范文一:原生质体融合技术
原生质体融合技术的局限性
植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下,还可形成细胞壁,进行有丝分裂,形成愈伤组织和诱发再生植株,因而仍然具有细胞的全能性。
植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果,在原生质体分离培养的基础上建立起来的,以植物的原生质体为材料,通过物理、化学等因素的诱导,使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合,而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合,是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起,与有性杂交相比,无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大,不但可以利用细胞核内基因资源,还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。
原生质体培养是细胞杂交的基础,但是直到目前为止,也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株,大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难,或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中,茄科占了将近1/4,并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此,为了有效地进行植物遗传改良,不但要使杂种细胞再生成完整植物,而且还必须提高植株再生的频率,以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低,重复性较差,并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中,还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。
1.技术局限性
植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体,在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性,因此融合之后的杂种细胞,可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此,细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节:诱导融合;选择融合体或杂种细胞;杂种植株的再生和鉴定。
1.1诱导原生质体融合
诱导原生质体融合是体细胞杂交的最基本的技术环节。融合方法的选择受到很多实验条件的限制。常用的化学方法有化学方法与电融合方法。化学方法中用的最多的是聚已二醇(PEG)融合技术。但是这种方法中PEG与高PH强加于原生质体的非常生理条件,PEG的相对分子质量、纯度、浓度、处理时间、原生质体的状况和密度等都会影响PEG融合技术,而且其融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害作用;而影响电融合的因素有电融合技术中交流电的强弱、处理时间的长短、电脉冲的大小电极的材料和间距、直流脉冲的强度、宽幅以及次数等。
而且对于不同的植物材料需要经过多次实验,才能找出这些参数的适当值。这就制约了原生质体融合技术成为常规育种方法。
1.2杂种细胞的选择
为了将杂种细胞与未融合的、同源融合的亲本细胞区分开,一般有以下选择方法:
1.2.1利用或诱导各种缺陷型或抗性细胞系,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来; 互补选择一般要求有相应的突变体。在体细胞杂交的研究中,虽然人们已经建立和利用了各种各样的突变体,但是在植物中要建立突变细胞系比较困难,如果要使突变细胞系保持再生能力就更难了,因此在实际应用中受到很大的限制。
1.2.2机械选择法
利用荧光素标记分离杂种细胞取得了一定的成效,但是显微镜操作费工费时,选择出异
核体的量很少,而且获得的杂种细胞必须进行单细胞培养,所用实验材料的原生质体必须具有单细胞培养再生植株的能力,因此这种方法具有一定的局限性,要获得大量的杂种植株比较困难;应用荧光激活细胞分选仪自动分离杂种细胞,但是由于仪器比较昂贵,目前采用的人还是不多。
1.2.3组织培养筛选法
人为地造成细胞生长或分化能力的差异进行选择。
但是这三种方法的利用都有一定的局限性,应视不同的情况选择使用。
2.理论局限性
体细胞杂交与有性杂交不一样,除了涉及双亲的细胞核外,还涉及了双亲的细胞质。它不仅可以使双亲的细胞核发生基因重组,还可以使双亲的细胞质中的叶绿体基因组和线粒体基因组重新组合。还可以为遗传育种提供新的材料和资源,但同时又带来了较为复杂的关系。应用体细胞杂交技术可以克服部分远缘组合间的不亲和,但尚不能从根本上解决此问题,虽然可以诱导任何两个物种间的原生质体融合,然而,目前获得的体细胞杂种植株仍限于少数物种。
另外,由于难以控制供体和受体基因组有丝分裂和减数分裂中的重组行为,因此,转移期望基因和形状的概率较小。这是限制目前体细胞杂交技术在育种实践中应用的一个主要障碍。在基因重组过程中还有可能整合一些不需要的基因或缺失一些有益基因,从而造成所获得的杂种材料产生较大的遗传变异而难以应用于育种实践。体细胞杂交在改良作物的育种实践中曾经对它的应用潜力估计过高,实践证明并非像人们想象的那么简单,要获得期望的体细胞杂种植物难度仍然较大。
体细胞杂种难以应用于育种实践中的另一个问题是大多数种间体细胞杂种不育,或育性较低,或花粉活力较低。除了那些无性繁殖作物之外,不育的体细胞杂种植株很难应用到育种实践中,以为一般体细胞杂种植物是通过回交的办法来逐渐减少供体基因的成分,保留所期望的基因或形状,从而达到改良作物的目的。体细胞杂交作为一种育种途径,还必须与常规育种技术相结合,才能作为作物遗传改良作出更大的贡献。
范文二:原生质体融合技术及其应用
摘要:原生质体融合技术作为一种重要的技术在微生物遗传育种上广泛的应用,本文从多角度全方位的对原生质体融合术应用进行详尽的解析,为该项生物技术的应用积累了宝贵的经验。
关键词:原生质体融合应用前景遗传
1原生质体融合技术简介
原生质体融合就是用水解酶除去遗传物质转移的最大障碍―――细胞壁,释放出只有原生质膜包被着的球状原生质体,然后用物理或化学方法诱导遗传特性不同的两亲本原生质体融合,经染色体交换、重组而达到杂交的目的,经筛选获得集双亲优良性状于一体的稳定融合子。原生质体融合与常规杂交相比有多方面的优势,除了能显著提高重组频率外,还具有定向育种的含义。此项技术能把亲缘关系比较远,甚至毫无关系的生物体细胞融合在一起,为远缘杂交架起了桥梁,是改造细胞遗传物质的有力手段,它不仅在于打破了有性杂交重组基因创造新种的界限,更重要的是扩大了遗传物质的重组范围。微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生【1】。
2原生质体融合技术详解
2?1原生质体的制备与再生技术
微生物细胞一般是有细胞壁的,进行该项技术的第一步就是制备原生质体。当前去除细胞壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法。采用前两种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于某些特定菌株,因此,并未得到推广。在实际工作中,最有效和最常用的是酶法。该法时间短效果好。使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体形成的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长期或生长中后期的菌,也有的采用生长后期的,这主要是由于对数生长期细菌的壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感,但是对数生长早期的菌相对较为脆弱,受酶的过度作用会影响原生质体的再生率。彭智华[2]等对野生大杯蕈(Clitocybemaxima)进行原生质体制备的过程中,用2种以上的酶液混合使用能提高去壁效果。陈海昌[3]等证明,在一定范围内,酶作用的时间、酶作用的浓度都与原生质体的形成率成正相关,而与再生率成反相关。林红雨等采用酶解10min后补加EDTA的方法,改变酶解环境中的离子强度和渗透压,可以提高原生质体形成率。Coster-on J?W?等(1967)报道,在高渗Tris溶液中添加115%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生质体扩张剂,有助于制备原生质体,添加0?02mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。
2?2原生质体融合的促融方法
由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,所以在实际育种过程中要采用一定的方法进行人为地促融合。当前常用的方法主要有:化学法、物理法和生物法等。这几种方法各有其自身的特点,在进行实际工作中可根据操作对象选择适合的融合方法。
2?3遗传标记的选择与融合子的检出
假设用于原生质体融合实验两亲本的基因型分别为A和B型,那么经诱导融合,整个群体中含有五种类型: A,AA,AB, BB, B。其中只有AB型才有可能形成真正的杂种细胞,而其余四种类型必须淘汰。所以考虑采用一种行之有效的筛选方法是原生质体融合实验里至关紧要的一环。下面介绍几种常用的筛选方法。
2?3?1利用营养缺陷型作为遗传标记选择融合子
即融合的双亲为营养缺陷型,并且为不同的缺陷型。双亲缺陷的原生质体融合后于基本培养基上选择融合子,缺陷的单亲原生质体由于丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能萌发生长,单亲融合的原生质体也不能长出菌落,双亲原生质体融合后,缺陷的遗传物质得到互补可以恢复为野生型,在基本培养基上能够萌发生长成为菌落。
2?3?2利用抗药性作为遗传标记选择融合子
微生物的抗药性是其菌种的特性,是由遗传物质决定的。不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异或与菌种其它特性结合起来即可对融合子进行选择。这种方法首先由Bradshaw和Peberdy于1984年使用。药物的浓度过高会使融合频率降低,浓度过低则会使亲本生长,影响融合子的检出。
3原生质体融合技术在选育微生物中的应用
3?1选育优良的菌种
原生质体融合广泛应用到酿酒酵母的改良。彭帮柱等以酿酒酵母1605和苹果酒酵母E2为亲本,通过原生质体融合,得到融合子8#菌株,具有产香能力和发酵能力均强于双亲的优点。黎永学等以双歧杆菌和酿酒酵母为亲本进行融合,得到的融合子具有双亲的生物学特性,为双歧杆菌生物学功能的开发提供了新思路、新途径。王宪等利用原生质体融合技术获得具有双亲杀虫谱的新菌株。诸如此类的报道国内外均有。
3?2选育抗菌素高产菌株
在抗生素的研究中,原生质体融合技术可用于提高抗生素的产量。但是,种间融合获得的融合子菌株往往会产生一些不希望有的组分。为了解决这一问题,张瑾阳等在进行去甲基金霉素产生菌与金霉素产生菌原生质体融合以选育产去甲基金霉素的菌株时,对金霉素产生菌的原生质体进行热灭活,减少了既产生金霉素和四环素又产生去甲基产物的融合子。结果在所得的融合子中85%以上只产生去甲基产物,从而提高了目的产物的相对产量。
4结论
原生质体融合技术为遗传操纵、分子生物学和基础理论研究提供了一种重要工具,也为遗传育种提供了一种有效手段,已广泛应用于微生物育种工作的各个方面。近年来,灭活原生质体融合、离子束细胞融合、非对称细胞融合以及基因重排分子育种等新方法相继提出并应用于微生物育种,这是原生质体融合技术的新发展。相信随着技术的不断完善,原生质体融合在生物育种中占有的地位会越来越重要。原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益,已是举世瞩目,它已成为高新技术开发的重要领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。
参考文献:
[1]李铁,刘瑞华?应用双亲株灭活原生质体融合法选育林可霉素高产菌株[J] ?上海医药,2002,12(23):23-26
[2]洪云,姜波?遗传操纵法[J] ?国外科技动态,1995,04(21):45-52
[3] 郑素月,张金霞?酯酶同工酶标记在平菇杂交种鉴别中的应用研究[J ] ?中国种业,2005,03(19):21-24
范文三:原生质体融合技术文献综述
XXXX学校XXXXXX学院
毕业设计(论文)文献综述
学生姓名: 学号:
专 业: 生物工程
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2010年 月 日
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摘要:原生质体融合技术是细菌遗传育种的有效方法之一,发展迅速,应用广泛.文中综述了亲本菌株选择性遗传标记方法、影响原生质体制备与再生因素、原生质体融合方法和条件。介绍了原生质体融合技术在微生物遗传育种中的应用,并展望了原生质体融合技术的发展前景。
关键词: 原生质体融合 种间融合 选育
原生质体融合也称细胞杂交、细胞融合或体细胞杂交,是指细胞通过介导引言:
和培养,在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合成一个核或多核的杂合细胞的过程[1]。原生质体融合技术起源于20世纪60年代。1960年法国的Karski研究小组在两种不同类型的动物细胞混合培养中发现了自发融合现象。1974年匈牙利的Ferenczy L等[2]采用离心力诱导的方法,报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合,从而使原生质体融合技术成为微生物育种的一项新技术,并从微生物种内融合扩展到界间的融合。路玲玲等[3]采用融合技术成功构建耐高温高产酒精酵母,至此,原生质体融合技术成为工业菌株改良的重要手段之一。原生质体融合技术已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大[4]。
1 原生质体融合技术
微生物原生质体融合技术的整个过程包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生[5]。
1.1 原生质体制备与再生过程中的影响因素
制备原生质体的最大障碍就是细胞壁,现在去除细胞壁的主要方法是使用酶法,使用的酶主要为蜗牛酶或溶菌酶,具体根据所用微生物的种类而定。影响原生质体制备的因素很多,不同的微生物有其较为适当的形成条件。在菌龄选择上,多采用对数生长中后期的细菌,这主要是由于对数生长期细菌的细胞壁中肽聚糖含量最低,细胞壁对酶的作用最敏感。王燕[6]对双亲灭活米曲霉进行原生质体制备的过程中,用纤维素酶、溶壁酶、蜗牛酶混合浓度为5?3?1的酶液混合使用能提高去壁效果。使用微生物产生的酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好,在一定范围内,酶作用的时间和酶作用的浓度都与原生质体的形成
率成正相关,而与再生率成反相关。另外,EDTA作为螯合剂,可以避免金属离子对酶的抑制作用而提高酶脱壁效果,从而提高原生质体的形成率。据报道,对大肠埃希菌来说,用EDTA洗涤后,可以除去对酶解不利的金属离子[7]。另一方面,在原生质体制备前,用适量的青霉素对菌体进行预处理,可以抑制肽聚糖合成过程中的转肽作用,有利于原生质体的形成。根据酶反应动力学原理,酶解温度直接影响酶促反应的速度,如放线菌的最适酶解温度为28?~37?,真菌的最适酶解温度为30?~35?[8]。在高渗Tris溶液中添加15 mL/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等原生质体扩张剂,有利于溶液中细菌的分散,有助于制备原生质体,添加0.02 mol/L镁离子,有利于原生质体的稳定。关于原生质体的再生,吴孔兴等[9]报道在原生质体高渗再生培养基中加入0.3 mol/L的蔗糖和0.2 mol/L的丁二酸钠是合适的,王玉华等[10]报道在高渗再生培养基中加入0.5 mol/L的蔗糖是适宜的,这可能要根据不同的微生物种类而定。
1.2 原生质体融合过程中的影响因素
1974年,匈牙利的Ferenczy报道了离心力诱导法对白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合。随后人们相继用NaCl、KCl和Ca(NO3)2等作为诱变剂进行融合,但融合频率都很低。聚乙二醇在适量Ca2+存在下能有效地诱导植物原生质体融合,Ca2+主要是通过维持膜结构的完整性来实现原生质体的稳定性与活性。原生质体膜外在蛋白上二价阳离子的存在使膜脂流动性减慢、稳定性增强,这种维持稳定性的效果大小与膜表面分子数量的多少呈正比例关系,PEG种类对原生质体融合的影响不大。此外,其融合率还受其他诸因素的影响。影响原生质体融合的因素很多,特别是环境中的阳离子存在,融合时的pH也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲Ca2+、Mg2+有助于融合。如有0.01 mol/LCa2+存在时,可得到较高的融合率,但在缺乏钙离子时,若pH较低,融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用,使原生质体带电,彼此易于附着发生凝集所致[11]。
2 原生质体融合的方法
2.1 PEG结合高Ca2+诱导法
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子质量常为1 ku~1.5 ku,也有人使用0.4 ku~6 ku,真菌一般采用4 ku~6 ku,细菌用1.5 ku~6 ku。亲本原生质体制备好后,即可进行 融合。关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到
两个原生质体全部融合。
2.2 电融合
原生质体电融合起始于20世纪80年代的细胞改良新技术。陈合等[12]报道了电融合的方法,将白芝和赤芝两种大型真菌原生质体成功进行了融合,这一技术将电学与生物化学恰当结合,产生了缓和而高频率的原生质体融合效果。其原理是在短时间强电场的作用下,细胞膜发生可逆性电击穿,瞬时失去其高电阻和低通透性,然后在数分钟内恢复原状,当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时,即可诱导它们的膜相互融合,从而导致细胞融合。近年来,该技术在微生物中的应用日渐增多。
2.3 激光诱导融合
1987年始,激光诱导融合技术迅速发展起来,并很快被应用在动物细胞及植物原生质体的融合中。激光融合是让细胞或原生质体先紧密贴在一起,再用高峰值功率密度激光对接触处进行照射,使质膜被击穿或产生微米级的微孔。由于质膜上产生微孔是可逆过程,质膜在恢复过程中细胞连接小孔的表面曲率很高,处于高张力状态,细胞逐渐由哑铃形变为圆球状时,说明细胞已融合了。该技术最突出的优点在于它的高度选择性,利用激光微束技术可诱导许多细胞中所需的两个相邻细胞融合。但由于其所需设备昂贵复杂,操作技术难度大,很难推广应用。此后,虽有研究者试图以类似原理及较简便的步骤,在微生物原生质体融合中应用激光微束技术[13],但融合效率较低,且丧失了高度选择性的优点。激光诱导融合技术仍处在发展初期,还有待进一步完善。
2.4 基于微流控芯片的细胞融合技术
随着微机电系统(MEMS)技术和微加工技术的发展,微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟,加之微通道网络可以整合到生物芯片之上,这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台,利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。Strum-berg A等[14]已经在微流控系统中实现了单个成对细胞的融合。证明了利用微流控技术使细胞之间可以实现可控融合,利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控,也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞,细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此 外,由于在微通道内的腔体容积很小,所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量,同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。
2.5 高通量细胞融合芯片
高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在细胞融合芯片的微米范围内(10μm~40μm)产生的高强度高梯度辐射电场,使得细胞融合芯片中的细胞在此特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力,精确处理和刺激预定的细胞目标,从而使目标细胞按照预先设计的方向以预定的速度移动,从而可以按照设计要求准确地大
批量地得到目标细胞配型,集成微电极阵列的微流控系统,可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。该方法的优点是可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合,比如在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率[15]。此外,二价阳离子(如Ca2+)以及蛋白酶对细胞的预处理,融合率也可大幅提高。然而,截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇论文报道。 3 原生质体融合所得融合子的筛选方法
3.1 利用营养缺陷型标记筛选融合子
这种方法的原则是将亲本菌株诱变处理后,产生对某些营养物质合成途径受阻的突变株,在分离培养基上只有融合子生长而不能让突变的双亲本原生质体形成菌落。融合的双亲带有不同营养缺陷型标记,原生质体融合处理后的混合物直接分离到基本培养基上就可检出融合子。其原理是因为缺陷型的双亲由于丧失了合成某种营养物质的能力,它们在基本培养基上不能生长、繁殖,同一亲本原生质体融合也不能在基本培养基上形成菌落,只有不同亲本原生质体融合后,缺陷的营养物质得到互补才能恢复为野生型在基本培养基上萌发生长形成菌落。高玉荣等[16]报道,通过发酵性能好的长城葡萄酒酵母单倍体L13(Lys-,赖氨酸缺陷型)的原生质体与灭活的降酸能力强的粟酒裂殖酵母1685(Ino-,肌 醇缺陷型)的原生质体进行融合,其试验方法就是依据这种原理来进行筛选的。 3.2 利用抗药性标记筛选融合子
Bradshaw等1984年首先用这种方法检出了融合子。微生物的抗药性是菌种的重要特性,是由遗传物质决定的,不同种的微生物对某一种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行选择。分别选择耐药菌株各1株,其应符合1株对A药敏感、B药抗性;另1株对B药敏感、A药抗性的条件。试验菌株选择好后进一步强化诱导,稳定其抗药性。在含有A、B两种药物的高渗再生平板上就可以把所需要的融合子检出。李晓霞等[17]利用两种兔源肠致病性菌原生质体融合的耐药性遗传标记选择,刘玲等[18]对康宁木霉和白腐真菌原生质体融合都是利用抗药性来筛选融合子的。
3.3 利用荧光染色法筛选融合子
荧光染色法是在酶解制备原生质体时事先向酶解液中加入荧光色素(如DAPI,FTTC)标记,使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素。带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具有再生能力,然后在显微操作器和荧光显微镜下,挑取同时带有双亲原生质体荧光标记的融合子,直接分离到高渗再生培养基上再生,最后得到融合子。原生质体融合处理后,在荧光显微镜下观察并通过显微操作,直接挑选出带有两种荧光的原生质体。成亚利等[19]以金针菇为材料,经异硫氰酸荧光素标记的金针菇单核W19菌株的原生质体与未经标记的单核Y7菌株的原生质体在聚乙二醇的诱导下进行融合,得到融合菌株。
3.4 利用灭活原生质体标记筛选融合子
这项技术的原理是在原生质体融合之前,对单亲或双亲原生质体进行灭活,使其丧失再生的能力,当与另一亲株融合后,代谢上得到互补,能够存活。在这个系统中,被灭活的原生质体实际上起了遗传物质的载体作用。由于灭活原生质体融合减少了寻找稳定遗传标记的繁琐工作及由此可能带来的亲株优良性状的丢失,因此是获得遗传重组的一条有利途径,而且在不利用选择培养基的情况下即可减少亲株的生长,从而提高了筛选效率。周东坡等[20]通过紫外线照射灭活原生质体融合选育了啤酒酵母新菌株。用1 g/L碘乙酸,30?处理产朊假丝酵母原生质体40 min后,与啤酒酵母的原生质体融合,利用形态差异选择融合子。 3.5 利用双亲对碳源利用不同而检出融合子
利用亲株对各种碳源利用差异,结合其他特性分离筛选融合子。如酿酒酵母89-1为呼吸完整,不能利用木糖,对放线菌酮敏感。另一亲株能利用木糖,经诱变剂处理,挑选失去线粒体的呼吸缺陷型菌株,抗20μg/mL放线菌酮。双亲的原生质体融合后,在含有木糖和20μg/mL放线菌酮的选择培养基上生长。因为双亲原生质体都不能生长,只有双亲遗传物质重组后才能在选择培养基上萌发生长, 从而被选择出来。此法适应的种类范围相对较小。
3.6 利用某些特殊生理特征作为标记选择融合子
如圆褐固氮菌可以在无氮培养基上生长,可以与另外一种菌的抗药性标记联合使用在无氮培养基上来筛选他们的融合子。光合细菌可以在无碳源的 培养基上生长,可以与另外的标记联合使用在无碳培养基上来筛选其融合子。 3.7 利用生化测定指标选择融合子
通常测定的生化项目有DNA含量、氨基酸含量、酸性磷酸酶、同工酶和电泳等。DNA含量的测定有两种方法:一是提取DNA后,以紫外分光光度计测定其含量;二是直接以显微分光光度计测定孢子或菌丝的DNA含量,一般来说,融合子的DNA含量高于任何一个亲本的博莱霉素(IJK)含量,但却少于双亲DNA含量之和。一般情况下,比较融合子与双亲氨基酸含量百分比,电泳测定亲本和融合子酸性磷酸酶同工酶和酯酶同工酶酶谱,两者的酶谱存在着一定的差异。常被用作非人工标记鉴别融合子的辅助性方法。
4 前景及展望
原生质体融合技术在生产实践中的应用产生的效益,已是举世瞩目,它已成为高新技术开发的重要领域。该技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制理念等领域的研究提供了有力的手段,而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农 业等方面都有广泛的应用价值。通过原生质体融合进行细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一。在兽医预防科学领域也已有原生质体融合的研究,主要目
的是为了把不同免疫原性的菌株集中于同一菌株上,对血清型多而又无交叉免疫
保护的病原菌研制多价疫苗时,有利于提高疫苗中单因子的单位抗原含量,达到
提高免疫效果的目的。如于凤刚等研究禽巴氏杆菌双型融合株、禽巴氏杆菌与大
肠埃希菌的双型融合株、禽大肠埃希菌双型融合株等。目前所进行的关于原生质
体融合的研究仅局限于两个菌株之间的融合,没有扩展到3个以上菌株之间的融
合,如果我们能够开展多个菌株之间的融合,则有可能获得同时具有多个优良性
状的菌株,进一步拓宽这一技术的应用领域。
参考文献:
[1] 赵志强,郑小林,张思杰,等.细胞融合技术[J].生物学通报,2005,40(10):40-41. [2] Ferencezy L,Kevei F,Zsolt J.Fusion of fungal Protoplast[J].Nature,1974,248:793-794.
[3] 路玲玲,王 敏,朱会霞,等.原生质体融合构建耐高温高产酒精酵母[J].食品科
学,2007,28(4):231-236.
[4] 霍乃蕊,韩克光.细胞融合技术的发展及应用[J].激光生物学
报,2006,15(2):209-213.
[5] 朱河水,刘记强,杨国宇,等.原生质体融合技术的应用[J].安徽农业科
学,2007,35(5):1312-1326.
[6] 王 燕.双亲灭活米曲霉原生质体融合中原生质体制备的研究[J].中国酿
造,2007,(5):19-21.
[7] Minghua D,Sara Z,Thomas R,et al.Visualization of protoplastfusion and
quantitation of recombination in fused protoplasts ofauxotrophic strains ofEscherichia
coli[J]. Metabolic Engi-neering,2005,(7):45-52. [8] 谭文辉,李燕萍,许 杨.微生物原生质体制备及再生的影响因素[J].现代食品
科技,2006,22(3):263-265.
[9] 吴孔兴,黄青云,丘家军.禽巴氏杆菌大肠杆菌融合二联弱毒菌株F4的培育[J].
华南农业大学学报,2002,23(1):67-70.
[10] 王玉华,张桂荣,刘景圣.原生质体融合提高嗜酸乳杆菌耐酸及耐胆盐能力[J].
食品科学,2006,27(3):96-99.
[11] 王娟娟,贾彦军.微生物原生质体融合方法的综述[J].畜牧兽医科技信
息,2005, (10):17-19.
[12] 陈 合,胡云红,秦俊哲,等.灵芝菌原生质体融合条件研究[J].食品科
学,2007,28(2):173-176.
[13] 陈五岭,罗 雯,姚胜利,等.氦氖激光对链霉菌原生质体种间融合频率的影
响[J].光子学报,1998,27(5):412-417.
[14] Strumberg A,Karlsson A,Ryttsen F,et al.Microfluidic devicefor combinatorial
fusion of liposomes and cells [M]. AnalChem,2001:126-130. [15] Lee S,Choi J,Kim Y.Analysis and experimental investigationof
dielectrophoretic force in a planar electrode structure[M].Micromech
Microeng,1996:66-68.
[16] 高玉荣,李大鹏,高年发.利用单灭活原生质体融合技术选育降酸能力强的葡萄酒酵母[J].中国食品学报,2006,6(3):106-109. [17] 李晓霞,邱玉玉,柴同杰,等.两种兔源肠致病性菌原生质体融合的耐药性遗传标记选择[J].家畜生态学报,2006,27(6):59-62. [18] 刘 玲,叶 博,刘长江.原生质体融合亲本菌株抗药性标记的筛选[J].江苏农业科学,2007,(3):225-227.
[19] 成亚利,朱宝成.荧光标记金针菇原生质体融合[J].微生物学通报,1997,24(6):331-333.
[20] 周东坡,张宝国.通过灭活原生质体融合选育啤酒酵母新菌株[J].微生物学报,1999,39(5):454-460.
范文四:原生质体融合技术的应用
安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(5):1312,1326责任编辑朱卯芬责任校对左佳
原生质体融合技术的应用
朱河水,刘记强,杨国宇*,仝千秋,张代
(河南农业大学牧医工程学院,河南郑州450002)
摘要对原生质体融合技术在农业中的作用进行了综述,介绍了目前原生质体融合技术在微生物、植物遗传育种中的应用情况。关键词原生质体;融合;微生物;植物
文献标识码A文章编号0517-6611中图分类号Q813.2(2007)05-01312-01
ApplicationofProtoplastFusionTechnology
ZHUHe!shuietal(CollegeofAnimalHusbandryandVeterinary,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002)
AbstractOperationofprotoplastfusiontechnologyinagriculturewasreviewedinthispaper.Theapplicationofprotoplastfusiontechnologytoheredityandbreedinginmicrobeandplantwasalsoelaborated.KeywordsProtoplast;Fusion;Microbe;Plant
原生质体融合技术起源于20世纪60年代,是基因重组技术的一部分。它通过一定的理化条件处理,使外源目的基因进入受体细胞,并得以表达,以期使得受体细胞在原有性状的基础上,获得所需的新的特殊性状[1]。
行原生质体融合,构建了多功能工程菌,对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用,对小菜蛾的校正杀虫效率在59%以上,并具有内生定殖能力[9]。
1.3在防治动物疾病方面的应用丁伯良等在OMP分型
1原生质融合技术在微生物育种上的应用
原生质体融合技术可以在种间、属间及科之间构建出
和O抗原分型的基础上,进行鸡大肠杆菌原生质体融合研究,构建了具双亲本耐药性、0MP抗原性和0抗原性的鸡大肠杆菌异型外膜蛋白融合菌株,为研制新型鸡大肠杆菌双价菌苗奠定了基础[10]。
新型菌株,同时也是菌种改良的重要手段之一[2]。微生物原生质体融合技术包括:原生质体的制备、原生质体融合、原生质体再生[3]。
1.4
融合株
在乳业发酵剂方面的应用张莉滟等采用Mutanolysin
1.1在构建啤酒酵母原生质体融合株上的应用法分别制备双歧杆菌和保加利亚乳杆菌的原生质体。通过电场诱导双歧杆菌原生质体与热灭活的保加利亚乳杆菌原生质体融合,在双层再生培养基上筛选融合株,成功地构建出较为稳定的融合株,提高了双歧杆菌的耐性,使其在有关制剂中存活时间延长[11]。
的酵母絮凝性好,絮凝颗粒在较短时间沉淀分层,有利于与发酵液的分离,大大简化后处理工艺;发酵度高,可以发酵麦芽三糖,甚至发酵麦芽四糖,异麦芽糖,能较充分地利用麦汁中的碳水化合物[4]。原生质体融合技术还可以构建葡萄酒酒酵母,调节葡萄酒的酸度,增香,促进果胶分解,增强葡萄酒的抗氧化作用。利用电场诱导原生质体融合技术对产酒率高的菌株和产酒率低但耐高温的菌株进行融合,可得到耐高温的酵母,以解决在纤维素类物质同步发酵过程中庞小燕酵母发酵温度同纤维素酶酶解温度不一致的问题[5]。等以酒精酵母和热带假丝酵母为亲本,通过单亲灭活原生质体融合技术,获得了既具有糖化酶活性又能高产酒精的稳定的酵母融合株[6]。
王菲等以黄色短杆菌WY10和ASL495为亲本菌株,探讨了其原生质体形成和再生的条件,并在此基础上进行了原生质体融合试验,筛选出目的融合子,产酸量没有明显提高,但副产氨基酸(主要是亮氨酸)减少,因此,对工业生产中分离提纯工作和筛选高产菌具有指导意义[7]。潘延云等利用原生质体融合技术,可使碱性蛋白酶生产菌2709与枯草杆菌BD105杂交,得到1株高产碱性蛋白酶的工程菌A16。
2原生质体融合技术在植物育种中的应用
植物原生质体培养和原生质体融合不仅是植物遗传改
良的重要手段之一,而且原生质体也是研究植物细胞壁再生、细胞分裂和分化等一系列细胞遗传和生理过程的良好试验材料。应用原生质体融合技术获得体细胞杂种,可以克服其种间杂交不育的缺点,也可以将野生植物中的核控制和胞质控制的优良品质、农艺性状及抗性基因转入栽培种中。
(1988)从悬浮培养高羊茅和多年生黑麦草中获Dalton
得了再生植株[13]。(1996)在暖季型草坪草的原生质Inokkuma体培养中,以根尖顶端分生组织为外植体,建立了日本结缕草的原生质体植株再生体系[14]。金红等利用原生质体技术得到豆科牧草沙打旺+紫花苜蓿的属间体细胞杂种[15]。
胡琼等利用原生质体融合技,获得了甘蓝型油菜品种中双4号与新疆野生油菜野油18的对称性体细胞杂种[16]。在茄子育种研究中,连勇等应用原生质体融合技术,获得了茄子种间的体细胞杂种,为茄子抗病育种提供新材[17]。司家钢等用紫外线辐射处理胡萝卜雄蕊瓣化型不育材料的原生质体,与经15mmol/L碘乙酰胺预处理原生质体(受体)电融合,获得了33株再生植株[18]。虞秋成对野生优质工业用油植物Lfendleri的原生质体进行培养,同时利用其原生质体与普通栽培油菜品种原生质体融合。发现低剂量γ射线辐照处理更有利于促进原生质体融合;子叶原生质体间细胞融合频率高于下胚轴原生质体间细胞融合频率;原生质体
(下转第1326页)
A16的表型与生长特征与2709相似,相同条件下发酵酶活
性比2709菌株高50%,摇瓶发酵的产酶水平最高可达
30000u/ml。原位杂交鉴定结果表明,该菌株携有双亲的遗
传物质[8]。
1.2在防治蔬菜害虫方面的应用颜念龙等利用苏云金
芽孢杆菌和具有内生及防病等优良特性的枯草芽孢杆菌进
作者简介收稿日期
朱河水(1975-),男,河南郑州人,讲师,从事动物生理生化
研究。*通讯作者。
2006!11!20
1326
安徽农业科学2007年
3.3紫花苜蓿在四川湿热区的主要受限因素及引种可行
川西南地区频繁、连续、分布不均衡的降雨及相对
合理地施加钾、钙、锌、硼肥可提高苜蓿的耐湿性[13]。因此,根据土壤特点及紫花苜蓿的生长特点,提高施肥管理水平,也可改善苜蓿的耐湿性,增加苜蓿的产量。另外,在生产上,根据短期气象预报,进行生产措施的实施也很重要,苜蓿在刚刈割后对湿害较为敏感,抵抗湿害的能力较差,因此,在雨量集中的月份要尽量避免刈割或提高留茬高度,降低苜蓿在雨季的死亡率。参考文献
[1]董宽虎,沈益新.饲草生产学[M].北京:中国农业出版社,2003.
[2]刘明秀.12个紫花苜蓿品种在川西南湿热区的生产性能及生态适
应性初步研究[D].雅安:四川农业大学,2005.
[3]高雪松,邓良基,张世熔,等.川西丘陵地区土壤湿害问题研究[J].
中国水土保持,2003(12):26-29.李金才董琦余松烈,,.不同生育期根际土壤淹水对小麦品种光合[4]
作用和产量的影响[J].作物学报,2001,27(4):434-441.
[5]熊志强.四川亚热带丘陵山地农业气候资源及开发利用[M].成都:
四川科学技术出版社,1994.
[6]全国第1次土壤普查汇总编委会.中国土壤[M].北京:中国农业出
版社,1995.
[7]耿华珠,吴永敷,曹至中,等.中国苜蓿[M].北京:中国农业出版社,
1995.
[8]张自和.苜蓿开发前景与技术要点[C]∥中国草学会,中国畜牧协
会.第2届中国苜蓿交流大会论文集.2003:201-203.
[9]蔡燕飞,廖宗文,罗洁,等.不同质地土壤抑病性和微生物特征[J].农
业环境科学学报,2003,22(5):553-556.
[10]张福锁.植物营养生态生理学和遗传学[M].北京:中国农业出版
社,1993.
[11]李宜,杨铁民.紫花苜蓿对季节性下湿地适应性的观察[J].天津
农业科学,1991(1):18-19.
[12]CHRISTOPHERD,TEUTSCHR,SULCM,etal.Bandedphosphorus
effectonalfalfalseedlinggrowthandproductivityaftertemporary
(92):48-54.waterlogging[J].Agron,2000
安渊陈凡毅王俊等半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种耐涝性能研,,,.[13]
究[J].中国草地,2004,26(4):31-36.生产菌[J].天津科技大学学报,2004,19(1):9-16.
[8]潘延云,周艳芬,张贺迎,等.高产碱性蛋白酶工程菌的构建及鉴
定[J].哈尔滨师范大学:自然科学学报,2003,19(4):97-100.
杀虫和内生多功[9]颜念龙,邱思鑫,何红,等.原生质体融合构建防病、
能工程菌[J].农业生物技术学报,2004,12(6):704-708.
[10]丁伯良,鄢明华,王英珍,等.鸡大肠杆菌异型外膜蛋白原生质体融
合菌株的构建[J].动物科学与动物医学,2004,21(3):35-37.张莉滟张德纯双歧杆菌与乳杆菌原生质体的融合及筛选[J].生,.[11]
物技术,2003,13(4):14-15.
性分析
较黏重的土壤质地[3-6],极可能是导致苜蓿持久性降低的最主要原因。从引种角度考虑,紫花苜蓿作为多年生牧草,在川西南地区的引种成功及种植推广,首先要求其在当地的气候土壤条件下有一定的持久性,即保持一定的生长年限,且在生长年限内,生产力有一定的相对稳定性;其次,要求其单位面积的干草产量有高于或相当于当地主要豆科牧草的生产潜力。但在川西南大部分地区的气候条件下,紫花苜蓿多表现为生长年限缩短,持久性相对较差的特点,这在一定程度上失去了紫花苜蓿作为多年生牧草的优势,但从其产量来看,仍高于或相当于当地当家豆科牧草拉丁诺白三叶的产量,紫花苜蓿在当地具有推广种植的价值和潜力。因此,紫花苜蓿在南方地区的引种成功及种植推广要脱离传统思维模式,跳出多年生牧草的框子,弱化其持久性而注重其产量优势,把其作为少年生或1年生牧草加以推广应用。
3.4生产管理中注意的问题及今后深入研究的方向紫
花苜蓿不耐水淹[7-8],因此,选择质地较轻的土壤或有利于排水的坡地作为紫花苜蓿的种植地,对产草量的提高有重要意义。根瘤菌作为好气性微生物,与紫花苜蓿根系共同构成的固氮体系,对促进紫花苜蓿根系的发育有重要作用,但在土壤水分过多的情况下,根瘤菌的生存和繁衍就会受到抑制[9-11],因此加强对当地气候条件适应性较强的土著根瘤菌的筛选研究,并提高根瘤菌接种技术,对紫花苜蓿产量的提高具有很大价值。Chritopher报道,土壤中施加磷肥,虽不能有效提高苜蓿的耐涝性,但可促进幼苗生长,缩短苜蓿草地建植时间,增加苜蓿遭遇涝害后的存活机率[12]。安渊报道,(上接第1312页)
融合细胞再生植株高60~茎杆粗细、花药70cm,叶片大小、大小介于双亲之间
[19]
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
。
3结语
原生质体融合技术在微生物、植物育种中的应用越来
越广泛。随着原生质体融合技术的发展,通过对各种融合因子最佳融合条件的探索,将会出现更多具有优良性状的融合子。参考文献
[1]李华,何忠宝.基因重组酵母在葡萄酒酿造中的应用前景[J].微生物
学杂志,2005,25(3):62-64.
[2]刘勇,张德咏,谭新球,等.5种光合细菌种间原生质体融合及优良
农用融合子的筛选鉴定[J].生命科学研究,2004,8(4):344-350.[3]谭周进,杨海君,林曙,等.利用原生质体融合技术选育微生物菌种[J].
核农学报,2OO5,19(1):75-79.
[4]全丽.啤酒酵母原生质体融合株GR8的中试研究[J].酿酒科技,2005(8):69-73.
[5]孙君社,李雪,李军席.原生质体融合构建耐高温酵母菌株[J].食品
与发酵工业,2002,28(5):1-5.
[6]庞小燕,王吉瑛,赵凤生.构建直接发酵淀粉产生酒精的酵母融合菌
株的研究[J].生物工程学报,2001,17(2):165-169.
[7]王菲,张克旭,宋文军,等.应用原生质体融合技术选育L!异亮氨酸
[12]DALTONSJ.Plantregenerationfromcellsuspensionprotoplasts
ofFes!Tucaaundinacea,Loliumperenne[J].PlantPhysiology,1988(132):170-175.
[13]INOKKUMAC,SUGIURAK,CHOC,etal.Plantregenerationfrom
protoplastsofJapaneselawngrass[J].PlantCellReports,1996,15(12):737-741.
[14]金红,贾敬芬,郝建国.沙打旺与苜蓿属间体细胞杂交[J].实验生物
学报,2004,37(3):167-175.胡琼李云昌梅德圣,等.属间体细胞杂交创建甘蓝型油菜细胞质,,[15]
雄性不育系及其鉴定[J].中国农业科学,2004,37(3):333-338.[16]连勇,刘富中,冯东昕,等.应用原生质体融合技术获得茄子种间
体细胞杂种[J].园艺学报,2004,31(1):39-42.
[17]司家钢,**蔚,杜永臣,等.原生质体非对称融合获得胡萝卜种内
胞质杂种[J].园艺学报,2O02,29(2):128-132.
[18]虞秋成,严建民.L.fendleri与B.napus原生质体融合改良野生优质
工业用油植物研究[J].核农学报,2001,15(6):345-350.
范文五:真菌原生质体融合技术
大型真菌原生质体融合技术研究进展
1 发展史
由于原生质体技术的形成,去除了细胞壁的障碍,使得种内、种间甚至属间杂交成为可能。原生质体融合起源于60年代,而真菌原生质体融合的第一篇报道是以白地霉(Geotrichum candidum Link)营养缺陷型突变株为材料,采用离心方法进行原生质体融合,其融合率低于10-6。之后,人们又利用一些化学试剂,如NaNO2,Ca(NO3)2,NaCl,KCl等进行融合,效果得到改进。1976年安(Ann)等把用聚乙二醇(PEG)诱导植物原生质体融合的方法引入到真菌原生质体的融合中来,使融合率达到10-2量级。PEG诱导原生质体融合的成功,推动了真菌原生质体融合的发展。1979年匈牙利的佩斯蒂(Pesti)首先报道了融合育种提高青霉素产量,从而开创了原生质体融合在实际工作中的应用。
日本、英国、加拿大、中国等对双孢蘑菇、香菇、木耳、平菇等食用菌原生质体的分离、再生、融合做了大量卓有成效的工作。在过去的几十年中,人们已从54种食用菌中分离到原生质体;已进行了种内10种、种间19种,属间5种、目间3种的原生质体融合研究。然而PEG等化学方法诱导原生质体融合对细胞损伤大,有残留毒性。1979年森达(Senda),1980年齐默尔曼(Zimmermann)等人报道了电场诱导细胞融合的新技术,电融合技术操作简单、无化学毒性,对细胞损伤小,融合率高。以后几年里,人们把这种新的融合手段从动、植物扩展到微生物的原生质体融合研究中,导致了原生质体融合技术的新突破。1988年张闻迪等又报道了激光诱导动物细胞融合。1998年又有报道螯合剂对原生质体融合具有促进作用。
2 原生质体融合中亲本的选择标记
原生质体融合前首先必须对亲本进行遗传标记,从而有利于挑选融合子。在融合中,可采用营养缺陷型、抗药性、灭活原生质体、荧光染色、形态差异和自然生态标记等方法。
2.1 营养缺陷型标记 营养缺陷型标记是一种传统有效而直接的方法。它是通过诱变筛选进行的,菌丝、分生孢子、担孢子及原生质体都可用作诱变材料。选择的诱变材料与使用的诱变剂相适应容易获得较高的突变率,使用能直接改变DNA结构的化学诱变剂,一般选择孢子为诱变材料,若选用碱基类似物的诱变剂,宜选择已萌发的单核菌丝或经孵育的孢子进行诱变处理;而对于已萌发的孢子、菌丝和原生质体用紫外线进行诱变较好。现已从糙皮侧耳,鲑黄侧耳、桃红平菇、毛木耳、光木耳和琥珀木耳等获得了不同的营养缺陷型。营养缺陷型标记虽较费时费力,且会使亲本的优良性状丧失或降低,但它仍是育种研究工作中重要一部分,只要诱变和选择方法适当,是可选择出具有正突变的营养缺陷型的。
2.2 抗药性标记 微生物抗药性是其菌种的特性,是由遗传物质决定的,不同的微生物对某一种药物的抗性存在差异。1984年布拉德肖(Bradshaw)和佩贝迪(Peberdy)首先利用这种方法在Apergillus nidulans和A.regulosus融合中选择出了融合子。这种不通过诱变而得到的抗药性标记是选择标记的一个较好途径。且这种抗药性在遗传上也十分稳定。若无自然抗药性标记,则可以通过各种诱变手段而获得抗药性。用双亲抗药性差异选择融合子时,要掌握好药物的浓度,浓度过高会使融合频率降低,过低会使亲本生长,而影响融合子的检出。
2.3 灭活原生质 在融合中灭活1个亲株的原生质体与另一亲株的原生质体融合,被灭活的亲株可不加任何遗传标记,只需对活菌株进行标记,这样大大减少融合前亲株进行遗传标记的工作量,潘迎捷等人已对香菇属中的不同种进行灭活获得成功。其中化学灭活和热灭活效果都达100%。
2.4 荧光染色 在酶解制备原生质体时向酶液中加入荧光色素,使双亲原生质体分别带上不同的荧光色素,带上荧光色素的原生质体仍能发生融合并具再生能力。
2.5 形态标记 这是利用四极性异宗配合的食用菌进行的种内原生质体融合。采用以单核体作亲本,以融合后异核体形成锁状联合作为筛选标记,这样可省去在融合前对亲株进行标记的大量工作,潘迎捷等应用此方法构建了数百
株不同组合的香菇种内原生质体融合子,而且其中有些融合子表现出较好的生产性状。
2.6 自然生态标记 真菌的不同种、属之间及种内,由于起源的地理区域和生态环境不同,经长期的进化选择,每个种都形成了独特的对生态和生理环境的适应性且具有明显特点。这些生态指标的差异为我们进行融合提供了很好的生态标记性状。
3 原生质体的制备及再生
3.1 原生质体的制备
3.1.1 影响原生质体制备的因素 制备食用菌原生质体的材料可以是菌丝、子实体、孢子。在制备过程中,原生质体的产率常受以下几方面的影响。
3.1.1.1 菌龄 制备原生质体多采用菌丝作为材料,鲜嫩菌丝分离原生质体的产率高、活力强,易于再生,一般以3~5日或5~7日为宜。菌龄太短生成的菌丝量少,影响原生质体形成率,菌龄过大形成的原生质体小且变形多,有时只产生碎片。
3.1.1.2 酶的种类 选择适宜的酶也是原生质体制备过程中的关键,国内多选用广东微生物研究所研制的溶壁酶,有时再与其它酶合用效果更佳,菌的种类不同,所使用的酶及酶的配比也不同。
3.1.1.3 稳渗剂的种类 多采用0.4~0.6mol/L NaCl、KCl、MgSO4等无机盐类或甘露醇、蔗糖、肌醇等有机糖类作为渗透压稳定剂。
3.1.1.4 酶解作用的适宜温度 对于各种真菌来说,酶解作用的适宜温度一般高于菌丝的适宜生长温度,酶解时间一般因菌种类别而异,并与温度呈一定的反相关。此外,酶解的pH多以自然为宜。
3.1.2 原生质体分离操作 菌丝培养好后,称取一定量的菌丝加入一定量的酶液,振荡培养几小时后,原生质体游离出来,然后用尼龙布、玻璃纤维、
布氏漏斗、镜头纸等过滤,除去菌丝残渣,滤液离心使原生质体沉淀,离心后的原生质体用稳渗剂悬浮待用。
3.2 原生质体的再生 原生质体的再生现多着眼于培养基的组成及培养方式的研究。
4 原生质体融合
目前原生质体融合最成功且至今广为使用的是以PEG作为融合剂,对于所有种类的真菌而言,PEG诱导融合剂条件基本一致:(1)原生质尽可能的幼嫩,这样可提高融合率;(2)原生质体要纯;(3)最适的高渗稳定剂;(4)用于融合的两菌株原生质体的浓度一般为107,两菌株总量为1∶1;(5)PEG分子量为4000~6000,浓度为25%~40%,pH7~9在Ca2+存在下融合率可进一步提高。
4.1 融合子的检出 原生质体融合后,融合子的选择方法,是原生质体技术得以应用的关键。选择方法有营养缺陷型互补选择,抗药性标记,灭活原生质体,荧光染色,还可借助形态标记,自然生态标记等来初判异源融合子。
4.2 融合子的质量评价 融合子经上述几种方法检出后,还应该对其进一步鉴定。
4.2.1 同工酶 酶蛋白是基因表达的第一产物,而不同菌种的同工酶谱一般不同。因此,异源融合子的基因重组也应在同工酶上有所反映。将融合子的同工酶与亲本相比较,可为鉴定融合子提供有力证据。
4.2.2 生长拮抗试验 其原理是基于不同菌种的菌丝在生长中相遇时表现出拮抗反应,异源融合子因异源基因相混合而获得新的遗传特性,因此会表现出对亲株的拮抗作用。肖在勤曾将侧五平菇抗性菌株和凤尾菇抗性菌株的融合菌株与两亲本菌株进行拮抗实验,结果3个菌株都与双亲有遗传特性差异。
4.2.3 出菇 融合子再生出来后,应将全部融合子进行出菇实验,从子实体的形态、色泽等特征上进行筛选。李育岳等人已从木耳原生质体融合的8个融合株中的2个遗传特性稳定,具有黑木耳商品性状,表现有明显的杂交优势
的新种进行了生物学特性及出菇实验,两新种均表现出明显的杂交优势。宋士良等人也将原生质体融合株,经初筛选得到几株性状表现良好的菌株与亲本进行出菇比较实验,其中有一融合株不出菇,有两融合株优于亲本,有希望用于生产。