
(三)保护剂
采用液氮超低温冷冻、真空干燥和真空冷冻干燥保藏菌种,保护剂的选择是提高微生物冷冻或干燥存活率、延长菌种保藏期的关键因素。有人提出:保护剂可分为低分子保护剂(如低聚糖类、醇类、缓冲盐类、氨基酸和维生素类)和大分子保护剂(如蛋白质和多肽类、多糖类)。作为低分子保护剂应具有很强的亲水性,其结构应具备3个以上氢键,对糖、醇而言,应具有5个以上的羟基,在冷冻或干燥过程中,可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白质极性基团形成氢键,保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体,同时,促进低分子保护剂发挥作用。然而,不同的食品微生物菌种所适宜的保护剂也不同,必须通过试验精心筛选而确定,不可照抄照搬。
(四)冻结速度
在液氮法和冻干法保藏菌种的过程中,冻结速度是影响微生物存活率的重要因素。不同种类的食品微生物菌种所需要的冻结速度不同,冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡,而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。若冻结速度过慢,胞内盐浓度升高造成细胞损伤;若冻结速
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度过快,胞内冰晶形成而损害细胞。实验表明:细胞悬液以l℃/min的速度降温至一35℃ ~ 一40℃I h左右达到冻结视为适宜的慢速冻结;而细胞悬液以l0℃ /min以上的速度降温至一35℃ ~ 一40℃ 短时间内达到冻结视为快速冻结。研究发现:真核微生物菌种适宜慢速冻结;而原核微生物菌种经慢速冻结和快速冻结后,细胞存活率差异并不显著。
(五)干燥程度
水活度是影响干燥菌种保藏稳定性的重要因素。研究表明:干燥菌种的水活度保持在0.1或含水量保持在1.5% ~3.0%为宜。如果含水量>3.0% ,菌种贮藏稳定性降低;而含水量
(六)保藏条件
根据菌种保藏的目的和原理,尽量采取低温、干燥、避光、真空密封等综合技术措施和条件保藏菌种,以利于菌种保藏期的延长。
(七)恢复培养
处于液氮冷冻状态的菌种恢复培养时,通常采用3812~4012快速升温解冻,这是因为慢速升温解冻有可能使胞内再结冰,造成胞内冰晶增大而伤害细胞。对于真空干燥和冻干菌种恢复培养时,复水介质产生的渗透压和复水条件(温度、pH)都有可能影响细胞膜以及酶蛋白分子的结构和性质发生变化,造成细胞损伤活死亡。 参考文献:田洪涛, 贾英民,河北农业大学学报(农林教育版) ,食品微生物学实验教学菌种的保藏, 2003年6月第5卷第2期,P34-38
附:
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常用培养基配方
1 营养琼脂培养基
成分
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15~20g
蒸馏水 1000ml
制法:
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内,加入15%氢氧化钠溶液约2ml,校正pH7.2—7.4,加入琼脂,加热煮沸,使琼脂溶化。分装在三角锥瓶中,在121℃下高压灭菌15分钟。
2 乳糖胆盐发酵管培养基(单料)
成分
蛋白胨 20g
猪胆盐 5g
乳糖 10g
0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL
蒸馏水 1000ml
pH7.4
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制法
将蛋白胨,胆盐及乳糖溶于水中,校正pH值,加入指示剂分装,每支管10ml,并放入一个小倒管(产气管),在115℃下高压灭菌15分钟。
注:双料乳糖胆盐发酵管培养基除蒸馏水外,其他成分加倍。
3 乳糖发酵管培养基(单料)
成分
蛋白胨 20g
乳糖 10g
0.04%溴甲酚紫水溶液 25ml
蒸馏水 1000ml
pH7.4
制法
将蛋白胨及乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂分装,每支管3ml,并放入一个小倒管(产生气),在115℃下高压灭菌15分钟。
注:双料乳糖发酵管培养基除蒸馏水外,其他成分加倍。
4 伊红美琼脂(EMB)培养基
成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 2g
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琼脂 2g
2%伊红溶液 20ml
0.65%美兰溶液 10 ml
蒸馏水 1000ml
pH7.1
制法
将蛋白胨,磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中,校正pH,分装于三角锥瓶内,在121℃下高压灭菌15分钟后备用。临用时加入乳糖并加热熔化琼脂,冷却至50~60℃,加入伊红和美蓝溶液摇匀,浇注平板。
5 远藤氏培养基
配方:
蛋白栋 10.0g
乳糖 10.0g
磷酸氯二钾 3.5g
亚硫酸氢钠 2.5g
碱性品红 0.4g
琼脂 10.0g
蒸馏水 100ml
制备:
配料放入蒸馏水中,搅拌15分钟,使其溶解,分装到三角瓶或试管,121℃灭菌20分钟, 冷却后贮于暗处,最佳温度为4~8℃以保持浅粉红色。
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6 UBA培养基
酵母浸膏 6.1g
蛋白胨 15g
番茄汁(244ml) 12.2g
葡萄糖 16g
K2HPO4 0.31g
MgSO4·7H2O 0.12g
NaCl 0.006g
FeSO·7H2O 0.006g
MnSO4·H2O 0.006g
琼脂12g蒸馏水 750ml
啤酒 250g
将上述配料加入水中,加热至沸,搅拌至完全溶解,趁热加入未脱气的啤酒,轻轻搅拌混合,用HCI或NaOH调pH为6.0+0.1,分装于三角瓶中,,121℃蒸汽灭菌20min。待冷却后,放置在36±℃培养24h小时备用。
7 乳酸杆菌培养基
UBA+ABP抑制剂溶液(UBA见前)
ABP抑制剂溶液
配料
放线菌酮 0.1g
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溴甲酚绿 0.15g
无离子水 80ml
2-苯乙醇 20ml
配制
把溴甲酚绿放入50毫升水中,煮沸至完全溶解,把放线菌酮溶于30毫升水中,将两种溶液混合,分装于带螺旋盖的瓶中,每瓶20毫升,在121℃蒸汽灭菌10分钟,冷却后,每个瓶内加5毫升2-苯乙醇,并拧紧瓶盖。该溶液会分成两层,使用前须用力摇匀。
8 KOT培养基
配方
胰朊酶蛋白胨 5.0g
麦汁浸出生 2.5g
酵母浸出物 2.5g
肝浓缩物 1.0g
麦芽糖 5.0g
葡萄糖 5.0g
L-苹果酸 0.5g
吐温-80 1ml
K2HPO4 0.5g
MgSO4·7H2O 0.125g
MnSO4·5H2O 0.025g
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盐酸半光氨酸 0.5g
胞苷 0.2g
胸苷 0.2g
啤酒 800ml
放线菌酮 100ml
NaN3
琼脂
蒸馏水至
pH25.4
9 日本KL-2B培养基
配方:
胰蛋胨
麦汁浸生物
酵母浸出生
麦芽糖
K2HPO4
MgSO4·7H2O
MnSO4·5H2O
柠檬酸
吐温-80
50mg 20g 100ml 20.0g 10.0g 5.0g 10.0g 3.0g 1.0g 0.25g 2.75g 100mg 27
琼脂 20g
蒸馏水至 1000ml
pH5.2
10 MRS麦芽糖琼脂培养基
没有一种单独的方法能够检测所有的乳酸细菌,这些细菌对各种糖的利用能力是有差别的,许多菌株能在好氧条件下在琼脂培养基上生长,而另一些菌株则更容易在厌氧条件下生长。
下面列出的培养基,能检测出许多种的乳酸细菌。但是,这些培养基不是绝对的,使用者可根据自己的经验进行修正后采用。
原理:液体样品培养在含有合适的不同种类琼脂培养基的培养皿中,计算活菌落数。
麦芽糖 5.0g
蛋白胨 10.0g
牛肉浸膏粉 8.0g
酵母浸出物 4.0g
葡萄糖 20.0g
吐温-80 1.0ml
K2HPO4 2.0g
醋酸钠 5.0g
柠檬酸铵 2.0g
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MgSO4·7H2O 0.05g
琼脂 15g
在蒸馏水中溶解,并定容至1L。用1.0NHCl或0.1NNaOH调至4.7。蒸汽灭菌121℃,20分钟。
11 Ra-Ray培养基
NBB培养基是德国进行啤酒有害菌检查常用培养基,正如大家所知德国在有害菌研究领域处于领先地位,所以很多文献中提到使用NBB培养基有必要讲清楚。 NBB培养基是Prof.Back专门为检查啤酒有害菌而开发的。
NBB培养基分三种,NBB-A(琼脂型)、NBB-B(试液型)、NBB-C(浓缩型),最近又推出NBB-Am,是在NBB-A的基础上开发的。
NBB培养基是专利产品,由德国Doher公司制造销售。
NBB-A适用于刷洗水、啤酒为样品的细菌检查。
NBB-B适用于酵母(回收酵、培养酵母)的细菌检查。
NBB-C适用于有酵母的混浊啤酒(发酵液、未过滤啤酒)。
培养温度:25~28℃
培养时间:严重污染样品,1天可以检出。污染轻微或生长缓慢的菌5天左右。 培养条件:厌氧二氧化碳充气下。
注:虽然NBB有很高的检出率,但由于样品过滤或残有空气都可能使Pectinatus菌、Megashaera菌不能检出。
12 LMDA培养基
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番茄汁固形物
蛋白胨 2%
泛酸钙 0.2%
酵母浸膏 1%
葡萄糖 1%
碳酸钙 0.5%
柠檬酸 0.11%
磷酸氢二钾 0.05%
磷酸二氢钾 0.05%
硫酸镁 0.02%
硫酸锰 0.001%
氯化钠 0.001%
硫酸铁 0.001%
溴甲酚红绿 0.0022%
吐温-80 0.05%
放线菌酮 0.0007%
琼脂 1.5%
配制
加水溶解,分装三角瓶,121℃蒸汽灭菌10分钟,冷却后,避光保存。 13 日本Pectinatus属菌检出培养基
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配方:
蛋白胨 10.0g
麦芽浸出物 8.0g
酵母浸出物 4.0g
K2HPO4 2.0g
NaCl 5.0g
MgSO4·7H2O 0.2g
MnSO4·5H2O 0.05g
吐温-80 1ml
L-Cystine-HClCMonnhydrate 0.5g
Resazurin钠盐 1mg
Erythromycin 5mg
琼脂 20g
蒸馏水至 1000ml
pH6.0
14 麦汁液体培养基
取原麦汁(头滤麦汁),用单层滤纸过滤后,冷却至40℃以下。
过滤后的原麦汁800~1000ml中加一个蛋清,(加蛋清之前,往蛋清里加少许蒸馏水或麦汁充分搅匀,产沫为止,然后加入麦汁里)混匀。
加热煮沸(最好间接加热)20~30分钟,然后冷却至70℃左右后用双层滤纸过滤。
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把过滤后的麦汁冷却至20℃后,测糖度,然后稀释至糖度为12°P。
调整pH值为5.4~—5.7,然后分装(试管加6ml,小三角锥瓶加50ml,中三解瓶加200ml),用牛皮纸包扎。
在高压灭菌锅里110℃压力下,灭菌20分钟。
15 麦汁固体培养基
步骤同上
调整pH值为5.4~5.7后,加1.5~2.0%的琼脂粉,加热(最好间接加热)溶化琼脂,分装,包扎。
在高压灭菌锅里110℃下,灭菌20分钟,冷却至60℃左右后,摆斜面或倒平板。 16 WLN琼脂培养基
酵母浸膏 4.0g
干酷素酮 5.0g
葡萄糖 50.0g
磷酸二氢钾 0.55g
氯化钾 0.425 g
氯化钙 0.124g
氯化铁 0.0025g
硫酸镁 0.125g
硫酸锰 0.0025g
琼脂 20.0g
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溴甲酚绿 0.022g
蒸馏水 1.0l
上述组分除琼脂外溶解于蒸馏水中,调整溶液pH为5.5,加琼脂,很好混合,加热,使琼脂溶解,高压斧121℃蒸汽灭菌不少于15min,冷却至40~45℃,分装于无菌培养皿中。
17 YPD培养基
配方:
酵母浸出物 10g
蛋白胨 20g
葡萄糖 20g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
溶解后121℃灭菌15分钟,冷却,制成平皿固体培养基。
18 TTC琼脂培养基
溶液A:
三苯基四唑氯2.0g
磷酸缓冲液100.0ml
(磷酸缓冲液浓度为0.134mol/L,pH7.2)(无水NaH2PO41.26g,无水Na2HPO41.16g加水溶解至100ml)
溶液B:
琼脂20.0g
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蒸馏水100.00ml
制备溶液A和B。制备溶液B时要加热使琼脂溶解。两溶液混合,冷却至45℃。 19 MYGP培养基
配方
酵母浸膏 3.0g
麦牙浸出物 3.0g
蛋白胨 5.0g
葡萄糖 10.0g
琼脂 15.0g
吐温-80 10ml
冷蒸馏水 1000ml
配制:
把配料放入水中,边搅拌边加热至沸,然后分装到带螺旋盖的瓶内,121℃蒸汽灭菌10分钟
附:常用微生物染色法及染色液配制
1 美蓝染色
1.1 吕氏碱性美蓝染色液
美蓝 0.3g、95%乙醇 30ml、 0.01%氢氧化钾溶液100ml,将美蓝溶解于乙醇中,然后与氢氧化钾溶液混合。
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1.2 染色法将涂片在火焰上固定,待冷。滴加染液,染1~3min,水洗,待干,镜检。
1.3 结果菌体呈蓝色。
2 革兰氏染色法
2.1 结晶紫染色液
结晶紫 1g、95%乙醇 20ml、1%草酸铵水溶液 80ml,将结晶紫溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
2.2 革兰氏碘液
碘 1g、 碘化钾 2g、蒸馏水300ml,将碘与碘化钾先进行混合,加入蒸馏水少许,充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300ml
.2.3 沙黄复染液
沙黄 0.25g、95%乙醇 10ml、蒸馏水 90ml,将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
2.4 染色法
2.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
2.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
2.4.3 滴加95%乙醇脱色,约30s;或将乙醇滴满整个涂片,立即倾去,再用乙醇滴满整个涂片,脱色10s。
2.4.4 水洗,滴加复染液,复染1min。水洗,待干,镜检。
2.5 结果革兰氏阳性菌呈紫色。革兰氏阴性菌呈红色。注:亦可用1:10稀释石炭酸复红染色液作复染液,复染时间仅需10s。
3 耐酸性染色法
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3.1 石炭酸品红染色液
碱性品红 0.3g、95%乙醇 10ml、5%酚水溶液 90ml,将品红溶解于乙醇中,然后与酚溶液混合
3.2 3%盐酸-乙醇 浓盐酸 3ml、 95%乙醇 97ml
3.3 复染液吕氏碱性美蓝染色液。
3.4 染色法
3.4.1 将涂片在火焰上加热固定,滴加石炭酸品红染色液,徐徐加热至有蒸气出现,但切不可使沸腾。染液如因蒸发减少时,应随时添加。染5min,倾去染液,水洗。
3.4.2 滴加盐酸-乙醇脱色,直至无红色脱落为止(所需时间视涂片厚薄而定,一般为1~3min),水洗。
3.4.3 滴加吕氏碱性美蓝染色液,复染30s~1min,水洗,待干,镜检。
3.5 结果:耐酸性细菌呈红色,其他细菌、细胞等物质呈蓝色。
4 柯氏染色法
4.1 染色液
4.1.1 0.5%沙黄液。
4.1.2 0.5%孔雀绿液。
4.2 染色法
4.2.1 将涂片在火焰上固定,滴加0.5%沙黄液,并加热至出现气泡,约2~3min,水洗。
4.2.2 滴加0.5%孔雀绿液,复染40~50s。水洗,待干,镜检。
4.3 结果布氏杆菌呈红色,其他细菌及细胞呈绿色。
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5 奥尔特氏荚膜染色法
5.1 染色液 沙黄 3g、 蒸馏水 100ml用乳钵研磨溶解。
5.2 染色法将涂片在火焰上固定,滴加染色液,并加热至产生蒸气后,继续染3min。水洗,待干,镜检。
5.3 结果炭疽芽胞杆菌菌体呈赤褐色,荚膜呈黄色。
6 瑞氏染色法
6.1 染色液瑞氏色素 0.1g甲醇、 60ml用乳钵研磨溶解。
6.2 染色法
6.2.1 涂片待自然干燥后,滴加染色液,固定1min。
6.2.2 加入等量蒸馏水(pH6.5),染色3~5min。
6.2.3 用蒸馏水冲洗,待干,镜检。
7 鞭毛染色法
7.1 染色液的配制
7.1.1 甲液:称丹宁酸5g、氯化高铁(FeCl3)1.5g,溶于100ml蒸馏水中,待溶解后加入1%的氢氧化钠溶液1ml和15%的甲醛溶液2ml
7.1.2 乙液:称2g硝酸银溶于100ml蒸馏水中。在90ml乙液中滴加浓氢氧化铵溶液,到出现沉淀后,再滴加使其变为澄清,然后用其余10ml乙液小心滴加至澄清液中,至出现轻微雾状为止(此为关键性操作,应特别小心)。滴加氢氧化铵和用剩余乙液回滴时,要边滴边充分摇荡,染液当天配,当天使用,2~3d基本无效。
7.2 染色法
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在风干的载玻片上滴加甲液,4~6min后,用蒸馏水轻轻冲净。再加乙液,缓缓加热至冒汽,维持约半分钟(加热时注意勿使出现干燥面)。在菌体多的部位可呈深褐色到黑色,停止加热,用水冲净,干后镜检,菌体及鞭毛为深褐色到黑色。 8 碱性复红染色法
将0.5g碱性复红染料溶解于20ml95%乙醇中,然后用蒸馏水稀释至100ml。如有不溶物时,可用滤纸过滤,或静置后取上清液备用。注:本染色液系用于苏云金芽胞内蛋白质毒素结晶的染色,藉以与蜡样芽胞杆菌相区别
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范文三:微生物实验技术讲义
开课编号:513041Y
微生物学实验技术
Experiment of Microbiology
课程编号:S071005ZY009 课程属性:专业课
预修课程:微生物学、生物化学、普通生物学、遗传学
教学目的和要求: 学时/学分:60/1
本课程为微生物学专业研究生专业课,也可作为相关专业研究生的选修课。通过本课程的教学,训练学生掌握微生物学的操作技能;进一步了解、深化微生物学的基本理论,加深理解课堂讲授的有关微生物学理论知识,同时通过实验,培养同学观察、思考、分析问题和辩证思维能力,为今后从事教学、科研和生产工作打下扎实基础。
实验一 微生物实验综合介绍(8h )(刘利新)
1. 微生物学实验室安全操作规程讲解
本部分内容将参照《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》(WS233-2002), 该《准则》于2003年8月1日实施。规定了微生物和生物医学实验室生物安全防护的基本原则、实验室的分级及其基本要求。本节课将对其中内容进行选择性讲解,期望对新入实验室的学生规范化管理起到积极的促进作用。
2. 微生物实验设备综合介绍
3. 细菌、放线菌分离培养基的制备
为保证下节实验课的顺利进行,本次实验课将配制细菌、放线菌分离培养基。详细步骤参见实验二中培养基制备。
实验二 从自然界分离筛选微生物菌种(8h )(戴欣)
一、 实验目的
掌握环境样品微生物分离培养的基本方法,并对分离得到的微生物进行初步分类鉴定
二、 实验原理
自然界中存在着各种各样的微生物,可以通过人工培养基提供微生物生长所需要的营养物质,将其中部分微生物从环境中分离出来。不同的微生物对营养要求有很大的差别,明确这一点非常重要。
培养基配制的基本原理是人工地将多种营养物质按照各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养物质,一般包括碳源、氮源、无机盐和水。
由于微生物无处不在,因此培养基在使用之前必须灭菌。对于大部分培养基而言是可以通过高压湿热灭菌来实现。
由于微生物核糖体小亚基RNA 基因功能稳定、分布广泛且由高变区和保守区相间组成,是目前广泛应用的微生物分子分类鉴定标准。本实验通过对微生物的16S rRNA基因序列分析从而对其进行初步分类鉴定。
三、 实验内容及步骤
1. 细菌、放线菌分离培养基的制备
培养基配制的基本步骤:
1) 先在空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水
2) 称量培养基各组分
3) 溶化各组分,如需要可搅拌或加热
4) 调pH ,定容
5) 分装。如需配制固体培养基可加入1.5%琼脂粉
6) 高压蒸汽灭菌:一般选择121℃/20min,但如果培养基中有葡萄糖类物质应选择
115℃/20min。
R2A 培养基(细菌用):
酵母提取物:0.5g ;蛋白胨:0.25g ;酪氨酸:0.75g ;葡萄糖:0.5g ;淀粉:0.5g ;磷酸氢二钾:0.3g ;硫酸镁:0.024g ;丙酮酸钠:0.3g ;加水稀释至1L ,调节pH 至7.5-7.8,琼脂15g ,115℃灭菌20分钟后倒平板;
GYM 培养基(放线菌用):
酵母提取物:4g ;麦芽糖:10g ;葡萄糖:4g ;碳酸钙:2g ;加水稀释至1L ,调节pH 至7.5-7.8,琼脂15g ,115℃灭菌20分钟后倒平板。
2. 样品的采集和保存
采集用具和样品放置容器严格灭菌处理,防止样品污染。
微生物分离培养样品短期可4℃保存,长时间存放最好冷冻保存。
3. 微生物分离培养
微生物的分类培养要特别注意无菌操作,无菌操作基本环节如下:
1) 接种室或超净台要保持清洁,用前使用紫外灯灭菌
2) 接种的试管、三角瓶等要做好标记,避免弄混。接种使用的枪尖等要做灭菌处理
3) 接种前双手要用70%酒精消毒,并避免直接接触样品
4) 培养箱注意清洁,并经常消毒
首先根据对样品中微生物生物量的估算,按梯度稀释样品,一般制备原液、10-1~10-7 稀释液;如果样品生物量较低,也可选择浓缩样品或经液体培养基富集培养样品中的微生物;
然后取100ul 稀释(或浓缩)样品液或富集培养物涂布于分离培养基上,28℃(或样品
采集环境温度)倒置培养3~5天。
特定微生物的分离培养:根据微生物的营养需求选择性添加营养元素来富集特定微生物、模拟微生物的特定生境(如人工海水或者高温、低温培养)、利用微生物的某些降解活性(如纤维素降解活性)分离特定微生物等
4. 微生物菌株纯化与保存
将长出的菌株挑取在新的培养基上进行划线纯化,一般重复2-3次以上;
将纯化后的菌株可转至试管斜面培养后置于4℃短期保藏,也可经液体培养后添加保护剂(甘油、二甲基亚砜、脱脂奶粉等)置于-20℃或-80℃长期冻存。
5. 纯化菌株的(分子)鉴定
首先对得到的菌种进行液体培养至对数生长期,离心收集菌体,采用细菌DNA 提取试剂盒提取细菌的总DNA 。
然后使用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR 扩增,扩增条件:94℃ 4min, 94℃ 1min,55℃ 1min, 72℃ 2min, 30个循环后72℃ 10min ,至4℃停止。PCR 产物经电泳检测和PCR 产物纯化试剂盒纯化后送公司测序,通过BLAST 将获得的序列与GenBank 数据库中序列进行相似性比对,初步鉴定菌种的类群。
16S rRNA通用引物如下:
27F 5' AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3'
1492R 5' TAC GGY TAC CTT GTT ACG AC 3'
实验三 厌氧微生物的培养(8h )(佟卉春)
一、 实验目的
熟练掌握微生物的厌氧培养方法;观察菌体、菌落形态特征,并测定其生长曲线。
二、 实验原理
厌氧菌在有氧的情况下不能生长。要培养厌氧菌,必须创造一个无氧的环境。通常用培养基中加入还原剂,或用物理、化学方法去除环境中的游离氧,以降低氧化还原电势。 目前培养厌氧微生物的技术包括:亨盖特厌氧滚管技术,厌氧手套箱培养技术,及厌氧罐/袋培养技术。
三、 试剂与器材
1. 器材:普通光学显微镜,需配100倍放大的物镜,恒温培养箱,可见光分光光度计,超
净工作台,制冰机,恒温水浴锅,电磁炉,医用瓷托盘:25cm X 16cm,载玻片(最少每人1张),一次性1ml 注射器(大约300支)1ml 比色皿(玻璃材质即可,每组或每人一个),厌氧管及配套塞子:500支,2.5L 厌氧培养罐:5只,适用于2.5L 厌氧培养罐的厌氧产气袋:1包,每包10只,直径9cm 标准培养皿(最少80只)
2. 试剂:革兰氏染色试剂(应最少可染30张片子),BHI 肉汤(Difco 公司):500克国产
琼脂:500克,75%酒精棉球
四、 实验内容及步骤
以链球菌为例,进行纯度检查,厌氧培养及生长曲线测定。
1. 纯度检查:涂片、革兰氏染色、及显微镜下观察细菌形态及纯度。
2. 接种及厌氧培养:
1)预还原无氧培养基制备(演示):培养基配制;分装,3ml/管;抽气换气法制造厌氧环境:先用真空泵抽成负压99.99kPa (750mmHg ),然后充入无氧氮气,反复4次,最后充入80%N2、10%H2和10%CO2的混合气体;高压蒸汽灭菌。
2)接种及厌氧培养:将过夜培养的链球菌以1:20的比例接种到新鲜的预还原的厌氧培养基中,37℃温箱培养,每隔1小时取1ml 样品,用分光光度计测定其在600nm 处的光吸收
值,记录并绘制生长曲线。
3. Hungate 厌氧滚管
1)实验菌种系列稀释:将实验菌种10倍系列稀释。用无菌注射器吸取1ml 原液至另一支装有9ml 培养基的试管中,制成10-2稀释液。按此操作方法依次进行10倍系列稀释,制成不同浓度的样品稀释液。取适宜稀释度的样品进行厌氧滚管。
2)厌氧滚管: 将预先配制的装有2.7ml 无氧琼脂培养基的试管置于沸水中融化,放置于55℃左右的恒温水浴中,用1ml 无菌注射器分别吸取适宜稀释度的稀释液各0.3ml 于融化了的琼脂培养基试管中,而后将其平放于盛有冰块的盘中迅速滚动,培养基在试管内壁立即凝固成一薄层。
2)37℃温箱培养,24小时后观察并记录菌落形态。
4. 厌氧罐培养
1)实验菌种系列稀释:将实验菌种10倍系列稀释,取适宜稀释度的样品涂布平板。
2)将平板置于厌氧罐中,厌氧罐由透明的聚碳酸酯或不锈钢制成,盖子内侧有金属网状容器,用于装厌氧指示剂美蓝和用铝箔裹封的催化剂钯粉。然后将气体发生袋放入容器密封后,容器内的氧气在0.5~1小时内被完全吸收,同时产生等量的二氧化碳。
3)37℃温箱培养,24小时后观察、记录菌落形态,并计数菌落数目。
实验四 生长谱法选育营养缺陷型菌株(8h )(何秀萍)
一、 实验目的
理解营养缺陷型菌株的选育原理及用途,掌握筛选营养缺陷型菌株的方法。
二、 实验原理
营养缺陷型菌株是指由于基因水平上的变化,使细胞缺失有功能的某种蛋白质(多数为酶),造成代谢途径的阻断,不能合成某种必需的代谢产物,只能在营养丰富的完全培养基或外源添加被阻断合成的物质的基本培养基中正常生长的一类菌株。利用物理、化学或生物学手段使特定代谢途径中关键酶基因发生突变,并结合有效的筛选方法,就可以获得特定的营养缺陷型菌株。营养缺陷型菌株被广泛应用于代谢调控及代谢工程改造中解除反馈抑制,使中间产物或分支途径中终产物大量积累,如氨基酸、维生素、核苷酸等。同时营养缺陷型也是遗传学研究、传统微生物育种技术(细胞杂交和原生质体融合)及基因工程中应用最为广泛的遗传筛选标记。
三、 实验内容及步骤
1、实验材料
(1) 菌种:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
(2) 培养基及试剂
酵母菌完全培养基(YPD):2%葡萄糖、2%蛋白胨、1%酵母粉,溶于蒸馏水,自然pH 。
配置固体培养基需加入1%琼脂粉。8磅灭菌30min ;
酵母菌基本培养基(SC):0.67% (Yeast Nitrogen Base, Difco),1%葡萄糖,溶于蒸馏水,自然
pH 。配置固体培养基需加入1%琼脂粉。8磅灭菌30min ;
其他试剂:0.25 g/L尿嘧啶、1g/L色氨酸、0.35g/L组氨酸、0.3g/L亮氨酸、0.3g/L赖氨酸。
2、方法和步骤
(1) 诱变后菌液处理:诱变后细胞悬浮液进行10倍的梯度稀释,然后涂布在YPD 固体培养
基平板上,30℃温箱培养48 h;
(2) 营养缺陷型突变株的检出:将YPD 平板上长出的单菌落挑到装有1ml 无菌水的小试管
中制成菌悬液,室温静置4 h;分别取一接种环菌悬液点接于SC 和YPD 固体培养基上,30℃温箱培养48 h;在YPD 固体平板上能够生长,在SC 固体平板上不能生长的就是可能的营养缺陷型菌株;
(3) 营养缺陷型的鉴定:通过在基本培养基SC 中补充不同的营养元素,检测细胞生长情况,确定突变菌株具体缺失了那种物质的合成能力。一般先进行大类的鉴定,如氨基酸、核苷酸或维生素等营养缺陷型;然后对大类内部各物质缺陷型进行具体的鉴定。
营养缺陷型大类的鉴定:将可能的营养缺陷型细胞转接到无菌水中,5000 rpm离心5分钟离心收集细胞,用无菌水洗两次,重悬于无菌水中,使细胞浓度约为106个/ml,取1ml 菌悬液,与融化后冷却到45-50℃的15 ml SC固体培养基充分混合,倒入培养皿中,凝固后,将培养皿底部划分为三个区域并做标记,然后在平板里的三个对应区域分别贴上蘸有氨基酸混合液、维生素混合液、碱基混合液的滤纸片,30℃温箱培养48 h,根据在滤纸片周围是否出现微生物生长圈,确定突变株属于哪一大类的营养缺陷型;
营养缺陷型的具体确定(以氨基酸缺陷型为例):按照每次缺少一种氨基酸的策略,制备含有不同氨基酸组合的SC 固体培养基平板;将YPD 斜面上培养的细胞接一环于无菌水中,室温静置4 h ,然后将菌悬液分别对应点于上述不同的固体平板上,30℃温箱培养48 h ,在缺少了某种氨基酸的培养基上不能生长的突变株即为该氨基酸的营养缺陷型菌株。
四、 思考题(可有可无)
在营养缺陷型菌株的检出和鉴定过程中,将细胞接于无菌水中,室温静置4 h的目地是什么?
实验五 乳酸测定及酸乳制备(8h )(钟瑾)
发酵液乳酸含量的测定
乳酸是一种重要的食品添加剂,乳酸钙、乳酸锌、乳酸铁等衍生物是重要的药品;同时,乳酸也是合成新型可降解材料聚乳酸(PLA)的单体物质,因此,乳酸一直受到国内外研究者的广泛关注。现有的乳酸定量测定方法,包括对羟基联苯法、高效液相法、气相色谱法、酶法等。本实验采用特异性好、灵敏度高的对羟基联苯法测定发酵液中乳酸的含量。
一、 实验目的
1. 掌握发酵液中乳酸含量的测定方法。
2. 了解不同样品环境下乳酸含量的测定方法。
二、 实验原理
乳酸在铜离子的催化下,与浓硫酸作用生成乙醛,乙醛能与对羟基联苯作用生成在565 nm 处有特征吸收的紫色物质。在一定浓度范围内,乳酸含量与565 nm 处吸光度呈线性关系,因此可以通过测定565 nm处的吸光度来测定乳酸的含量。
三、 实验内容及步骤
1. 发酵液样品预处理
取适量发酵液样品5000 r/min 离心10 min,以除去菌体和碳酸钙沉淀, 取上清液适当稀释,吸取稀释液2 mL于洁净离心管中,加入2 mL 钨酸溶液,混匀,室温静置,直至溶液中出现明显絮状物,10000 r/min离心10 min,取上清液置于10 mL 洁净离心管中,60℃水浴保温30 min左右,冷却待用。
2. 吸光度测定
精确吸取5 mL待测液于10 mL EP管中,加入0.05 g 氢氧化钙,混匀,然后加入0.8 ml 20%硫酸铜,迅速混匀,沸水浴3 min,水浴冷却,3000 r/min离心5 min,取上清液0.5 mL加入比色管中;加入6 mL 浓硫酸,混匀,沸水浴加热5 min,取出后冰水浴冷却;加入1.5%对羟基联苯溶液0.125 mL,充分混匀,静置15 min;置于沸水浴中加热5 min,冰水浴冷却,以蒸馏水为参比液,在565 nm处测吸收。
3. 标准曲线的制作
0.5 mg/mL乳酸标准液与发酵液同样预处理后,取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL处理液,分别加进8支预先编号的试管,再用蒸馏水补足体积至5 mL,按上述步骤操作,分别测定吸光度。以乳酸含量为横坐标,吸光度为纵坐标作图得到标准曲线。
4. 利用标准曲线所得的回归方程,结合样品的吸光值,计算样品中乳酸的含量。
酸乳的制备
酸乳是以鲜乳为主要原料,经过预处理,然后接种乳酸菌(例如,保加利亚乳杆菌,嗜热链球菌等)作为发酵剂,并保温发酵一定时间,使乳中蛋白质凝结的一种乳制品。酸乳中的蛋白质更易被机体合成细胞时所利用,具有更好的生化可利用性,含有更多的易于吸收的钙质和丰富的维生素,减轻“乳糖不耐受症”;同时,酸乳成品中含有大量的活性微生物,能改善肠道菌群,抑制致病菌的生长繁殖,增强免疫,刺激肠胃蠕动等。
一、 实验目的
1. 学习实验室制作酸乳的方法。
2. 了解酸乳制品质量(酸度和乳酸菌含量)的检测方法。
二、 实验原理
利用乳酸菌发酵牛奶中的乳糖,产生大量的乳酸,使酪蛋白变性凝固,而使整个奶液呈
现凝乳状态。
三、 试剂与器材
1. 器材:天平,恒温水浴锅,恒温培养箱,无菌操作台,灭菌的三角烧瓶(250 mL)
2. 试剂:牛奶,酸乳,蔗糖
四、 实验内容及步骤
1. 将市售牛奶100 mL加到250 mL的三角烧瓶中,再加5 g蔗糖,摇匀,用无菌封口膜封
好瓶口;
2. 三角烧瓶放入80℃的恒温水浴锅中,不时摇动,保持15 min ,然后立即从水浴锅中取
出,用冷水冲洗其外壁,使巴氏消毒奶冷却至45℃;
3. 将市售酸乳按5%-10%接种量,加入上述三角烧瓶中,充分摇匀,盖好封口膜;
4. 将三角烧瓶放于40-42℃的培养箱中发酵6-8 h, 当发酵奶出现凝固状时,停止发酵;
5. 接着将三角烧瓶放在低温(4-6℃)下后熟,持续24 h以上,这样就得到酸乳成品了;
6. 对制备的酸乳进行乳酸菌活菌计数和酸度的测定(略)。
酸乳中乳酸菌活菌计数
一、 实验目的
1. 学习利用稀释涂布平板法对样品中的活菌进行计数。
2. 了解乳酸菌的培养过程。
二、 实验原理
平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的,也就是说一个菌落即代表一个单细胞。计数时,先将待测样品作一系列稀
释,再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中,使其均匀分布于平皿中的培养基内,经培养后,由单个细胞生长繁殖形成菌落,统计菌落数目,即可换算出样品中的含活菌数。
三、 试剂与器材
1. 附:GM17固体培养基配方(1 L)
胰蛋白胨 5 g MgSO4.7H2O 0.25 g
大豆蛋白胨 5 g 琼脂粉 15 g
牛肉膏 5 g 酵母提取物 2.5 g
葡萄糖 5 g β磷酸甘油二钠 19 g
维生素C 0.5 g
四、 实验内容及步骤(需无菌操作)
1. 编号
一个样品,取无菌平皿3个,分别标明10-7、10-8、10-9。另取6支离心管,依次标明-1, -3, -5, -6, -7, -8,分别加入900, 990, 990, 360, 360, 360 μL的生理盐水。(提前一天倒好平板,标号和稀释液预先准备)
2. 重悬及稀释
用移液器精确地吸取酸乳100 μL加入-1号离心管中,另取枪头来回吹吸使其混合均匀。自-1号离心管吸取10 μL放入-3号离心管中,混匀。由-3到-5经同样的操作。接下来的梯度稀释过程如下:即40 μL-5号离心管加入-6号,40 μL-6号离心管加入-7号,40 μL-7号离心管加入-8号中,操作同上。
3. 涂布平板
分别从-6,-7,-8离心管中吸取100 μL菌液,涂布到已倒好培养皿中,涂布均匀,待菌液渗透后,倒置于37℃恒温培养箱中培养。
4. 计数
培养24小时后,取出培养皿,并按下列公式进行计算:
每mL 酸乳中总活菌数= 菌落数 × 稀释倍数 × 100
五、 一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算菌落数最为合适。在这个范围
内,各
实验六 动物病毒的鸡胚培养(8h )(严景华)
一、 实验目的
了解流感病毒在鸡胚尿囊腔中的增殖过程;
掌握流感病接种毒鸡胚的方法和途径及流感病毒收获的方法;
掌握红细胞凝集实验的操作方法及结果判定;
掌握RT-PCR 检测流感病毒的原理和方法
二、 实验原理 鸡胚是正在发育的机体,它的组织分化程度低,许多病毒在鸡胚中都能适应繁殖而且从感染病毒的鸡胚中可以收获大量病毒,此外,鸡胚接种操作简单,现有的鸡胚来源充足且是SPF ,对接种病毒不产生抗性。因此常用来进行病毒的分离、培养以及毒力的测定,中和试验和制备疫苗等。
鸡胚是流感病毒培养和疫苗生产的重要材料。因此,本实验将利用流感病毒为材料学习动物病毒鸡胚培养技术。流感病毒的检测通常采用细胞凝集实验和PT-PCR 的方法。流感病毒颗粒膜蛋白HA 蛋白可以识别和结合宿主细胞表面的含唾液酸的糖蛋白和脂蛋白,鸡血红细胞表面均含有此种蛋白,因此它能够被流感病毒识别并结合发生红细胞凝集现象。流感病
毒8个基因片段5’和3’非编码区都含有一段保守序列,因此可以通过设计通用引物扩增流感病毒基因片段。
1. 尿囊腔接种流感病毒 1.1活胚检查
购买9-11日龄的鸡胚,在使用前进行检查。首先,活胚的血管明显可见;其次,活胚有明显的胎动,尤其在轻轻转动时可见脐带活动;最后,良好的鸡胚可见密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成较明显的界线 。若鸡胚血管模糊甚至不见、胎动不明显或没有、绒毛尿囊膜界限模糊,则可判断鸡胚濒死或已经死亡。
1.2接种
照检后,在胚胎面与气室交界边缘处避开血管做标记。在标记周围用先用2.5%碘酒消毒,再用75%酒精脱碘,在标记以上约1mm 处打孔。用注射器抽取要接种的病毒液,垂直插入约1cm ,注射约0.1-0.2ml 病毒液,用融化的石蜡封口。
1.3后期观察
将接种后的鸡胚置于孵箱中继续培养,每日照检一次。在24小时内死亡的鸡胚为非特异性死亡应弃去。鸡胚在24-72小时内死亡后应及时收取尿囊液。在72小时仍未死亡的鸡胚置于4℃ 6小时或过夜,或者置于-20℃ 1小时,目的是致死鸡胚使血液凝固。
1.4收获
用碘酒消毒,再用75%酒精脱碘。将气室上方的卵壳敲碎并取走,用镊子等按压胚胎同时将尿囊液吸出置于无菌管中,并离心。
2. 血凝检测
2.1实验前准备1% 鸡红细胞悬液:将采取的鸡血(含阿氏液未凝血)转移到离心管中,用PBS 稀释,1500rpm 离心10min ,弃掉上清和白细胞,留取红细胞,重复3次;最后用PBS 配成1% 鸡红细胞悬液,置于4℃;
2.2在96孔血凝板中加入25 μL PBS/孔,在第1列加入25 μL病毒液,混匀,吸取25 μL混合液加入到第2列中,混匀,以此类推,倍比稀释病毒液。稀释到倒数第2列时,混匀弃掉25 μL混合液。最后一列作为阴性对照,不做任何处理;
2.3每孔加入25 μL 1%鸡红血细胞。相混后置于室温,25-30 min时观察血细胞的凝集情况。一般来说,将血凝板直立,若血红细胞呈泪滴状流下说明无病毒,若血细胞弥散在整个孔中则有病毒。
3. RT-PCR 检测流感病毒
3.1病毒RNA 提取
取100ul 鸡胚扩增的流感病毒,按试剂盒说明书( QIAamp Viral RNA Mini Kit)提取病毒RNA 。
3.2反转录
取5ul RNA,70℃ 5分钟,冰浴2分钟。按试剂盒( Reverse Transcription System,Promega )说明书配制反应体系,室温放置10min ,42℃反应1小时。
3.3 PCR
取1ul 反转录cDNA 做模板,加入M 基因通用引物,进行PCR 扩增。扩增条件:预变性95℃ 5min ,循环参数:94℃ 1min, 55℃ 1min, 72 2min, 30循环。
3.4 PCR产物鉴定
取10ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1% 琼脂糖凝胶)。凝胶成像仪观察结果。
实验七 固定化枯草芽孢杆菌连续发酵生产α淀粉酶(8h )(钞亚鹏)
一、 实验目的
了解固定化细胞和固定化酶的基本原理和方法;掌握运用物理包埋法固定枯草芽孢杆菌的技术以及连续生产α-淀粉酶的实验过程。
二、 实验原理
聚乙烯醇/海藻酸钠/细胞混合溶液在氯化钙/硼酸混合液中可以形成不同粒度的球形颗粒,这种颗粒有一定的硬度、韧度和孔径。同时具有生理活性的细胞被固定在这些颗粒里。当给予适当的生长或反应条件时,细胞可以不断的分泌人们所需的蛋白、酶、以及各种代谢物,或者将外源底物催化转化成目的产物。在反应结束后,固定化细胞可以方便的从反应体系中分离出来,经过适当的处理后用于下轮反应。固定化细胞最大的特点是高效性和可以重复使用。
三、 试剂与器材
1. 器材:超净工作台、培养箱、分析天平、灭菌锅、微波炉,磁力搅拌器,磁转子,分光光度计,水浴锅。500ml 三角瓶10个,250ml 三角瓶1个,小试管约50支、大试管10支、10μl , 100μl 、200μl ,1ml ,5ml 移液枪各一支及其相配套的枪头盒,1000ml 烧杯5个,药匙3个,500mL 量筒1个,棕色瓶1个,带盖试剂瓶1个,洗瓶1个,注射器,比色皿3个。
2. 试剂:聚乙烯醇,海藻酸钠,氯化钙,硼酸,可溶性淀粉,浓盐酸,碘化钾,碘
四、 实验内容及步骤
1. 枯草芽孢杆菌发酵培养及菌体收集
在牛肉汁斜面上划线活化枯草芽孢杆菌一次。然后将斜面种子接种于牛肉汁液体培养基(500ml 摇瓶装液量100ml ,共10瓶),37oC 振荡培养过夜。离心收集菌体(6000r/min, 15min ),用生理盐水洗涤1次,后将细胞悬浮于50ml 生理盐水中。
2. 固定化细胞过程
10%聚乙烯醇+1%海藻酸钠溶液50ml ,加入5ml 处理好的菌悬液(载体:菌悬液=10:
1),混匀,温度控制在40℃左右,然后用注射器滴加到冷却的含有2%氯化钙和4%硼酸溶液中,边滴加边搅拌,室温交联4小时,4℃下硬化16-20小时,取出用无菌水洗涤后待用。
3. 利用固定化细胞发酵生产α淀粉酶
取适量的固定化细胞颗粒置于500ml 摇瓶中,加入100ml 新鲜无菌的牛肉汁培养基,37oC 振荡培养2h 以上,取上清液测定淀粉酶活性。
4. 淀粉酶水解活性测定方法:
预先配制0.1mol/L HCl溶液和0.1mol/L I2液:
0.1mol/L HCl溶液:取4.95mL 的浓盐酸,加水定容到500mL ,放入试剂瓶中保存 0.1mol/L I2 液:称取6.5g 碘及17.5g 碘化钾,溶于少量水中,然后移入500mL 棕色试剂瓶中,加水稀释至500mL ,用磁力搅拌器搅匀。用时稀释100倍。
配制质量分数0.25%(w/v)的可溶性淀粉溶液,煮沸。将各试管标号,先向各试管中分别加入0.4mL 0.25%可溶性淀粉溶液,然后于40℃恒温水浴预热15min 。然后向各试管中加入0.1mL 适度稀释的酶液(用蒸馏水稀释),对照组在加酶之前先加入0.1 mol/L HCl 溶液
1.5mL ,混匀,然后置于40℃恒温水浴反应10 min。反应10min 后,取出各试管,立即向实验组补加1.5 mL 0.1mol/L HCl 溶液,然后向各试管中均加入3 mL 1mmol/L I 2 液及5 mL 蒸馏水,混匀,迅速于700 nm处测定OD 值,用蒸馏水作为空白调零,记录数据。
在上述条件下定义,以每分钟降低10%吸光度所需的酶量定义为1个酶活力单位。
按以下公式计算酶活:酶活单位(U/mL)=(a-b)/a×100×酶液稀释倍数 式中:a 为对照组的吸光值,b 为实验组的吸光值;
五、 思考题(可有可无)
固定化酶技术大体有哪几种?在新型微加工技术不断发展的今天,固定化酶的技术、固定化酶颗粒尺度、固定化酶的性能有何新的进展?
实验八 实验结果总结、分析(4h )(全体老师)
主要参考书:
1、赵斌、何绍江《微生物学实验》科学出版社 2002年
2、沈萍、范秀容、李广武《微生物学实验》第三版 高等教育出版社 1999年
3、钱存柔、黄仪秀《微生物学实验教程》北京大学出版社 1999年
4、黄秀梨 《微生物学实验指导》高等教育出版社 1999年
教学方式:实验室讲解,实验
考核方式:实验报告
撰写人:(国科大生命科学学院)刘利新
撰写日期:2011年11月
修改日期:2012年12月(全体授课教师)
范文四:实验 微生物接种技术
实验 微生物接种技术
一、目的:
学习微生物工作的基本接种方法,建立纯培养技术中的“无菌”概念,掌握无菌操作技术。
二、原理:
所谓接种就是将一定量的纯种微生物在无菌操作条件下转移到另一已灭菌,并适宜于该菌生长繁殖所需的培养基上的过程。本实验要求严格进行无菌操作,一般是在无菌操作台或在实验室内火焰旁进行。根据不同的实验目的和培养方式,可以采用不同的接种工具和接种方法。
三、实验材料:
斜面培养基、液体培养基、平板培养基、记号笔、酒精灯、接种针、消毒酒精、涂布棒等。
四、操作步骤
(一)无菌操作
菌种分离或移接工作应在无菌环境中进行,接种室、接种箱或超净工作台是常用的接种环境。用前先清洁好卫生,再进行消毒处理。可用紫外线灯和甲醛熏蒸的双重作用,或用3%来苏尔及其他表面消毒进行喷雾。
操作者的手应先用肥皂洗净,再用酒精棉球消毒;整个操作过程都要靠近酒精灯火焰;接种工具在用前和用后必须在灯焰上灭菌;棉塞不得乱放,操作中只能夹在手上;不能有跑、跳等力度大的动作,以免引起空气大振动而增加染菌机会。
(二)接种方法
(1)斜面接种:
从已长好微生物的菌种管移接到另一斜面管的方法。此法用于好气性微生物的接种。
左手持菌种管和斜面管,使斜面向上,并尽量放平。用右手先将棉塞拧转松动,再拿接种环,用右手的小指、无名指和手掌拨下棉塞并夹紧,同时将管口在火焰上燃烧一圈,接种环灼烧灭菌后插入管内,冷却、挑菌,立即转入斜面管底部,沿斜面划曲线或直线。
图1. 斜面接种示意图
(2)液体接种:
由斜面菌接种到液体培养基(如试管或三角瓶等)中的方法。
操作与上法基本一致,只是在将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦,使菌体分散,然后塞上棉塞,再轻轻摇动均匀,即可培养。 如果菌种是培养在液体培养基中时,一般用移液管或滴管接种。
(3)穿刺接种:
用接种针挑取菌种后,插入深层固体培养基内,(不要刺到底部),再沿原路拔出,此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。
(4)平板接种:
将菌种接至培养皿的方法,平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种,活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法,可分为下面几种:
1)斜面接平板
a.划线法:见平板划线分离法。
b.点种法:一般用于观察霉菌和酵母细胞,轻轻点在平板的表面(根霉点一点,曲霉、酵母可点3-4点)即可。
2)平板接斜面:一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面,以便作鉴定或扩大培养、保存之用。
五、 思考题
1.何谓无菌操作?接种前应作哪些准备工作?
2.总结几种接种方法的要点及应注意的事项?
范文五:微生物初筛实验技术
本书内容包括:酶产生菌的初筛,有机酸产生菌的初筛,抗生素产生菌的初筛,其它类型微生物的初筛。
章节目录
目 录
第一章酶产生菌的初筛
一、蛋白水解酶
二、淀粉水解酶
三、纤维素水解酶
四、核酸水解酶
五、碱性脂肪酶
六、磷酸酯酶
七,细胞壁溶解酶
八、柠檬酸合成酶
九、柠檬酸裂解酶
十、鸟氨酸脱羧酶
十一、赖氨酸脱羧酶
十二、右旋糖酐酶
十三、β(1→3)葡聚糖酶
十四、胶原酶
十五、果胶酶
第二章有机酸产生菌的初筛
一、乳酸
二、醋酸
三、柠檬酸
四、衣康酸
五、氨基酸
六、核苷酸
第三章抗生素产生菌的初筛
一、常规筛选方法
二、选择性筛选法
三、抗生素效价测定
第四章 其它类型微生物的初筛
一、呼吸缺陷型突变菌株的初筛
二、水解水不溶碳氢化合物的初筛
三、分解聚氯联二苯的细菌的初筛
四、泡沫减少的酵母突变体的初筛
五、黄曲霉素产生菌的快速鉴定
六、大肠杆菌的简易检出法
七、厌氧菌及其培养、快速鉴别法
八、具有抗污染特性的啤酒酵母的选育
九、葡萄酒、清酒酿造中野生酵母的快速检出法
十、嗜杀酵母(killer yeast)及其快速检出法
十一、营养缺陷型菌株的筛选
十二、噬菌体的分离、纯化及其效价的测定
十三、抗结构类似物突变菌株的筛选
十四、葡萄酒酵母的筛选及其存活力的快速测定
附录
一、常用缓冲液的配制
二、指示剂的配制
主要参考文献